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Nuevos perfiles geneticos de Salmonella Enteritidis identificados en Lujan, Argentina.

New Genetic Profiles of Salmonella Enteritidis identified in Lujan, Argentina

INTRODUCCION

La infeccion debida a serovariedades no tificas de Salmonella spp. representa un problema de salud publica a nivel mundial, que se ha agudizado con la apertura economica y la globalizacion, debido a que el consumo de carne de pollo, huevos y subproductos se ha incrementado en todo el mundo, existe sustancialmente un mayor riesgo de infeccion. "Se ha demostrado en la literatura (Betancor et al., 2010; Braden, 2006) que casi todas las canales de aves pueden estar infectadas; el numero de microorganismos puede ser bajo en un principio y aumentar como resultado del manejo. Los huevos se pueden contaminar por transmision vertical (transovarica), durante la postura o durante la manipulacion o el almacenamiento. La infeccion en los seres humanos se adquiere por consumo de pollo, huevo crudo o parcialmente cocido, o alimentos preparados con estos".

"Un dramatico incremento de la salmonelosis en humanos producida especificamente por Salmonella Enteritidis, ocurrio a finales de la decada de 1980 y principios de la decada de 1990. En 1995 del total de informes recopilados por los sistemas de vigilancia de los paises miembros de la Organizacion Mundial de la Salud se encontro que 76.1% de los aislamientos correspondieron a la Salmonella serovariedad Enteritidis, Typhimurium, y Typhi. S. Enteritidis fue mas frecuente en 35 paises seguido por S. Typhi (12 paises) y S. Typhimurium (8 paises). Las principales serovariedades aisladas globalmente para 1995 incluyeron Enteritidis, Typhimurium, Hadar, Infantis, Newport, Typhi, Agona, Virchow y Heidelberg. Los aislamientos de S. Enteritidis se aumentaron de 25.6% en 1990 a 36.5% para el ano de 1995" (Herikstad et al., 2002).

En la Argentina, segun el Boletin Epidemiologico Periodico (2006) "las 5 serovariedades prevalentes, en el periodo 2004-2005 fueron: S. Enteritidis (36.0%), S. Typhimurium (20.5%), S. Infantis (8.7%), S. Newport (5.3%) y S. Aguna (4.9%); siguiendo la misma tendencia que en los anos 2002-2003, donde S. Enteritidis (30,3 %) ocupo tambien el primer lugar, seguida por S. Typhimurium (12.8%) y S. Infantis (11.5 %), mientras que se invirtio el orden de frecuencia con respecto a S. Aguna (11.3%) y S. Newport (6.5%). Entre todos los aislamientos analizados, se identificaron 43 serovariedades, entre las cuales S. Enteritidis (36.0%) fue la mas ampliamente distribuida y se encontro con mayor frecuencia en la mayoria de las jurisdicciones. S. Typhimurium (20.5%) ocupo el primer lugar en Cordoba, fue la segunda serovariedad en Buenos Aires, Ciudad Autonoma de Buenos Aires, Mendoza, Rio Negro y Santa Fe y se encontro tambien, en menor frecuencia en otras provincias. Tanto S. Newport como S. Aguna estuvieron distribuidas en el pais, en 12 y 11 jurisdicciones respectivamente".

Las cepas pertenecientes a un mismo serotipo de Salmonella, pueden diferenciarse en funcion de sus patrones de sensibilidad, frente a un grupo seleccionado de bacteriofagos. El fagotipo o lisotipo es de gran valor en el estudio epidemiologico de Salmonella, ya que existe un alto porcentaje de correlacion entre fagotipo y origen epidemico. "Aunque algunos de los recursos serologicos pueden utilizarse para distinguir cepas de serotipos como Typhimurium, las diferencias se evaluaran con mayor precision mediante el fagotipado, permitiendo ampliar la informacion necesaria para establecer posibles relaciones epidemiologicas" (Rabsch et. al., 2002).

"Se ha demostrado en la literatura (Nygard et. al., 2004) que ochenta y seis porciento (10.049) de los aislamientos de S. Enteritidis desde 1997 al 2001 fueron fagotipados, aumentando desde 75% en 1997 al 95% en 2001. Los tipos fagos mas comunes en este periodo fueron PT4 y PT1, considerando el 35% y 16% de todos los casos, respectivamente. En los viajeros que vuelven de la mayoria de los paises de Europa Occidental, PT4 era el tipo de fago dominante. En Europa Oriental, PT1 era el dominante, y este tipo de fago tambien era comun entre viajeros que vuelven de la Peninsula iberica. PT8 parecia ser mas comun entre los viajeros que vuelven de los paises europeos centrales".

La tipificacion fagica de aislados nacionales de S. Enteritidis es de interes debido a que esta tecnica de marcacion ha estado restringida a unos pocos paises, en su mayor parte desarrollados. Ello ha impedido conocer cuales poblaciones bacterianas estan involucradas en las nuevas zonas afectadas. Mas aun, esta tecnica de marcacion podria indicar si solo unos pocos fagotipos estan asociados con la actual epidemia o si, como se sospecha, varios tipos podrian estar circulando a partir de diferentes fuentes infectantes. Ademas, "la comparacion de aislados clinicos, alimentarios y avicolas podria mostrar la relacion epidemiologica de estos. Por ultimo, la comparacion de los fagotipos que actualmente circulan con los que se han observado en epocas anteriores podria indicar el posible origen local de la epidemia o su importacion del exterior" (Prat et. al., 2001).

El objetivo del presente trabajo fue fagotipificar cepas de Salmonella Enteritidis de distintos origenes con bacteriofagos salvajes obtenidos de aguas del rio Lujan; establecer grupos de especificidad entre ambos y caracterizar geneticamente por electroforesis en campo pulsado cepas de S. Enteritidis representantes de cada grupo de especificidad.

La eleccion de la tecnica de electroforesis en campo pulsado (PFGE: Pulsed Field Gel Electrophoresis) para estudiar los perfiles geneticos de las cepas de Salmonella Enteritidis a analizar surgio debido a que es el "metodo habitualmente utilizado por la Red PulseNet de Latinoamerica, Caribe y Europa; a fin de lograr resultados comparables entre si" (Peters et al., 2007).

"El sistema utiliza 3 sets de electrodos distribuidos hexagonalmente alrededor del gel, que aplican corriente primero desde uno de los sets de electrodos, luego desde el segundo en un corto periodo de tiempo (pulso) y luego desde el tercero. Esto causa que el DNA se mueva en el gel hacia adelante y hacia atras consecutivamente, aumentando el poder de resolucion de la electroforesis y permitiendo asi separar fragmentos de mas de 1000 Kb. El genoma bacteriano, que contiene entre 2000 y 5000 Kb, es clivado con enzimas de restriccion de bajo numero de sitios de corte, generando entre 10 y 30 fragmentos de 10 a 800 Kb que se resuelven en un gel de agarosa sometido a campo pulsado" (Pang et al., 2005).

MATERIALES Y METODOS

De enero a diciembre de 2008 se tomaron un total de 120 muestras de agua, a razon de 10 mensuales. Las mismas se obtuvieron segun la tecnica del hisopo de Moore con 60 minutos de exposicion al curso de agua (Anselmo et. al., 1999). Fueron cultivadas dentro de las 2 h del momento de su extraccion.

Cuatro puntos de los margenes del rio Lujan, provincia de Buenos Aires, Argentina, confinados en los de mayor poblacion urbana fueron los sitios de muestreo elegidos. Surgieron de la evaluacion estadistica de los resultados obtenidos durante investigaciones anteriores realizadas en el rio Lujan durante los anos 1987 a 1993 donde se obtuvo mayor positividad de muestras asi como mayor cantidad de serovariedades detectadas / muestra.

Se seleccionaron un total de 86 cepas de Salmonella Enteritidis que procedieron de la coleccion de cepas de Salmonella existentes en el Laboratorio de Microbiologia de la Universidad Nacional de Lujan conservadas en caldo nutritivo con 7 g/L de agar-agar a temperatura ambiente. Las mismas han sido aisladas en trabajos anteriores desde 1987 a 2010 e identificadas bioquimica y antigenicamente en su oportunidad.

El conjunto de cepas se hallaba integrado por 23 recuperadas de aguas del rio Lujan durante el periodo comprendido de 1987 a 1990, de investigaciones anteriores (Anselmo et al., 1999); 58 de brotes alimentarios (Anselmo et al., 1990; 1991a; 1991b; 1993; Viora et al., 1994) y 5 procedentes de casos esporadicos ocurridos en la ciudad de Lujan en 2009 y 2010.

Para el enriquecimiento de bacteriofagos salvajes se seleccionaron las 23 cepas obtenidas del rio Lujan y 13 representativas de las restantes, un pool de 3 mensuales. A cada uno de los 10 hisopos de Moore se les adiciono 100 mL de Phage Assay Broth (PAB) (Kott, 1966) y 1 mL de cultivo en PAB de cada una de las tres S. Enteritidis de 24 h a 35[grados]C y se incubo durante 15 horas a 35[grados]C (McLaughlin y Brook, 2008).

Para la descontaminacion se trasvasaron 10 mL del cultivo a un tubo de 15 x 150 mm con tapa a rosca y se anadieron 5 mL de cloroformo. Se agito energicamente 60 segundos y se conservaron a 4[grados]C.

Para confirmar la presencia de bacteriofagos, se aplico la prueba de la gota (Spot test) del cultivo enriquecido de bacteriofago. Se incubo durante 4 a 15 horas a 35[grados]C efectuando lecturas a intervalos frecuentes (McLaughlin y Brook, 2008). La presencia del bacteriofago se visualizo en la aparicion de calvas o placas de lisis.

El aislamiento y purificacion de los bacteriofagos se realizo mediante la tecnica de doble capa de agar en tres pases sucesivos a fin de tener la certeza que cada placa de lisis se debe a la accion de un solo bacteriofago (Ward et al., 1987).

De la totalidad de bacteriofagos obtenidos se llego a un numero reducido que cumpliera los criterios de seleccion basados en estabilidad litica, reproducibilidad, conservacion del Rutine Test Dilution, diferencias en la lectura, tipabilidad y poder discriminatorio.

La tipificacion fagica se llevo a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito por la doctora L. R. Ward del Centro Colaborador de la OMS de Referencia e Investigacion de Salmonella en Londres. Esta metodologia se ha estandarizado y su descripcion se ha publicado previamente (Ward et al., 1987).

Entre las cepas de S. Enteritidis y los fagos hallados surgieron grupos de especificidad y; una cepa de S. Enteritidis representativa de cada grupo fue caracterizada geneticamente utilizando la tecnica de electroforesis en campo pulsado en el Servicio Enterobacterias del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas "Dr. Carlos G. Malbran"; donde ademas se compararon sus perfiles geneticos con la base de datos de la Republica Argentina y de otros paises latinoamericanos.

RESULTADOS

De las 120 muestras de agua, 60 (50%) dieron resultado positivo, aislandose 600 bacteriofagos con morfologia diferente.

Estos bacteriofagos obtenidos se sometieron a los criterios de seleccion ya mencionados, llegandose a un juego de 24 bacteriofagos identificados con numeros romanos del I al XXIV. Estos se utilizaron para fagotipificar las 86 cepas de S. Enteritidis. Se considero un resultado positivo cuando presentaban alguno de los tipos de lisis siguientes es decir semiconfluente, confluente, menor que semiconfluente, menor que confluente y lisis opaca.

En la tabla 1 se muestran los grupos de especificidad surgidos despues de la evaluacion de los resultados de la fagotipia de Salmonella Enteritidis al enfrentarlas con el juego de bacteriofagos y las caracteristicas morfologicas de las placas de lisis observadas.

De los resultados de la fagotipificacion surgieron cuatro grupos de especificidad identificados 1; 2; 3 y 4 como puede apreciarse en la tabla 1.

El grupo de especificidad 1 constituido por 81 cepas provenientes del rio y de los 5 brotes investigados, dieron resultado negativo los fagos XV; XXI; XXII; XXIII y XXIV.

El grupo de especificidad 2 abarca dos cepas aisladas de una misma muestra de agua, difiere del grupo de especificidad 1 en que ambas cepas dieron ademas resultado positivo el fago XV.

El grupo de especificidad 3 constituido por una sola cepa aislada del rio, dio negativo solamente los fagos XXII y XXIV. Cabe destacar que dicha cepa fue utilizada como huesped original para detectar el fago XV a partir de aguas del rio Lujan.

El grupo de especificidad 4 integrado por dos aislamientos de pollo cocido involucrados en un brote de origen alimentario, acontecido en un comedor escolar de la ciudad de Lujan, provincia de Buenos Aires, con unas cuarenta personas afectadas, en marzo de 1990 (Anselmo et al., 1990). Ambas cepas habian sido aisladas de una presa de pollo cocido que provenia de un servicio de viandas sito en la Ciudad Autonoma de Buenos Aires. Dieron resultado positivo solamente en los fagos II; XV; XXI; XXII; XXIII y XXIV. Cabe destacar que los ultimos cuatro fagos mencionados fueron aislados utilizando como hospederos originales estas dos cepas de S. Enteritidis, no asi los fagos II y XV.

Cuatro cepas de S. Enteritidis, dos aisladas de aguas del rio Lujan, una de un alimento cocido y la restante de un enfermo de un brote, se caracterizaron geneticamente. Como puede apreciarse en la figura 1, los patrones de bandas obtenidas al digerir el ADN total con una enzima Xbal se compararon con los de aislamientos correspondientes a casos esporadicos y de brotes del pais, disponibles en la Base Nacional de Datos. Las cepas que correspondieron al patron de PFGE identificado ARJEGX01.0001 pertenecian al subtipo predominante (70,5 %) de S. Enteritidis en todo el pais, que ha sido asociado a brotes de enfermedad transmitida por alimentos en diferentes provincias. Las cepas que correspondieron a los patrones identificados ARJEGX01.0033 y ARJEGX01.0034 respectivamente, no se encontraban presentes en la Base Nacional de Subtipificacion molecular, que cuenta con 31 patrones de Xbal-PFGE, correspondientes a 288 aislamientos como asi tampoco en la base latinoamericana.

[FIGURA 1 OMITIR]

DISCUSION

Betancor el al. (2009) "investigaron mediante electroforesis en campo pulsado la divergencia genomica y el potencial patogenico en aislamientos de Salmonella Enteritidis antes, durante y despues de una epidemia acontecida en Urugualy. De 266 cepas analizadas el 96% correspondio tambien como en nuestro caso, al fagotipo PT4 y el 4% restante presentaron perfiles geneticos que tampoco se hallaban registrados en la base de datos de Latinoamerica y, estos investigadores concluyeron que los fagos juegan un rol crucial en la generacion de la diversidad genetica en Salmonella Enteritidis".

"Se ha demostrado en la literatura (Pang et al., 2005) que de un total de 187 aislamientos de S. Enteritidis estudiados, mas del 80% presentaba similaridad genetica por electroforesis en campo pulsado y el fagotipo predominante era PT4 y, concluyeron que las variantes serian derivadas de una linea clonal unica pero su genoma se hallaria altamente conservado en el periodo de relevamiento de cepas de 13 anos (1990 - 2002)".

Cabe destacar que la fagotipificacion de las 86 cepas de nuestro trabajo permitio distinguir 3 cepas "raras" (3,5%) de las prevalecientes sin necesidad de efectuar la subtipificacion molecular a la totalidad de cepas investigadas sino a representantes de cada grupo de especificidad.

Luego de fagotipificar 86 cepas de Salmonella Enteritidis provenientes de brotes y de muestras ambientales, como resultado se obtuvieron 4 grupos de especificidad diferentes: dos practicamente iguales y los dos restantes correspondieron, respectivamente, a una cepa procedente de agua de rio y a dos cepas provenientes de una muestra de pollo cocido incriminado en un brote de origen alimentario.

Al realizarles la tipificacion molecular por electroforesis en campo pulsado se determino que 83 cepas pertenecian al fagotipo 4, como era de esperar, en la ciudad de Lujan y zonas aledanas predomina Salmonella Enteritidis PT4. "A nivel mundial este fagotipo ocupa el 35%, mientras que en Argentina constituye el 70,5% que ha sido asociado a brotes de origen alimentario" (Boletin Epidemiologico Periodico (2006)).

En cambio una cepa proveniente de aguas del rio Lujan que se clasifico como grupo de especificidad 3 y dos cepas procedentes de la muestra de pollo cocido del brote alimentario que se clasifico como grupo de especificidad 4 presentaban dos perfiles geneticos que no se hallaban hasta el presente registrados en la base de datos de Subtipificacion Molecular Latinoamericana.

CONCLUSIONES

El juego de 24 bacteriofagos salvajes obtenido a traves de este trabajo permitio fagotipificar el 100% de las cepas de Salmonella Enteritidis estudiadas; localizar las 83 cepas que correspondieron al fagotipo PT4 y concordaron con las prevalecientes en Latinoamerica y; detectar las 3 cepas "raras" es decir no halladas en Latinoamerica segun los resultados obtenidos mediante los fagos XV; XXI; XXII; XXIII y XXIV y; confirmado por electroforesis en campo pulsado.

Asimismo dicho juego de bacteriofagos permitiria saber en menos de 24 horas si Salmonella spp. determinada de distintas fuentes (enfermos esporadicos, brotes alimentarios, muestras de alimentos, ambientales, etc.,) si se trata de la serovariedad Enteritidis.

doi: 10.4067/S0718-07642012000300011

AGRADECIMIENTOS

A las Dras. M. Pichel y M. I. Caffer del INEI-ANLIS "Dr. C. G. Malbran" A. Velez Sarsfield 563 (1281) Ciudad Autonoma de Buenos Aires, Argentina, por su colaboracion en la tipificacion molecular de las cepas. A la Universidad Nacional de Lujan y al Departamento de Ciencias Basicas por el apoyo recibido para la ejecucion del proyecto.

REFERENCIAS

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Ricardo J. Anselmo * y Hebe A. Barrios

Univ. Nacional de Lujan, Depto. de Ciencias Basicas, Casilla 221, (6700) Lujan, Buenos Aires-Argentina (e-mail: anselmoricardoj@msn.com)

* autor a quien debe ser dirigida la correspondencia

Recibido Sep. 12, 2011; Aceptado Nov. 08, 2011; Version final recibida Ene. 10, 2012
Tabla 1: Constitucion de los grupos de especificidad

Fagos                  Grupo 1   Grupo 2   Grupo 3   Grupo 4   Total

I                        ol        ol        ol        --       84
II                       cl        ol        ol        Cl       86
III                      ol        ol        ol        --       84
IV                       ol        ol        ol        --       84
V                        ol        ol        ol        --       84
VI                       ol        ol        ol        --       84
VII                      ol        ol        ol        --       84
VIII                     cl        cl        cl        --       84
IX                       ol        ol        ol        --       84
X                        ol        ol        ol        --       84
XI                       ol        ol        ol        --       84
XII                     <scl      <scl      <scl       --       84
XIII                     ol        ol        ol        --       84
XIV                      ol        ol        scl       --       84
XV                       --        scl       scl       Cl        5
XVI                     <scl      <scl      <scl       --       84
XVII                    <scl      <scl      <scl       --       84
XVIII                   <scl       scl      <scl       --       84
XIX                      scl       scl       ol        --       84
XX                       scl       ol        ol        --       84
XXI                      --        --        ol        Ol        3
XXII                     --        --        --        Cl        2
XXIII                    --        --        ol        Ol        3
XXIV                     --        --        --        Cl        2
No. de cepas patrones    81         2         1         2       86

Tipo de lisis: lisis semiconfluente "scl"; lisis
confluente "cl"; Lisis menor que semicon-fluente
"<scl"; lisis menor que confluente
<cl; lisis opaca "ol".
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Author:Anselmo, Ricardo J.; Barrios, Hebe A.
Publication:Informacion Tecnologica
Date:Jun 1, 2012
Words:3664
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