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Nuevos genotipos de arroz resistentes a la piriculariosis obtenidos por cultivo de anteras.

New blast resistant rice genotypes obtained by and anthers culture

Introduccion

El arroz (Oryza sativa L.) es uno de los cereales de mayor produccion a nivel mundial, ocupa el segundo lugar en superficie cosechada, pero desde el punto de vista alimenticio una mayor cantidad de poblacion depende de el (Tan et al., 2001 y Alvarez et al., 2008). En Cuba, constituye unas de las principales fuentes de carbohidratos en la alimentacion de la poblacion pero la produccion nacional no satisface esas necesidades (Madruga 2004) debido a la obtencion de muy bajos rendimientos motivado por diferentes causas, entre las que se encuentra un extenso grupo de agentes infecciosos que causan enfermedades (Cordero y Rivero 2001).

El hongo Magnaporthe grisea Barr (Pyricularia grisea Sacc) produce la mas devastadora enfermedad del arroz a nivel mundial, debido a su amplia distribucion y las graves perdidas economicas que ocasiona (Castejon-Munoz 2008), constituyendo el desarrollo de variedades resistentes la via mas economica para su control y con menor impacto ambiental (Zambrano et al., 2006).

Por su parte, en todo programa de mejora para resistencia a enfermedades, se necesita conocer la fuente de resistencia genetica, establecer las condiciones idoneas de infeccion del patogeno, con el fin de garantizar una efectiva seleccion y escoger el metodo adecuado. Dentro de ellos, el cultivo in vitro de anteras de plantas F2 presenta numerosas ventajas, ya que la poblacion proveniente de esta combinacion de metodos de mejora (hibridaciones y cultivo in vitro), representa la variabilidad genetica de la poblacion F2 y las plantas obtenidas in vitro son geneticamente homocigoticas. Esto reduce el tiempo para la obtencion de los nuevos cultivares, ahorra recursos financieros y materiales y se aumenta la eficiencia de la seleccion, facilitando la identificacion de individuos superiores (Perez-Almeida 2004; Jiang et al., 2004; Ramakrishnan et al., 2005; Chen et al., 2006).

Teniendo en cuenta estos antecedentes y conociendo que en Cuba las variedades comerciales de arroz son de tipo indica, conocidas por ser mas recalcitrantes al cultivo de tejidos (Saharan et al., 2004) se llevo a cabo este trabajo cuyo objetivo fue obtener genotipos de arroz tolerantes a la Piriculariosis con la utilizacion del cultivo in vitro de anteras de plantas F2, procedentes de cruces en los que intervienen variedades con cierto grado de resistencia al hongo, asi como la evaluacion de 3 medios de cultivo para mejorar la eficiencia en el proceso de mejoramiento.

Materiales y metodos

En la Estacion Experimental del Arroz, ubicada en Los Palacios y perteneciente al Instituto Nacional de Ciencias Agricolas, se realizaron cruzamientos entre cultivares resistentes a la Piriculariosis y cultivares de buen comportamiento agricola (tabla 1) y cada cultivar de buen comportamiento agricola fue empleado como parental materno y paterno, con los cultivares resistentes, para posteriormente utilizar la progenie en el cultivo in vitro de anteras.

Cultivo in vitro de anteras de plantas [F.sub.2]

En el laboratorio de cultivo de tejidos, de las mejores plantas F2 por cada cruce, teniendo en cuenta el vigor y su estado fitosanitario, entre los 60-70 dias de edad, se seleccionaron de dos a tres paniculas, que poseian una distancia de 4-8 cm entre las auriculas de las dos ultimas hojas, a las que se les conservo el entrenudo y la vaina de la hoja para protegerlas de la contaminacion con patogenos del campo. Posteriormente fueron desinfectadas y sembradas in vitro, segun la metodologia propuesta por Lentini et al. (1995).

Se utilizaron 3 medios liquidos (tabla 2) para la induccion de callos a partir del polen inmaduro: N6-1, (MeiFang 1992) y [N.sub.6-m] y NL (Lentini et al., 1995) y de 3 a 10 frascos por replica, dependiendo de la disponibilidad de anteras y 3 replicas por cada medio. Despues de la siembra, los frascos se mantuvieron en ausencia de luz de 30 a 60 dias, hasta la formacion de los micro callos. Se evaluo la cantidad de anteras que formaron callos.

Los callos de 1-2 mm de diametro (10 callos por frasco, replicados hasta 10 veces, dependiendo de su disponibilidad) fueron transferidos a un medio MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 1mg x [L.sup.-1] de ANA, 2 mg x [L.sup.-1] de AIA, 4mg x [L.sup.-1] de Kinetina, 30 g x [L.sup.-1] de sacarosa y solidificado con 7g x [L.sup.-1] de Phytagel. Los frascos fueron incubados a 26 [+ o -] 2[grados]C con un fotoperiodo de 16 horas luz y entre los 30 y 40 dias se evaluo la regeneracion de plantas verdes y albinas.

El diseno estadistico empleado fue un bloque completamente aleatorio, los datos obtenidos fueron procesados mediante analisis de varianza simple y las medias comparadas con la prueba de Duncan al 5%, ademas fueron procesados mediante analisis de componentes principales. Para el procesamiento automatizado de los datos se utilizo el paquete estadistico SPSS version 11.0 sobre Windows.

Evaluacion de los regenerantes obtenidos

Cuando las plantas alcanzaron suficiente desarrollo foliar y radical, se retiraron del frasco y se sumergieron en agua por varios dias, luego se trasplantaron a bandejas, donde permanecieron a temperatura ambiente y protegidas del sol, despues de 15 dias se pasaron a la luz directa y a las 3 semanas se trasplantaron al campo, donde recibieron el manejo apropiado del cultivo, segun los instructivos tecnicos (MINAG 2005).

En el momento de la cosecha, las plantas fueron evaluadas morfologicamente para asociarlas de manera visual con su nivel de ploidia. Posteriormente, a 142 lineas isogenicas fertiles obtenidas (supuestamente diploides), provenientes de 14 cruces (tabla 3), se les evaluo la altura final, el numero de paniculas por planta, la longitud de la panicula, el numero de granos llenos por panicula, el peso de 1000 granos y el largo y ancho del grano y los datos obtenidos fueron procesados mediante analisis de componentes principales, ademas se determinaron valores maximo y minimo, la media, error estandar y coeficiente de variacion. Para el procesamiento automatizado de los datos se utilizo el paquete estadistico SPSS version 11.0 sobre windows.

Evaluacion de la segunda generacion

Las semillas obtenidas, de las plantas cosechadas de la primera generacion de lineas isogenicas, fueron sembradas en campo a chorrillo en surcos de 5 m de largo, para realizar las pruebas de uniformidad. A cada linea isogenica (surco) se le evaluo el ciclo y en 1m lineal, el rendimiento agricola y el numero de paniculas. La altura final fue medida a 20 plantas y, en 20 paniculas tomadas al azar, se contaron los granos llenos por panicula, el peso de 1000 granos, la longitud de la panicula, el largo y ancho del grano. Los datos obtenidos fueron sometidos a analisis multivariado de clasificacion automatica (Cluster) (Varela 1998). Para el procesamiento automatizado de los datos se utilizo el paquete estadistico SPSS version 11.0 sobre windows.

Las evaluaciones frente a la Piriculariosis se realizaron bajo infeccion natural en campo, en las hojas, en la fase vegetativa y en el cuello de la panicula, en la fase reproductiva, de acuerdo con las escalas propuestas por el IRRI (2002).

Evaluacion de las mejores lineas obtenidas frente a la incidencia de la Piriculariosis en canteros de infeccion

En la Granja Caribe, perteneciente al CAI Arrocero "Los Palacios", se sembraron en el mes de marzo, durante cuatro anos, sobre un suelo Gley Nodular Ferralitico Concrecionario (Hernandez et al., 1999), las mejores lineas obtenidas por cultivo de anteras (aquellas que combinaron alto rendimiento agricola y resistencia a la Piriculariosis), los cultivares resistentes: Moroberekan, Tetep, IR 759-54-2-2 y 2077 y el cultivar susceptible J-104. Se utilizo la metodologia de campo propuesta por el Centro Internacional de Agricultura Tropical y validada en Cuba por Cardenas et al., (2000), la cual propone realizar los ensayos de seleccion para la resistencia a la enfermedad en un sitio "hot spot", que presente una alta incidencia de la enfermedad, favorecida por condiciones ambientales y una alta diversidad del patogeno P. grisea.

Se estimo el porcentaje de area foliar afectada (% AFA) por la Piriculariosis en 10 plantas por linea, durante la fase vegetativa, entre 25 y 35 dias despues de la germinacion y, en la fase reproductiva, se evaluaron los porcentajes de cuellos danados y se determino la resistencia de las variedades de acuerdo con las escalas propuesta por el IRRI (2002). Los datos fueron procesados mediante analisis de varianza de clasificacion simple y las medias se docimaron segun la prueba de rangos multiples de Duncan al 5% de probabilidad de error.

Resultados y discusion

Cultivo in vitro de anteras de plantas F2

Con la utilizacion de la tecnica del cultivo de anteras se observo una respuesta diferenciada para los diferentes cruces empleados, ya que no todos los hibridos fueron capaces de formar callos y los que tuvieron exito, no lo hicieron en igual magnitud. La frecuencia de anteras que formaron callos, como se aprecia en la tabla 4, oscilo entre 0 y 55.3 %, dependiendo del genotipo y el medio de cultivo.

El valor maximo fue alcanzado por Amistad'82/2077 en el medio NL (55.3 callos por 100 anteras sembradas), seguido de este mismo cruce en el medio N6m (44,6) y el cruce Amistad'82/IR 759-54-2-2 tambien en el medio NL (43,2).

Es interesante senalar que en estos cruces aparece Amistad'82 y coincide ademas que participa como progenitor femenino, sin embargo en otros cruces donde interviene esta variedad se apreciaron valores muy inferiores (entre 0 y 6,6%) y su participacion es indistinta como madre o padre.

Al respecto muchos autores han encontrado que tanto el medio de cultivo como el genotipo, son factores de gran importancia para la obtencion de diploides a traves del cultivo in vitro de anteras (Grewal, Gill y Gosal, 2006, Niroula y Bimb, 2009, Khatun, Islam y Bari, 2010 y Gueye y Ndoye, 2010).

Con la utilizacion del medio NL se lograron los valores mas altos para la formacion de callos. Los tres medios evaluados difieren en la concentracion de sales (macro y microelementos) vitaminas y reguladores del crecimiento, razon por la que se hace dificil atribuir una mejor respuesta al efecto de componentes individuales que posee este medio en particular, no obstante es el unico de ellos en el que fue sustituida la sacarosa por maltosa y ademas se emplea nitrato de plata.

En este sentido Lentini et al. (1997) mostraron que al reemplazar la sacarosa por maltosa se obtienen incrementos significativos en la induccion de callos de genotipos indica recalcitrantes y como hecho mas notable, la produccion de plantas verdes de estos callos se incrementa significativamente.

Otros autores recomiendan tambien el empleo de maltosa en sustitucion de sacarosa para el medio de induccion de callos, sobre todo para la especie indica (Bishnoi et al., 2000 y Chen y Qin, 2008). Por otro lado, la utilizacion del nitrato de plata en el medio de induccion reduce notablemente la senescencia de las anteras de arroz de tipo indica recalcitrantes, este resultado indica que el etileno acumulado en el envase pudiera estar inhibiendo la formacion de callos, efecto que probablemente es revertido con la aplicacion de este compuesto (Bishnoi et al., 2000; Bhojwani et al., 2002 y Lentini et al., 1997).

Otro aspecto de interes fue la diferencia en cuanto al tipo de plantas regeneradas (verdes o albinas); INCA LP1/IR 759-54-2-2, solamente formo plantas albinas (0,3 plantas por 100 anteras sembradas) y los cruces IR 759-54-2-2/Amistad'82, 6066/IR 759-54-2-2, Mo roberekan/6066 y IR 1529-430/IR 759-54-2-2, solo formaron plantas verdes (0.3; 7.6; 0.7 y 5.2; respectivamente, por 100 anteras sembradas).

En este sentido los resultados que se obtienen por diversos autores son muy variables, por ejemplo Sharmin et al. (2004) obtuvieron entre 57 y 75 plantas verdes por 100 callos y solo de 1 a 8 callos por 100 anteras, Asaduzzaman et al. (2003) obtuvieron regeneracion de plantas verdes entre 15 y 30 dias despues del cultivo y los valores mas altos obtenidos fueron 33,3 % y Tran y Voung (2004) solo obtienen entre 3 y 9 callos por 100 anteras y de 1 a 6 plantas por 100 callos.

La produccion de plantas albinas, carentes de clorofila, es un fenomeno comun en el cultivo de anteras de arroz, predominante en plantas derivadas de hibridos interespecificos o hibridos intraespecifico entre las subespecies japonicas e indica con una frecuencia entre 10 y 100 % (Sangwan 2004).

Diversos estudios sugieren que la formacion de plantas albinas es debida a alteraciones de los plastidios durante la microsporogenesis in vivo y que el albinismo esta relacionado con el deterioro del ADN de los cloroplastos. Otros han encontrado deleciones y moleculas completas en el ADN de los plastidios sugiriendo que tal heterogeneidad pudiera ser la causa del albinismo (Yamagishi 2002). Por su parte Ankele et al. (2005) sugieren que la formacion de la planta albina es un fenomeno complejo en el cual estan envueltos los plastidios y factores nucleares o sus interacciones defectivas.

Para analizar de manera conjunta la formacion de callos y regeneracion de plantas verdes y albinas logradas y de esta forma determinar el mejor cruce, se efectuo, con toda la informacion obtenida, un analisis de componentes principales (tabla 5), el cual explico el 93% de la variacion total en las dos primeras componentes. Los caracteres formacion de callos en los tres medios evaluados (N6-1, N6m y NL), asi como la regeneracion de plantas verdes tuvieron una fuerte contribucion a la formacion de la primera componente, mientras que la regeneracion de plantas albinas contribuyo con un valor mas alto a la segunda componente.

La representacion grafica de los cultivares, tomando en consideracion estas dos componentes (figura 1), presenta a los cruces 1, 2 y 3 (Amistad'82/2077, 2077/Amistadv'82 y Amistad'82/IR 759-54-2-2), ubicados en el cuadrante inferior derecho con la mejor respuesta a la utilizacion de la tecnica de cultivo in vitro, ya que combinaron mayor formacion de callos en los 3 medios (14.6-55.3 callos por cada 100 anteras sembradas) con mayor regeneracion de plantas verdes (12.7-22.6 plantas verdes por cada 100 anteras sembradas) (figura 2) y menos plantas albinas por cada 100 anteras sembradas.

Javed et al. (2007) y Silva y Ratnayake (2009) encontraron que variedades con una alta habilidad para formar callos tambien mostraron las mejores frecuencias de regeneracion de plantas. Por otro lado Talebi et al., 2007; encontraron casos en los que a pesar de presentar una gran habilidad para formar callos la regeneracion fue pobre, lo cual estos autores atribuyen al medio empleado para la induccion de callos que puede influir en su capacidad posterior para regenerar plantas.

El genotipo, como es conocido, posee tambien un efecto significativo sobre la regeneracion de plantas verdes, aun cuando es posible producir un alto numero de dobles haploides de muchas variedades e hibridos de arroz de tipo japonica, la regeneracion de plantas verdes de la mayoria de las variedades tipo indica es baja (Perez-Almeida 2004). Jain Maluszynski (2004) plantearon que para obtener una buena respuesta del cultivo de anteras es necesario trabajar con cruzamientos donde uno de los progenitores sea del tipo japonica, mientras que otros autores proponen, como una via para mejorar la eficiencia del cultivo in vitro de anteras, la utilizacion de diferentes medios teniendo en cuenta el tipo de arroz (indica o japonica) (MeiFang 1992; Bishnoi et al., 2000; Bhojwani et al., 2002; Tran y Voung 2004 y Chen y Qin 2008).

De los tres medios evaluados para la formacion de callos a partir de anteras de plantas F2, los mejores resultados fueron obtenidos con el medio NL y tres cruces: Amistad'82/2077, Amistad/IR 759-54-2-2 y Amistad'82/2077, aportaron la mayor formacion de callos y posterior generacion de plantas verdes.

Evaluacion de los regenerantes obtenidos

Las plantas maduras fueron evaluadas morfologicamente para de esta forma asociarlas de manera visual con su nivel de ploidia. Las plantas haploides (n = x) son, por lo general, pequenas, debiles, con problemas de crecimiento y esteriles, las diploides DH (n = 2x) son plantas fertiles con un desarrollo similar al de las plantas derivadas de semilla y las plantas poliploides muestran un mayor crecimiento, con estructuras florales mas desarrolladas, granos con aristas largas, y parcialmente esteriles (Lentini et al., 1997).

Los resultados del analisis de componentes principales realizado a las lineas, con caracteristicas fenotipicas similares a las diploides, provenientes de los cruces Amistad'82/2077, 2077/Amistad'82, Amistad'82/ IR759-54-2-2, Moroberekan/Amistad'82, IR759-542-2/INCA LP-6, INCA LP-6/Moroberekan, Tetep/INCA LP-6, IR75954-2-2/6066, 6066/IR759-54-2-2, 2077/ INCA LP-1, Tetep/INCA LP-1, INCA LP-1/Tetep, IR 1529-430/IR 759-54-2-2, y 2077/CP,Ce, se presentan en la tabla 6.

[FIGURA 2 OMITIR]

El porcentaje de contribucion de las dos primeras componentes (C1 y C2) fue alto, notese que explican el 82.5% de la variacion total, lo que pudiera estar relacionado con la correlacion existente entre las variables iniciales y por tanto el analisis realizado puede brindar informacion acertada sobre la clasificacion de los genotipos y las relaciones de asociacion entre las variables. Todos los caracteres evaluados presentaron una fuerte contribucion a la formacion de la primera componente y la segunda estuvo representada por los granos llenos por panicula.

La representacion grafica de las dos primeras componentes (figura 3) mostro una amplia dispersion en la distribucion de los 142 individuos y no fue posible la formacion de grupos. En el extremo positivo del eje de la primera componente se ubicaron los mejores genotipos, dentro de ellos los valores medios de los cruces Amistad'82/2077, 2077/Amistad'82, Amistad'82/ IR759-54-2-2, INCA LP-6/Moroberekan, IR 759-542-2 /6066 e INCA LP-1/Tetep.

Estos cruzamientos aportaron mayor cantidad de lineas que combinan valores altos de paniculas por planta, granos llenos por panicula y peso de 1000 granos, componentes importantes que definen el rendimiento de las plantas de arroz, y tambien presentan mayor longitud de la panicula y el grano, asi como ancho del grano.

Dentro de las combinaciones que aportaron las mejores lineas se destacan tres, de las cuatro evaluadas, que incluyen a la variedad Amistad'82 como progenitor, sin importar su utilizacion ya sea como parental paterno o materno, tambien coincide que estos cruces lograron mayor cantidad de plantas, se evaluaron 58 en este estudio, que representan el 41% del total.

Al analizar para cada caracter evaluado los valores maximos y minimos alcanzados, asi como la media, el error estandar y el coeficiente de variacion, se pudo reafirmar la variabilidad presentada entre los diploides, en esta primera generacion (tabla 7), en este sentido se destacan las paniculas por planta, seguidas de los granos llenos por panicula con los coeficientes de variacion mas altos dentro de los obtenidos en el estu dio. El largo del grano re sulto ser el caracter con el coeficiente de variacion mas bajo.

Roy y Mandal (2005) senalan a los caracteres paniculas por planta, granos llenos por panicula y el rendimiento por planta como los de mas altos coeficientes de variacion.

Los valores medios de las lineas obtenidas para todos los caracteres evaluados se redujeron con respecto a la media de los progenitores (seleccionados por poseer buenos caracteres agrnomicos) que les dieron origen. Resultados similares fueron obtenidos por Mandal et al., 2000; y Roy y Mandal (2005), al evaluar 180 diploides obtenidos mediante el cultivo de anteras, pero en este caso fueron utilizadas como donantes un grupo de variedades locales.

Diversos autores han informado variaciones fenotipicas con relacion al numero de tallos por planta, la longitud media de la panicula, numero de granos llenos y altura de la planta en la primera generacion de diploides de arroz, las que pudieran ser debidas por un lado, a la tecnica de mejoramiento empleada antes del cultivo de anteras (hibridacion) y tambien a factores fisiologicos, quimicos, a los componentes del medio de cultivo, condiciones biologicas del explante, recombinacion somatica, mutaciones, entre otras (Roy y Mandal 2005).

Segun Lentini et al., 1997; al realizar la seleccion de las plantas regeneradas (R1), se debe tener en cuenta que estas han pasado por diferentes situaciones de estres en su desarrollo y, debido a esto, es posible que ciertas caracteristicas fenotipicas tales como altura, floracion, macollamiento, fertilidad y centro blanco, puedan verse afectadas y no se expresen en forma normal. Por consiguiente, los datos que se tomen en las plantas regeneradas R1 deben interpretarse con cuidado, teniendo en cuenta estas consideraciones no se efectuo seleccion en la primera generacion.

Evaluacion de la segunda generacion de plantas diploides

Al evaluar las plantas de la segunda generacion de dobles haploides sembradas en condiciones de campo, se observo un alto grado de homogeneidad fenotipica dentro de cada linea, lo que mostro la rapida fijacion de los caracteres que se alcanza al utilizar la tecnica del cultivo de anteras.

Sobre la base de la clasificacion automatica (cluster), se agruparon los genotipos en estudio en 10 clases (tabla 8) y se destaca la clase 4 con las 20 mejores lineas que presentan valores mas altos de rendimiento y sus principales componentes (paniculas por metro cuadrado y granos llenos por panicula), que superan la media del experimento y de los progenitores comerciales que las originaron, los que fueron ubicados en las clases 2 (INCA LP-6 y 6066), 5 (Amistad'82) y 9 (INCA LP-1 y IR 1529-430).

Las 7 lineas agrupadas en la clase 9 le siguen a las anteriores aunque con 0,9 t.ha-1 menos de rendimiento y resalta dentro de sus resultados el largo y ancho de los granos con los valores mas altos dentro del estudio.

En las clases 3, 7, 8 y 10 se aprecian los valores mas bajos para la formacion de paniculas y en las clases 7, 8 y 10 para los granos llenos por panicula, lo que puede ser la causa de los bajos rendimientos obtenidos por los genotipos agrupados en estas clases. Muchos autores hablan en sus resultados de las correlaciones existentes entre el rendimiento y dos componentes importantes como lo son las paniculas por metro cuadrado y los granos llenos por panicula.

Al respecto, Diaz et al. (2003) en trabajos realizados con la variedad IR 1529-430 encontraron altas correlaciones del rendimiento agricola con las paniculas por metro cuadrado y los granos llenos por panicula. Mientras que Castillo et al. (2008), al evaluar el rendimiento y sus componentes en la variedad de arroz IIACuba 20, encontraron que el numero de paniculas por metro cuadrado, fue el componente del rendimiento que mayor contribucion directa ejercio sobre el rendimiento agricola.

Con relacion a la evaluacion realizada frente a la Piriculariosis los resultados mostraron que solo 9 lineas (8394, 8425, 8432, 8837, 8838, 8839, 8840, 8841 y 8842), dentro del estudio mostraron resistencia a la enfermedad en los dos momentos evaluados, ubicadas todas en la clase 4, que coincide ademas con la clase que presento los valores mas altos de rendimiento y sus componentes principales. Cuatro de estas lineas tuvieron como progenitor resistente a la variedad IR 759-54-2-2 (8425, 8432, 8837 y 8838) cruzado con Amistad'82, 6066 e IR 1529-430.

Tambien resultaron resistentes, en la evaluacion efectuada tanto en la hoja como en el cuello de la panicula, cinco de las variedades utilizadas como progenitores, ubicados en las clases 2 (INCA-LP 6, IR 759-54-2-2 y Tetep), 3 (Moroberekan)y 9 (2077). Otras 93 lineas distribuidas en las 10 clases mostraron resistencia a la enfermedad cuando esta fue evaluada en uno de los dos momentos y susceptibilidad en el otro, lo que pudo ser un factor que contribuyo a la obtencion de bajos rendimientos.

En este sentido Zambrano et al. (2006) plantean que cuando no hay destruccion total del cultivo es bastante dificil estimar las perdidas, por lo que no hay una estimacion exacta de las mismas, pero se considera que las perdidas son proporcionales al porcentaje del area foliar o del cuello de la panicula afectada.

Las lineas que resultaron resistentes deben ser evaluadas en un sitio donde exista una alta presion de la enfermedad y diversidad del patogeno asociada a condiciones ambientales favorables al desarrollo del hongo, lo que permite la seleccion de materiales con resistencia duradera a la enfermedad causada por el hongo Magnaporthe grisea Barr. En tal sentido Fabregat (1984), citada por Cardenas (1998), informo que la presencia de la enfermedad en las diferentes fenofases del cultivo esta muy relacionada con lo optimo de las condiciones ambientales, pero su desarrollo depende de las caracteristicas geneticas de las variedades y de la variabilidad del patogeno, de ahi la necesidad de evaluar las lineas obtenidas en la epoca de mayor incidencia de la enfermedad y en la localidad selecciona da en Cuba como "Hot Spot ", la Unidad Economica Basica Caribe perteneciente al Complejo Agroindustrial Arrocero "Los Palacios", por poseer condiciones de alta presion de la enfermedad favorecida por condiciones ambientales y una alta diversidad en virulencia del patogeno (Cardenas et al., 2005).

Evaluacion de las nuevas lineas obtenidas por cultivo de anteras frente a la incidencia de la Piriculariosis en canteros de infeccion

Si analizamos la media anual del comportamiento de las lineas evaluadas en canteros de infeccion en la localidad Caribe (tabla 9) se aprecian, en todos los casos, valores de la enfermedad considerados como susceptibles, o sea afectaciones del area foliar y cuellos superiores a 3 y 10% respectivamente.

Se observaron ademas diferencias en los cuatro anos evaluados y exhibio los valores mas altos el tercero. En este sentido Cardenas et al. (2007) al valorar los resultados, de un ensayo similar pero con variedades y epocas diferentes, plantean que la enfermedad no exhibe un patron comun en su expresion, lo que consideran esta muy relacionado con las condiciones climaticas.

En terminos epidemiologicos es conocido que para el desarrollo de cualquier enfermedad debe coexistir un hospedero susceptible, el patogeno y las condiciones ambientales favorables, siendo estas las que determinan el exito de la relacion patogeno hospedero. La incidencia y severidad del hongo Magnaporthe grisea Barr (Pyricularia grisea Sacc) estan influenciadas por diversos factores, tales como la fertilizacion nitrogenada, la susceptibilidad de los materiales y el tipo de suelo, los cuales interactuan con los factores ambientales que condicionan el progreso de la enfermedad (Meneses et al., 2001).

El conocimiento de la dinamica poblacional del hongo y el desarrollo de estrategias de mejoramiento que incluyan la seleccion y evaluacion de germoplasma de arroz en sitios y epoca donde exista alta variabilidad del mismo, asi como una alta presion de inoculo, permite implementar programas de mejoramiento para desarrollar una resistencia durable a la Piriculariosis. En tal sentido, la seleccion de localidades y epocas de evaluacion de P. grisea, es un factor critico, en el cual hay que tomar en consideracion las variantes climaticas imperantes (Navas et al., 2003).

Si se analiza el comportamiento individual de las lineas ante la infeccion en la hoja y cuello de la panicula, en los 4 anos evaluados, en ella se aprecia una reaccion diferente de las mismas, por anos y dentro de un mismo ano en dependencia del momento evaluado (plantula y paniculacion), lo cual puede ser explicado por la existencia en la localidad de una alta diversidad genetica del patogeno (Fuentes et al., 1998) que unido a la falta de proteccion al cultivo permitio la infeccion de las variedades.

El cultivar J-104 mostro siempre los valores mas altos de incidencia de la enfermedad, con diferencias estadisticamente significativas del resto de los genotipos. Asi mismo se observaron en esta variedad manchas tipicas de la enfermedad y porcentajes de area foliar afectada comprendidos entre los grados susceptibles 6-9 de la escala, lo que coincide con el comportamiento de esta variedad en areas de produccion que ademas es considerada la principal causa de los bajos rendimientos, tanto de esta variedad como de los cultivares susceptibles que se siembran en produccion en la localidad en estudio (UEB Caribe).

Con excepcion del tercer ano evaluado para el cultivar IR 759-54-2-2, el resto de los testigos resistentes presentaron afectaciones de area foliar por debajo de 3%, mientras que para la incidencia en el cuello, Moroberekan e IR 759-54-2-2 superaron el 10% limite considerado como resistentes, en las cuatro evaluaciones en el caso de Moroberekan y el tercer ano IR 759-54-2-2. Teniendo en consideracion estos resultados y conociendo ademas que la localidad utilizada para la evaluacion (UEB Caribe) historicamente ha mostrado una alta incidencia de la plaga, razon por la que ha sido seleccionada como hot spot, es meritorio destacar el comportamiento de las lineas 8394, 8425 y 8840 quienes mantienen, durante los 4 anos evaluados, los valores mas bajos de porcentajes de area foliar y cuellos afectados dentro de los grados 0 y 3 de las escalas utilizadas, superando incluso a los progenitores que les dieron origen.

El mejoramiento tradicional ha jugado un papel importante en el mejoramiento del rendimiento y calidad de las variedades de arroz en el mundo, mientras que la utilizacion de los metodos biotecnologicos puede asistir el desarrollo de variedades con rendimiento mas alto y resistencia a enfermedades y estres abioticos. El cultivo in vitro de anteras acelera el proceso de obtencion debido a su produccion rapida de lineas homocigoticas y por consiguiente la retencion de alelos recesivos o mutaciones utiles. Existen en la actualidad un gran numero de variedades desarrolladas combinando las tecnicas convencionales con el cultivo de anteras (Chen et al., 2006).

Conclusiones

Los resultados obtenidos permiten concluir que la utilizacion de la tecnica del cultivo de anteras mostro alta dependencia del genotipo y el medio de cultivo, las dos primeras generaciones de las lineas obtenidas presentaron un alto grado de homocigosis fenotipica. De los 3 medios liquidos empleados para la formacion de callos a partir de anteras, resulto el NL con los valores mas altos y se obtuvieron nuevos genotipos resistentes a la Piriculariosis y de alto rendimiento agricola.

Recibido: enero 20 de 2011

Aprobado: junio 19 de 2012

Referencias bibliograficas

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Noraida de Jesus Perez *, Maria Caridad Gonzalez **, Rodolfo I. Castro *, Manuel Aguilar ***

* Investigadores Auxiliares de la Estacion Experimental del Arroz, Los Palacios, Instituto Nacional de Ciencias Agricola, Gaveta Postal 1, San Jose de las Lajas, La Habana, Cuba, CP 32700. Autor para correspondencia: nory@inca.edu.cu

** Investigadora Titular del Departamento de Genetica y Mejoramiento Vegetal, Instituto Nacional de Ciencias Agricola.

*** Investigador del Departamento de Arroz y Maiz del Centro de Investigaciones y Formacion Agraria Las Torres Tomejil, Alcala del Rio, Sevilla Espana.
Tabla 1. Variedades y lineas utilizadas como progenitores
y su procedencia.

Variedades      Progenitores    Objetivo         Origen
y lineas

6066            IR1529-430/IR   Variedades       Cuba
                759-54-2-2      de buen
Amistad'82      IR 1529-430/    comportamiento   Cuba--URSS
                Vniir 3223      agronomico
[CP.sub.1]      Cica 4/IR 24                     Cuba
  [C.sub.8]
IR 1529-430     Sigadis/TN 1                     Filipinas
                //IR 24
INCA LP-1       J-104/                           Cuba
                Amistad'82
INCA LP-6       2077/                            Cuba
                [CP.sub.1]
                [C.sub.8]
2077            Cica 9/BG 90    Variedades       Colombia
                //Cica 7        resistentes
IR 759-54-2-2   IR 8/Peta 3     a la             Filipinas
                //Dawn          Piriculariosis
Moroberekan     Desconocido                      Guinea
Tetep           Desconocido                      Viet Nam

Tabla 2. Composicion de los medios de cultivo utilizados
para la induccion de callos a partir de anteras.

Medios

                 [N.sub.6-1]   [N.sub.6m]      NL

[(N[H.sub.4]).      463,0          231.5       231.5
  sub.2]S[O.
  sub.4]
KN[O.sub.3]        2830,0         2830,0      3134,0
K[H.sub.2]P         400,0          540,0       540,0
  [O.sub.4]
MgS[O.sub.4].       185,0            3.7       185,0
  7[H.sub.2]O
Ca[Cl.sub.2].       166,0          166,0       150,0
  2[H.sub.2]O
[H.sub.3]B            1,6            1.6         6.2
  [O.sub.3]
MnS[O.sub.4].         4,0            4.4        22.3
  4[H.sub.2]O
ZnS[O.sub.4].         1,5            1.5         8.6
  7[H.sub.2]O
[Na.sub.2]Mo         0,25                       0.25
  [O.sub.4].2
  [H.sub.2]O
Co[Cl.sub.2].        0,25                      0,025
  6[H.sub.2]O
CuS[O.sub.4].        0,25                      0,025
  5[H.sub.2]O
KI                    0,8           0.83        0.83
[Na.sub.2]           37,3           37.3        37.3
  EDTA
Fe S[O.sub.4].       27,8           27.8        27.8
  7[H.sub.2]O
Mioinositol           1,0
Tiamina               0,1            1,0         2.5
Acido                 0,5            0.5         2.5
  nicotinico
Piridoxina            0,5            0.5         2.5
Glicina               2,0            2,0         2.5
2,4 D                 2,0            2,0         2,0
Picloramo                           0.07        0.07
ANA                   1,5
Kinetina              1,0            0.5         0.5
Lactoalbumina       500,0
  hidrolizada
AgN[O.sub.3]                                    10,0
Sacarosa (g/L)       50,0           50,0
Maltosa (g/L)                                   50,0

Tabla 3. Regenerantes evaluados por cruce, con
caracteristicas morfologicas similares a los diploides.

No.             Cruce              Lineas
                                  evaluadas

1     Amistad'82/2077             20
2     2077/Amistad'82             17
3     Amistad'82/IR 759-54-2-2    15
4     Moroberekan/Amistad'82      6
5     IR759-54-2-2/INCA LP-6      12
6     INCA LP-6/Moroberekan       10
7     Tetep/INCA LP-6             6
8     IR75954-2-2/6066            16
9     6066/IR759-54-2-2           8
10    2077/INCA LP-1              9
11    Tetep/INCA LP-1             6
12    INCA LP-1/Tetep             6
13    IR 1529-430/IR 759-54-2-2   6
14    2077/C[P.sub.1][C.sub.8]    5

Tabla 4. Formacion de callos y regeneracion de plantas verdes y
albinas por 100 anteras sembradas

                                             Callos

                                N6-1            N6m          NL

Amistad'82/2077             33,0   a  *     44,6    a     55,3   a
2077/Amistad'82             23,1   c        14,6    c     36,1   c
Amistad'82/IR 759-54-2-2    28,6   b        37,2    b     43,2   b
IR 759-54-2-2/Amistad'82    0,7    ij        0,3    j     0,0    l
Amistad'82/Tetep            0,9    hij       1,5          2,5    jkl
Moroberekan/Amistad'82      4,8    defg      6,6    ef    4,3    ijk
2077/INCA LP-1              6,2    de        9,0    d     7,5    fgh
INCA LP1/IR 759-54-2-2      0,2    j         0,0    j     0,0    l
INCA LP1/Tetep              5,1    defg     10,3    d     15,2   d
Tetep/INCA LP 1             4,4    defgh     5,7    efg   8,3    efg
INCA LP-1/Moroberekan       1,6    fghij     3,4    ghi   4,8    hijk
Moroberekan/INCA LP-1       5,6    de        6,3    ef    7,5    fgh
IR 759-54-2-2/INCA LP-6     5,0    defg      0,0    j     2,4    jkl
INCA LP-6/Tetep             0,7    ij        3,2    hi    0,0    l
Tetep/INCA LP-6             0,9    hij       0,0    j     2,1    kl
INCA LP-6/Moroberekan       4,3    defghi    4,3    fgh   3,2    ijk
Moroberekan/INCA LP-6       8,0    d         9,6    d     10,7   e
6066/IR 759-54-2-2          5,0    defg      0,0    j     6,0    ghi
IR 759-54-2-2/6066          3,8    efghij    3,3    hi    5,2    hij
Moroberekan/6066            0,2    j         0,6    j     0,0    l
C[P.sub.1][C.sub.8]/2077    1,5    ghij      0,0    j     0,0    l
2077/C[P.sub.1][C.sub.8]    2,9    efghij    0,0    j     2,0    kl
Tetep/C[P.sub.1][C.sub.8]   5,3    def       8,0    de    8,1    efg
IR 1529-430/IR 759-54-2-2   7,9    d         6,3    ef    10,3   ef
X                                  6,7       7,3          9,8
ESx                                1,1 *    0,8 *         0,9*

                                    Plantas

                              Verdes        Albinas

Amistad'82/2077             22,6   A       20,4   ab
2077/Amistad'82             14,4   B       10,8   de
Amistad'82/IR 759-54-2-2    12,7   Bc      8,3    def
IR 759-54-2-2/Amistad'82    0,3    J       0,0    g
Amistad'82/Tetep            2,3    Hij     0,4    g
Moroberekan/Amistad'82      4,2    Gh      6,8    efg
2077/INCA LP-1              6,7    Efg     24,0   a
INCA LP1/IR 759-54-2-2      0,0    J       0,3    g
INCA LP1/Tetep              3,6    H       17,0   bc
Tetep/INCA LP 1             4,8    Gh      8,7    def
INCA LP-1/Moroberekan       2,5    Hij     1,6    g
Moroberekan/INCA LP-1       0,0    J       0,0    g
IR 759-54-2-2/INCA LP-6     14,4   B       4,1    fg
INCA LP-6/Tetep             0,2    J       0,1    g
Tetep/INCA LP-6             3,4    Hi      0,9    g
INCA LP-6/Moroberekan       10,4   Cd      14,1   cd
Moroberekan/INCA LP-6       0,0    J       0,0    g
6066/IR 759-54-2-2          7,6    Ef      0,0    g
IR 759-54-2-2/6066          9,0    De      17,8   bc
Moroberekan/6066            0,7    Ij      0,0    g
C[P.sub.1][C.sub.8]/2077    0,0    J       0,0    g
2077/C[P.sub.1][C.sub.8]    4,3    Gh      5,5    efg
Tetep/C[P.sub.1][C.sub.8]   0,0    J       0,0    g
IR 1529-430/IR 759-54-2-2   5,2    Fgh     0,0    g
X                                  5,4            5,9
ESx                                0.9 *          2,0 *

* Medias con iguales letras por columna no difieren
estadisticamente segun prueba de Duncan al 5%.

Tabla 5. Matriz de valores y vectores propios.

                          Componentes
                          Principales

                       [C.sub.1]   [C.sub.2]

Valores propios          3,912       0,736
% Contribucion total    78,240      14,729
% Acumulado                         92,968
Callos medio NM          0,964      -0,242
Callos medio N6m         0,937      -0,228
Callos medio NL          0,963      -0,232
Plantas verdes           0,865       0,227
Plantas albinas          0,656       0,722

Tabla 6. Matriz de valores y vectores propios.

                  Componentes Principales

                  [C.sub.1]   [C.sub.2]

Valores propios     5.138       0.637
% Contribucion     73.399       9.099
  total
% Acumulado                    82.498
Altura final        0.835       0.007
Paniculas por       0.781      -0.256
  planta
Longitud de la      0.959       0.073
  panicula
G ranos llenos      0.691       0.689
  por panicula
Peso de 1000        0.894       0.014
  granos
Largo del grano     0.910      -0.135
Ancho del grano     0.898      -0.269

Tabla 7. Variacion observada en la primera generacion
de las lineas obtenidas para los caracteres agronomicos
evaluados.

Caracteres              Progenitores
evaluados
                  Comerciales   Resistentes

Paniculas por           18.0          10.0
  planta
Granos llenos          101.0          79.0
  por panicula
Peso de 1000            29.3          28.7
  granos
Altura                  88.2          97.8
Longitud de la          22.0          18.0
  panicula
Largo del grano         10.4          10.0
Ancho del grano          2.6           2.4

Caracteres                     Lineas
evaluados
                    Rango       X     Es x    CV

Paniculas por        4-22      12.0   0.43   42.0
  planta
Granos llenos     36.0-162.0   66.0   1.97   35.4
  por panicula
Peso de 1000      23.3-35.4    28.3   0.21   8,7
  granos
Altura            65.0-95.1    81.1   0.82   12.0
Longitud de la    15.3-23.6    19.3   0.25   15.4
  panicula
Largo del grano    9.6-10.9    10.1   0.03   3.3
Ancho del grano    2.1-2.7     2.4    0.02   7.4

Tabla 8. Valores medio de los caracteres evaluados en cada
grupo establecido sobre la base de la diversidad existente.

Clases   Lineas   R *   P     GL   PG     A      LP

1          24     5,7   539   69   29,0   86,0   20,7
2          20     4,9   325   67   27,3   82,8   19,3
3          11     3,8   233   81   29,5   92,5   22,8
4          20     7,1   577   95   28,9   88,1   21,0
5          15     5,6   594   59   29,6   86,4   20,8
6          11     5,7   497   69   29,0   88,2   21,0
7          11     2,6   266   52   25,8   73,7   17,6
8          11     2,3   180   46   27,0   69,7   16,0
9          7      6,2   411   81   29,4   88,5   22,5
10         22     2,2   141   55   26,7   78,4   16,9
X                 4,6   376   67   28,2   83,4   19,9

Clases   Lineas   LG     AG     Resistentes        S

                               H    C    H y C   H y C

1          24     10,2   2,5   10   6      0       8
2          20     10,1   2,4   6    7      3       4
3          11     10,3   2,5   2    6      1       2
4          20     10,2   2,5   9    2      9       0
5          15     10,3   2,5   6    5      0       4
6          11     10,2   2,5   4    2      0       5
7          11     9,9    2,4   1    5      0       5
8          11     9,8    2,3   0    8      0       3
9          7      10,5   2,6   0    1      1       5
10         22     9,7    2,2   2    11     0       9
X                 10,1   2,4

Lineas por clases

1    8396            8397   8401   8405   8408   8412    8414
     8404            8409   8420   8422   8428   8431    8803
2    IR 759-54-2-2   8383   8660   8676   8799   8800    8801
     INCA LP-6       8622   8763   8765   8683   8634    6066
3    Moroberekan     8388   8677   8774   8398   8433    8436
4    8394            8403   8411   8423   8385   8392    8421
     8841            8839   8773   8842   8838   8752    8840
5    Amistad'82      8382   8407   8413   8387   8389    8399
     8797            8767   8753
6    8384            8402   8417   8386   8418   8391    8798
7    8781            8783   8656   8658   8679   8627    8629
8    8437            8782   8662   8631   8620   8760    8766
9    IR1529-430      8410   8749   8750   INCA   CP1C8   2077
                                          LP-1
10   8438            8784   8785   8657   8659   8661    8670
     8621            8623   8762   8769   8756   8758    8681

1    8396            8424    8430   8390   8416   8400
     8404            8817    8395   8435   8616   8817
2    IR 759-54-2-2   8816    8772   8630   8617   8618
     INCA LP-6       Tetep
3    Moroberekan     8628    8635   8619   8682
4    8394            8429    8439   8425   8427   8432
     8841            8837
5    Amistad'82      8419    8426   8434   8406   8415
     8797
6    8384            8802    8393   8626   8764
7    8781            8768    8755   8757   8680
8    8437            8754    8759   8751   8614
9    IR1529-430

10   8438            8678    8770   8771   8624   8625
     8621            8687    8613   8615

* R--Rendimiento agricola (t.[ha.sup.-1]), P--Paniculas por metro
cuadrado, GL--granos llenos por panicula, PG--Peso de 1000 granos,
A--Altura final, LP--Longitud de la panicula, LG--Largo del grano,
AG--Ancho del grano, H--Hoja, C--Cuello, S--Susceptibles.

Tabla 9. Incidencia de la enfermedad en las nuevas lineas
obtenidas durante los 4 anos evaluados.

Lineas                   Area foliar afectada (%)

Anos             1ro      2do      3ro      4to      X

8394             2 c      2 c      2 b      2 b      2
8425             2 c      4 bc     2 b      2 b     2,5
8838             8 b      8 b      2 b      1 b     4.75
8839             8 b      8 b      1 b      2 b     4,75
8840             1 c      2 c      1 b      4 b      2
8841             4 bc     8 b      4 b      2 b     4,5
8842             2 c     0,5 c     4 b      8 b     3,63
IR 759-54-2-2    2 c      2 c      4 b      2 b     2,5
Moroberekan      1 c      1 c      1 b      1 b      1
Tetep            1 c      1 c      1 b      1 b      1
2077            0,5 c     1 c     0.5 b     1 b     0,75
J-104            16 a     16 a     82 a     32 a    36,5
X                4,0      4,5      8,7      4,8
ESx             1,62 *   1,74 *   1,76 *   2,65 *

Lineas                    Cuellos afectados (%)

Anos             1ro      2do      3 ro     4to     X

8394             0 f     15 cd    12 de     0 g     7
8425             0 f      6 fg     10 e     0 g     4
8838             10 e    10 def    25 b    5 efg    13
8839             20 c     18 c     23 b     35 b    24
8840             10 e    7 efg     7 e      8 e     8
8841             4 f     10 def    10 e     25 c    12
8842             25 b     25 b     25 b     25 c    25
IR 759-54-2-2    10 e     8 ef    16 cd     6 ef    10
Moroberekan      15 d    12 de    20 bc     15 d    16
Tetep            2 f      2 g      1 f     3 efg    2
2077             2 f      2 g      1 f      1 fg    2
J-104            60 a     45 a     60 a     48 a    53
X                 13       13       18       14
ESx             1,60 *   1,79 *   1,84 *   1,81 *

Figura 1. Distribucion de los genotipos
segun las componentes consideradas.

1    Amistad'82/2077
2    2077/Amistad'82
3    Amistad'82/IR 759-54-2-2
4    IR 759-54-2-2/Amistad'82
5    Amistad'82/Tetep
6    Moroberekan/Amistad'82
7    2077/INCA LP-1
8    INCA LP1/IR 759-54-2-2
9    INCA LP1/Tetep
10   Tetep/INCA LP 1
11   INCA LP-1/Moroberekan
12   Moroberekan/INCA LP-1
13   IR 759-54-2-2/INCA LP-6
14   INCA LP-6/Tetep
15   Tetep/INCA LP-6
16   INCA LP-6/Moroberekan
17   Moroberekan/INCA LP-6
18   6066/IR 759-54-2-2
19   IR 759-54-2-2/6066
20   Moroberekan/6066
21   CP1C8/2077
22   2077/CP1C8
23   Tetep/CP1C8
24   IR 1529-430/IR 759-54-2-2

Figura 3. Distribucion de las variedades y
el valor medio de las lineas por cruce segun
las componentes consideradas.

No   Cruces

1    Amistad'82/2077
2    2077/Amistad'82
3    Amistad'82/IR 759-54-2-2
4    Moroberekan/Amistad'82
5    IR759-54-2-2/INCA LP-6
6    INCA LP-6/Moroberekan
7    Tetep/INCA LP-6
8    IR75954-2-2/6066
9    6066/IR759-54-2-2
10   2077/INCA LP-1
11   Tetep/INCA LP-1
12   INCA LP-1/Tetep
13   IR 1529-430/IR 759-54-2-2
14   2077/CP1C8
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Title Annotation:ARTICULO CORTO
Author:de Jesus Perez, Noraida; Caridad Gonzalez, Maria; Castro, Rodolfo I.; Aguilar, Manuel
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2012
Words:9634
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