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Natural compounds from plants of the clusiaceae family: type 1 human immunodeficiency virus inhibitors/Compuestos naturales de plantas de la familia clusiaceae: inhibidores del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1/ Compostos naturais de plantas da familia clusiaceae: inibidores do virus de imunodeficiencia humana tipo 1.

En 1981 se dieron a conocer los primeros informes de una nueva enfermedad humana, el Sindrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), caracterizada por un severo dano inmunologico (Gottlieb et al., 1981). Dos anos despues fue identificado el agente causal, el cual fue denominado como Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH; Barre-Sinoussi et al., 1983; Levy et ai., 1985; Wong-Staal y Gayo et al., 1985; Coffin et al., 1986). Tambien se identifico que el principal blanco del VIH son los linfocitos [CD4.sup.+], los cuales presentan una disminucion progresiva en personas infectadas por este virus (Dalgleish et al., 1984). Actualmente se estima que mas de 40 millones de personas estan infectadas con VIH y que han ocurrido 24 millones de fallecimientos debido a este padecimiento en todo el mundo. Tan solo 2,1 millones de personas murieron durante 2007 y se estima que 7000 personas se infectan con el virus cada dia (ONUSIDA/OMS, 2007). La Administracion de Farmacos y Alimentos de EEUU (FDA) ha aprobado hasta el momento 24 farmacos para su uso en pacientes infectados con VIH (Hupfeld y Efferth, 2009). A pesar que estos tratamientos han mostrado efectividad en el control de la infeccion, estos beneficios son limitados por riesgos asociados con el uso prolongado de los farmacos, como toxicidad hepatica y neurologica (De Clercq, 1999, 2000), pero sobretodo por el rapido desarrollo de resistencia a los mismos (Raulin, 2002). Los farmacos que actualmente se utilizan tienen un alto costo por tratamiento individual, el cual se estima en un promedio de USD 6000 anuales en los esquemas iniciales para Mexico (CONASIDA, 2007). En consecuencia, es necesario proseguir con los esfuerzos para descubrir y desarrollar farmacos y fitofarmacos que permitan controlar la epidemia del SIDA causada por el VIH.

El Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)

El agente etiologico del SIDA, el VIH, es un retrovirus ubicado en el genero Lentivirus, los cuales poseen largos periodos de incubacion y tienen como blanco diversos linajes de celulas hematopoieticas, particularmente linfocitos (Freed y Martin, 2001). Otros virus similares que infectan diversas especies incluyen al virus visna/maedi (oveja), virus de artritis/encefalitis caprina (VAEC), virus de anemia infecciosa equina (VAIE) y los virus de inmunodeficiencia felina (VIF), bovina (VIB), y de simios (VIS). Hasta el momento han sido identificados y caracterizado dos tipos: VIH-1 y VIH-2 (Coffin et al., 1986). El primero de ellos se distribuye ampliamente en el mundo, pero con alta prevalencia en Africa Central, Europa, Asia y Estados Unidos; aunque las infecciones con VIH-2 estan localizadas principalmente en paises del oeste de Africa, tambien han sido detectados individuos infectados con VIH-2 en Europa, Sudamerica, Estados Unidos, Asia y Australia (Evans y Levy, 1993). La ultraestructura del VIH-1 y VIH-2 es similar; sin embargo, la homologia del total de la secuencia de nucleotidos entre ambos tipos es de ~40% (Guyader et al., 1987). Al igual que otros lentivirus, las particulas maduras de VIH presentan un diametro caracteristico de 100-120nm y estan cubiertos por una membrana que rodea a la capside y a la nucleocapside de forma conica. Las particulas virales, tipicamente esfericas, poseen 2 copias de ARN (de polaridad positiva) y las enzimas transcriptasa reversa, proteasa e integrasa (TR, PR e IN, respectivamente; Evans y Levy, 1993; Freed et al., 2001). El genoma de VIH-1 consta de solo 3 genes que codifican para proteinas estructurales: gag, pol y env. Estas proteinas estructurales son inicialmente sintetizadas como precursores de poliproteinas y subsecuentemente son procesadas por proteasas viraleso celulares en particulas maduras. El precursor Gag Pr55 tiene como productos las proteinas de la matriz (MA) p17, capside (CA) p24, nucleocapside (NC) p7 y pe. Por otra parte, la autocatalisis del precursor Gag-Pol Pr160, da como resultado a PR, TR e IN, mientras que la digestion proteolitica por enzimas celulares convierte el precursor Env gp160 en la proteina de superficie (SU) gp120 y la transmembranal (TM) gp41. Los restantes 6 genes (Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu y Nef) codifican para proteinas accesorias que participan en procesos de regulacion de la expresion/ replicacion viral y son productos de la traduccion primaria del procesamiento de ARNm (Luciw y Shacklett, 1993; Levy, 1998).

Ciclo replicativo

La replicacion del VIH-1 se lleva a cabo en diez pasos (Cos et al., 2004; Figura 1), que son: 1) La interaccion de los viriones libres con la celula. 2) La union y fusion del virus, mediante las glicoproteinas virales gp120 (SU) y gp41 (TM), con los receptores [CD4.sup.+] (Dalgleish et al., 1984; Klatzmann et al., 1984) y los coreceptores de quimiocinas CXCR4 o CCR5 de la celula hospedera (Fauci, 1996). 3) Como es caracteristico de los retrovirus, las particulas virales parcialmente desnudas quedan libres en el citoplasma. 4) Se inicia la transcripcion del ARN viral en un ADNc de doble cadena (Hu y Temin, 1990), proceso que es regulado por la enzima TR (Freed y Martin, 2001). 5) El ADN producto de la retrotranscripcion es transportado a traves del citoplasma hacia el interior del nucleo, donde es integrado al ADN cromosomal de la celula hospedera mediante la enzima IN que forma parte del complejo de preintegracion (Pullen y Champoux, 1990). 6) El ADN viral integrado sirve como molde para que la ARN polimerasa dependiente de ADN (Pol II) sintetice los ARNm que son traducidos en proteinas virales en el citoplasma de las celulas infectadas (Evans y Levy, 1993). 7) El precursor de las glicoproteinas gp160 y las poliproteinas de Gag y Gag/Pol son transportadas por vias independientes hacia la membrana. 8) Estas participan en la formacion de particulas esfericas que contienen las glicoproteinas virales TM y SU. 9) Estas emergen de la celula como viriones inmaduros (Berman et al., 1988). 10) La proteolisis subsecuente, mediada por la proteasa ubicada en el virion inmaduro, genera particulas que contienen la nucleocapside conica caracteristica de los viriones maduros (Katoh et al., 1985). La pro teolisis puede ocurrir durante o inmediatamente despues de que la particula viral deja la celula (Freed y Martin, 2001; Goff, 2001).

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Transcriptasa reversa (TR)

La enzima TR del VIH-1 ha sido un blanco importante en la terapeutica del SIDA. Es un heterodimero de 2 subunidades de 66 (p66) y 51kDa (p51). Esta se deriva de la subunidad p66 como producto de la remocion proteolitica de 15kDa de p66 llevada a cabo por la PR de VIH-1 (Freed y Martin, 2001). La subunidad p66 puede ser visualizada con tines didacticos como una mano derecha (vista con la palma frente a los ojos) que incluye el sitio activo de la polimerasa, conformado como una marcada hendidura formada por los dominios de la "palma", "dedos" y "pulgar" (Jacobo-Molina et al., 1993). El dominio de la polimerasa esta unido a la ARNsa por el subdominio de conexion. El sitio activo, localizado en la "palma", contiene tres residuos de acido aspartico (D) determinantes (D110, D185 y D186) que se localizan muy proximos entre si y en coordinacion con dos iones [Mg.sup.2+] (Huang et al., 1998). Mutaciones de estos residuos de acido aspartico anulan la actividad de polimerasa de la TR. La subunidad p51 muestra una estructura rigida que no forma parte de la hendidura de polimerizacion (Arnold et al., 1992; Flint et al., 2000). La TR cataliza la retrotranscripcion de una cadena sencilla de ARN en una doble cadena de ADN durante la fase temprana del proceso infeccioso, la cual se lleva a cabo en conjunto con la actividad de RNasaH. La TR de VIH-1 realiza tres funciones enzimaticas: 1) como polimerasa dirige la sintesis de ADN a partir de ARN, para la formacion del ADN de polaridad negativa; 2) como RNasaH degrada el iniciador de ARNt y el ARN molde presente en el hibrido intermedio de ADN-ARN; y 3) polimerasa de ADN a partir de ADN ya que polimeriza la cadena positiva de ADN (Flint et al., 2000; Goff, 2001). La TR presenta una alta tasa de mutacion durante la replicacion, debido a que carece de un dominio de exonucleasa para la reparacion (Evans y Levy, 1993; Coffin, 1995). La tasa del total de mutaciones in vivo de VIH-1, que comprende sustituciones, cambios en el marco de lectura, deleciones simples o con inserciones, se calcula en 3x[10.sup.-5] por ciclo replicativo. Las tasas de mutaciones in vivo de otros retrovirus, como BLV y MuLV, son entre 2 y 10 veces menores que las del VIH-1 (Mansky y Temin, 1996).

Terapia Antiretroviral

Los farmacos antiVIH que han sido aprobados por la FDA pueden ser clasificados en cuatro grupos con base en sus mecanismos de accion: inhibicion de la fusion (IF), de la transcriptasa reversa (ITR), la integrasa (II) o la proteasa (IP). Los IF evitan la fusion viruscelula y, con ello, la infeccion de celulas blanco (Kilby et al., 1998). Los ITR se clasifican en 2 tipos: a) analogos a nucleosidos (ITRAN o NRTI por sus siglas en ingles), que actuan sobre el sitio activo de la enzima o b) no nucleosidos (ITRNN o NNRTI) que inhiben por interaccion especifica con un sitio de union alosterico (De Clercq, 1993). Los II inhiben la accion de la IN y evitan la insercion del material genetico del virus en el material genetico del hospedero (Markowitz et al., 2006). Los IP se unen al sitio activo de la proteasa viral y evitan el procesamiento de las proteinas virales a enzimas funcionales. Las particulas virales son producidas aun cuando la PR es inhibida, pero no son infecciosas (Wlodawer y Erickson, 1993).

De los 24 farmacos aprobados, 11 son inhibidores de la reversa transcriptasa (7 ITRAN y 4 ITRNN), 10 son inhibidores de proteasa, 2 son inhibidores de fusion y 1 es inhibidor de integrasa (Hupfeld y Efferth, 2009). Actualmente se administran combinaciones de inhibidores de TR y PR que conforman los esquemas denominados "terapia antiretroviral altamente activa" (TARAA o HAART por sus siglas en ingles). El uso de TARAA ofrece beneficios claros en la calidad y expectativa de vida de los pacientes con VIH, mejorando el estado inmunologico general (De Clercq, 1999); ademas, cambio la perspectiva de una enfermedad mortal a un padecimiento cronico y tratable (CONASIDA, 2007). La TARAA ha probado ser benefica especialmente en combinaciones triples de farmacos (3ITR, 2ITR + 1IP) sobre monoterapias y combinaciones dobles. En los pacientes con VIH ocasiona la reduccion sostenida de carga viral plasmatica, incrementa el numero de linfocitos CD4 y el retardo de la progresion a SIDA (Press et al., 2002). Todo esto se manifiesta en incremento de la esperanza de vida y disminucion de la tasa de mortalidad. No obstante, estos beneficios se ven limitados por importantes riesgos asociados con el uso prolongado de los tratamientos, tales como trastornos metabolicos y reacciones farmacologicas cruzadas (De Clercq, 2000). La posibilidad de bajo apego de los pacientes a tratamientos permanentes se considera un factor importante en la seleccion de variantes resistentes. Tambien podria tener efectos graves de toxicidad en el sistema cardiovascular, higado, rinon, cerebro, pancreas y piel (De Clercq, 2000; Guaraldi et al., 2003; CONASIDA, 2007). La terapia TARAA no erradica el virus de sus reservorios aun despues de 30 meses de tratamiento y 15% de los casos presentan resistencia al primer esquema de tratamiento (De Clerq, 1999).

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Productos Naturales AntiVIH

A la fecha se ha logrado identificar poco mas de 120 compuestos naturales, principalmente de plantas, que pueden contrarrestar in vitro los efectos citopaticos de celulas infectadas con VIH e impedir la replicacion del virus. Estos presentan una gran diversidad estructural encontrandose, entre otros, alcaloides, cumarinas, flavonoides, lignanos, fenoles, quinonas, saponinas, diterpenos, triterpenos, xantonas y polisacaridos sulfatados (Vlietnick et al., 1998; Yang et al., 2001; Singh et al., 2005). Se conoce el mecanismo de accion de algunos de ellos, destacando aquellos que inhiben in vitro la entrada/fusion, la formacion de sincicios, asi como la actividad de la TR, IN y PR (Matthee et al., 1999; Minet al., 1999; Cos et al., 2004). Entre los compuestos extraidos de bacterias, hongos, invertebrados terrestres y marinos, destacan: cianovirina-N, una proteina aislada de la cianobacteria Nostoc ellipsosporum, que ha sido caracterizada como un inhibidor de la entrada/fusion del virus; la esponjotimidina, obtenida de la esponja Cryptotethia cripta, que inhibe la TR; la lamellarina [alpha]20-sulfato, un nuevo inhibidor de IN proveniente del molusco Lamellaria sp., y los depsidos y depsidonas inhibidores de IN aislados de liquenes (Vlietnick et al., 1998; Matthee et al., 1999; Yang et al., 2001). De acuerdo a algunos autores, los compuestos que poseen mayor potencial para convertirse en farmacos antiVIH por encontrarse en etapa de estudios clinicos son el (+)-calanolido A, dos derivados semisinteticos de la suksdorfina, una cumarina originalmente aislada de Lomatium suksdorfii (Apiaceae; Singh et al., 2005) y un derivado semisintetico del acido betulinico (Butler, 2005), que es un triterpenoide comun en muchas plantas.

Productos Naturales AntiVIH de Clusiaceae

Cumarinas

El (+)-calanolido A (Figura 2) fue aislado por primera vez de brotes y frutos de Calophyllum lanigerum, arbol tropical de Malasia, caracterizandolo como un inhibidor potente de la TR del VIH-1 (Kashman et al., 1992). Actualmente se encuentra en la fase II/III de evaluacion clinica con pacientes VIH-1 positivos. De superar los ensayos clinicos, podria convertirse en el primer farmaco, originalmente extraido de una especie vegetal y posteriormente producido sinteticamente, que se aprobase para uso clinico en el tratamiento del SIDA (Butler, 2005; Sarawak, 2008). El interes en dicho compuesto ha estimulado los estudios quimicos sobre la familia Clusiaceae, constituida por ~36 generos y 1600 especies, con distribucion pantropical y diferentes habitos de vida: arboles, arbustos, lianas, hierbas anuales o perennes. Los dos generos mas importantes son Clusia y Calophyllum con cerca de 300 y 200 especies, respectivamente (Kearns et al., 1998). El genero Calophyllum esta constituido por especies arboreas, la mayoria de ellas localizadas en la zona Indo-Pacifica, sobre todo desde la Peninsula Malaya hasta Nueva Guinea. En selvas tropicales del continente americano se encuentran ocho especies de Calophyllum (Stevens, 1980).

Las propiedades antiVIH-1 del (+)-calanolido Ase describieron por primera vez mediante dos ensayos de viabilidad celular in vitro con celulas linfoblasticas T humanas (CEM-SS) infectadas con el virus (Kashman et al., 1992). En el ensayo con XTT tetrazolium-formazan, detuvo la replicacion del VIH-1 y confirio 100% de proteccion contra los efectos citopaticos ([EC.sub.50] = 0,1[micro]M) del virus. La citotoxicidad del compuesto (vs celulas no infectadas) se manifesto a concentraciones 200 veces mayores ([IC.sub.50] = 20 [micro]M) (Tabla I), para un indice terapeutico ([EC.sub.50]/[IC.sub.50]) de 200. Resultados similares se obtuvieron con un segundo metodo, estableciendo ademas que el (+)-calanolido A inhibia la produccion de TR y de la proteina viral gp24. Tambien se demostro que inhibe especificamente la actividad de la TR del VIH-1 mediante ensayos sobre moldes homopolimericos de poliA y poliT. No obstante, el (+)-calanolido A fue inactivo contra celulas infectadas con VIH-2. Pronto se sabria que el (+)-calanolido A era el compuesto lider de tres series de dipiranocoumarinas tetraciclicas estucturalmente relacionadas (Figura 2), denominadas calanolidos (prenilo en C-4), inofilums (fenilo en C-4) y cordatolidos (metilo en C-4). Ademas del (+)-calanolido A de C. lanigerum fueron aisladas siete dipiranocumarinas, dos de las cuales tambien fueron activas contra el VIH-1 (Kashman et al., 1992). El (-)-calanolido B presento actividad antiVIH, pero requirio concentraciones cuatro veces mayores para lograr niveles de citoproteccion equivalentes a las del (+)-calanolido A (Tabla I). El 12-acetoxi-calanolido fue aun menos potente, pues presento una [EC.sub.50]= 2,7[micro]M, concentracion 27 veces mayor que la del compuesto lider. Tambien se establecio la esteroquimica absoluta del (+)-calanolido A y (-)-calanolido B, como 10R, 11R, 12S y 10R, 11R, 12R, respectivamente. En 1993 se aislaron dos nuevas dipiranocumarinas de las hojas de C. inophyllum de Malasia, los inofilums B y P (Figura 2), que tambien inhibieron la TR del VIH-1 ([EC.sub.50] = 38 y 130nM, respectivamente) y ofrecieron proteccion contra los efectos citopaticos del VIH-1 en cultivos de celulas infectadas (Patil et al., 1993; Tabla I). Mas adelante, se aislaron los cordatolidos A y B (Figura 2) de las hojas de C. cordato oblongum de Sri Lanka. Dichos compuestos inhibieron in vitro la actividad de la TR del VIH-1 ([EC.sub.50] = 12,3 y 19[micro]M, respectivamente); sin embargo, no se ensayo su efecto sobre celulas infectadas (Dharmaratne et al., 1998).

El (+)-calanolido Ase obtiene en cantidades muy reducidas (<lmg/g extracto) de las hojas de C. lanigerum, especie que ademas es muy escasa (Cardellina et al., 1995), por lo cual se buscaron fuentes y compuestos alternativos. Se determino que es factible aprovechar el latex de C. teysmannii var. inophylloide, el cual contiene cantidades apreciables (hasta 48%) de costatolido, compuesto que tambien se obtuvo en forma abundante (400mg/kg) de las semillas de C. cerasiferum (Spino et al., 1998). Otra maneta de obtener un suministro adecuado de (+)-calanolido A que permitiera estudiar sus propiedades farmacologicas fue por sintesis. Se ha podido sintetizar la mezcla racemica de calanolido A, logrando la resolucion de los enantiomeros (+) y (-) por cromatografia (Flavin et ai., 1996). Otros esfuerzos para lograr la sintesis del calanolido A, permitieron obtener la mezcla racemica del 12-oxocalanolido A (Khilevich et al., 1996), logrando separar ambos enantiomeros (Xu et al., 1998). Tanto el (+) como el (-), asi como el (+ or -])-12-oxocalanolido A, presentaron alta actividad contra el VIH-1. La [EC.sub.50] de la mezcla racemica fue identica a la del (-)-calanolido B, lo cual es importante ya que no se requeriria purificar los enantiomeros para su empleo. Los anteriores compuestos tambien resultaron activos contra el VIS, pero no asi contra el VIH2. E1 (+) y ([+ or -])-12-oxocalanolido A actuan especificamente sobre la TR ([IC.sub.50] = 1040[micro]M; Xu et al., 1998).

Relaciones estructura-actividad. El anillo D (trans-10,11-dimetildihidropiranol 2-ol) es indispensable para que el (+)-calanolido A presente actividad antiVIH-1. La presencia de un heteroatomo, en especial de un grupo OH, sobre el carbono 12, tambien es crucial para dicho tipo de actividad (Galinis et al., 1996; Zembower et al., 1997). El OH-12 debe ser [beta] para obtener maxima actividad, por lo cual algunos resultados contradictorios publicados podrian deberse a que los compuestos estuviesen parcialmente racemizados (Flavin et al., 1996). La presencia de un grupo ceto en la posicion 12 (12-oxocalanolido A) no ocasiona una perdida de la actividad, sino que disminuye a un cuarto la actividad antiVIH-1 comparada con la del (+)-calanolido A (Tabla I). En el caso de la sintesis del 12-oxocalanolido A, la perdida de potencia es compensada por la actividad de la mezcla racemica (Xu et al., 1998).

El estudio de las series de los calanolidos e inofilums ha permitido concluir que los dos metilos y el hidroxilo sobre el anillo D deben presentar tres orientaciones sucesivas sobre las posiciones 10, 11 y 12 para obtener la maxima inhibicion de la TR del VIH-1 (Ishikawa et al., 1997). Asi, el (+)-calanolido A con configuracion trans-trans muestra la maxima actividad ([EC.sub.50] = 0,1[micro]M) de su serie (Figura 2), seguido por el (-)-calanolido B (trans-cis, [EC.sub.50] = 0,4[micro]M). El inofilum B es el mas potente de su serie (trans-trans, [EC.sub.50] = 1,40[micro]M), seguido por inofilum P (trans-cis, [EC.sub.50] = 1,60[micro]M), el inofilum D (cis-trans) y finalmente el inofilum A (cis-cis). Para estudiar el papel de los grupos sustituyentes sobre el anillo D, se preparo una serie de analogos del (+)-calanolido A y se evaluo su efecto protector contra la citopatocidad de VIH-1 mediante el ensayo de XTT (Zembower et al., 1997). La remocion del metilo en C-10 ocasiono que solo un epimero (OH [beta]-12) presentara actividad, aunque disminuida. La sustitucion del metilo en C-10 por un etilo se tradujo en una disminucion a la cuarta parte comparada con la mezcla racemica del calanolido A, pero si el sustituyente era un isopropilo, desaparecia la actividad. La sustitucion de los metilos por etilos sobre las posiciones 10 y 11 disminuyo la actividad antiVIH-1. En los ejemplos anteriores, la relacion cis entre los alquilos en 10 y 11 implico inactividad. Sin embargo, los derivados cetonicos en 12, con orientacion cis o trans entre los metilos 10 y 11 si presentaron actividad.

Propiedades farmacologicas. E1 primer ensayo de actividad del (+)-calanolido A in vivo se realizo con un modelo de celulas CEM-SS humanas infectadas con VIH-1 IIIb, implantadas dentro de una fibra plastica hueca en raton. El compuesto, administrado oral o parenteralmente, inhibio la replicacion del virus (Xu et al., 1999). Mas adelante se examino su perfil de seguridad en animales, asi como su farmacocinetica en voluntarios humanos VIH negativos con dosis unicas (Creagh et al., 2001). Continuando con los estudios clinicos de fase I, el (+)-calanolido A fue administrado en dosis de hasta 800mg b.i.d, durante 5 dias, encontrandose que era bien tolerado aunque se observaron efectos adversos transitorios de baja intensidad tales como mareo, cefalea, nauseas y mal sabor en boca. Los niveles en plasma fueron variables, pero a las dosis mas altas se alcanzaron niveles de posible eficacia terapeutica (Eiznhamer et al., 2002). Los estudios permiten concluir que el (+)-calanolido A es un nuevo tipo de inhibidor no nucleosido de la TR (ITRNN) del VIH-1 (Sarawak, 2008) con caracteristicas tales como: a) Presenta una actividad selectiva contra VIH-1, asi como para subtipos de VIH-1, pero no contra VIH2. b) Es activo contra cepas de VIH-1 resistentes a AZT y 3TC, los cuales son dos de los farmacos ITRAN mas comunmente prescritos y contra cepas con la mutacion Y181C, que confiere resistencia a la mayoria de los ITRNN. Esta es una caracteristica unica e importante que distingue al (+)-calanolido A de otros ITRNN, pues al parecer los residuos 100, 103, 188 y una region localizada entre los aminoacidos 225 y 427 son los sitios de union de este compuesto. Adicionalmente, no se observaron cepas resistentes a ITRNN despues de una monoterapia de 14 dias en la fase IB en pacientes infectados con VIH, sugiriendo que el (+)-calanolido A puede retardar la emergencia de mutaciones virales, c) En estudios preclinicos el (+)-calanolido A mostro una interaccion sinergica en combinaciones dobles (con AZT, 3TC o d4T), asi como en combinacion triple que involucra IP+ITRAN como nelfinavir+3TC. Este sinergismo puede tener implicaciones terapeuticas importantes en la terapia TARAA. d) Debido a su naturaleza lipofilica se distribuye rapidamente en el sistema nervioso central y sistema linfatico, penetrando a los reservorios virales, e) Presenta buena tolerancia en humanos, con los unicos efectos adversos de mal sabor en boca y mareo, que ubican a este compuesto como un candidato para terapia a largo plazo. f) La tolerancia favorable y el perfil farmacocinetico del (+)-calanolido A, demostrados en las fases IA y IB, sugieren que puede ser desarrollado como un farmaco de ingesta de 1-2 veces al dia, lo cual favoreceria el apego de los pacientes ai tratamiento, g) E1 (+)-calanolido A es el unico agente antiVIH que tambien presenta propiedades inhibitorias sobre Mycobacterium tuberculosis (Xu et ai., 2004), una de las principales infecciones oportunistas en pacientes con SIDA.

Benzofenonas y xantonas

Diversas benzofenonas preniladas aisladas de especies pertenecientes a los generos Allanblackia, Clusia, Garcinia, Symphonia y Vismia (Clusiaceae) tambien han presentado actividad antiVIH-1 in vitro (Figura 3). Las guttiferonas A, B, C y D inhibieron parcialmente in vitro los efectos citopaticos en celulas linfoblastoides humanas infectadas con VIH-1 ([EC.sub.50] = 1-10[micro]g/ mi), pero no asi la replicacion viral, estimada por la produccion de TR, p24 y formacion de sincicios; por otra parte, la citotoxicidad de tales compuestos con celulas no infectadas se ma nifesto a concentraciones >50[micro]g/ml (Gustafson et al., 1992). La guttiferona F y la vismiafenona D presentaron propiedades similares a las ya descritas para las guttiferonas A, B, C, y D, es decir, tampoco alcanzaron el 100% de citoproteccion (Fuller et al., 1999a, b). Otras benzofenonas preniladas, como la clusianona, 7-epiclusianona, 18,19-dihidroxiclusianona, nemorosona y propolona A, aisladas de especies de Clusia americanas, tambien han mostrado actividad antiviral en el modelo antes sefialado. La propolona A fue la mejor de esta serie, pues presento un [EC.sub.50] = 0,32[micro]M y un indice terapeutico de 15,6 (Piccinelly et al., 2005). Las benzofenonas son precursores biogeneticos de las xantonas, las cuales tambien han presentado propiedades antiVIH. De la Clusiaceae asiatica Cratoxylum arborescens se obtuvieron 1,3,8-trihidroxi-2,4-dimetoxi-xantona, euxantona y 1,3,7-trihidroxi-6-metoxi-4,5 -disoprenilxantona. Todas mostraron actividad antiVIH en celulas infectadas y la ultima inhibio la TR con un [IC.sub.50] = 8,7[micro]g/ mi (Reutrakul et al., 2006). La mangostina y la y-mangostina aisladas de Garcinia mangostana inhibieron de manera no competitiva la TR del VIH-1 (Chen et al., 1996). Las macluraxantonas A y B aisladas de la corteza de Maclura tinctoria (Moraceae) mostraron actividad antiVIH-1 in vitro con una [EC.sub.50] = 1-2,2[micro]g/ mi; sin embargo, tambien presentaron alta toxicidad ([IC.sub.50] = 2,3-3,7[micro]g/ml) a las celulas humanas hospederas CEM-SS (Groweiss et al., 2000). E1 swertifranchisido (1,5,8(trihidroxi-3 -metoxi-7- (5',7', 3",4"tetrahidroxi-6'-C-[beta]-D-glucopiranosil-4'-oxi-8'-flavil)-xantona; Figura 3), aislada de Swertia franchetiana (Gentianaceae), inhibio la TR del VIH-1 con un [IC.sub.50] = 3[micro]g/ml (Wang et al., 1994).

[FIGURA 3 OMITIR]

Antiretrovirales de Clusiaceas de Mexico

La familia Clusiaceae en Mexico consta de ~8 generos y 21 especies. En un estudio bioprospectivo fueron evaluados los posibles efectos inhibitorios de los extractos organicos de las hojas de las 21 especies sobre la TR del VIH-1 (Huerta-Reyes et al., 2004a). Cinco especies mostraron una alta actividad inhibitoria ([greater than or equal to]70%), 7 fueron moderadamente activas (50-70%) y 9 mostraron <50% de inhibicion. La mas activa fue Calophyllum brasiliense. Tanto el extracto hexanico (77,9%), como el acetonico (81,3%) y metanolico (83,3%) mostraron actividad antiTR-VIH-1. Otras especies con alta actividad fueron Clusia massoniana y Vismia mexicana, cuyos extractos de diclorometano-metanol (1:1) presentaron 72,9% de inhibicion, mientras que Clusia guatemalensis y Vismia camparaguey inhibieron la TR en 70,8%. Como resultado del fraccionamiento biodirigido se aislaron e identificaron 10 compuestos de las hojas de C. brasiliense, de los cuales, el (+)-calanolido A, (-)-calanolido B, (+)-calanolido C, y soulatrolido fueron identificados como responsables de las propiedades antiVIH (Huerta-Reyes et al., 2004b). Por otra parte, las cromanonas, y los acidos apetalico, isoapetalico y calolongico, asi como los triterpenos, friedelina y canofilol y un biflavonoide, la amentoflavona, fueron inactivos contra la TR VIH-1. En dicho estudio, el extracto de hexano de C. brasiliense ademas inhibio la replicacion de VIH-1 en linfocitos [CD.sup.+] y resulto poco toxico sobre linfocitos [CD4.sup.+] no infectados (Huerta-Reyes et al., 2004b). Curiosamente, C. brasiliense no fue considerada como posible fuente de compuestos antiVIH en un estudio bioprospectivo previo (McKee et al., 1998). Estos autores analizaron un gran numero de especies de Calophyllum colectadas principalmente en Malasia. Su metodo inchyo un sondeo por cromatografia en capa fina utilizando (-)-calanolido B y soulattrotido como referencias. La muestra de C. brasiliense no presento dipiranocumarinas y por tanto fue excluida de estudios posteriores. Sin embargo, seis anos despues se establecio que en Mexico existen dos poblaciones de C. brasiliense que difieren en la composicion quimica de las hojas, es decir son quimiotipos. Uno sintetiza calanolidos y cromanonas, mientras que otro produce cumarinas tipo mammeas. Estas fueron inactivas contra la TR VIH-1, pero presentaron alta actividad citotoxica contra tres lineas tumorales humanas (Reyes-Chilpa et al., 2004). Los dos quimiotipos podrian ser especies diferentes, aunque actualmente solo se reconoce una especie de este genero en Mexico.

La presencia de calanolidos en uno de los quimiotipos de C. brasiliense, asi como la abundancia y amplia distribucion geografica de esta especie desde Brasil hasta Mexico (Stevens, 1980), permiten plantear la posibilidad de aproveehar estos compuestos mediante la cosecha sustentable de hojas para elaborar un fitofarmaco (extracto normalizado quimica y farmacologicamente) de bajo costo, elaborado y distribuido por los sistemas de salud publicos de la region para coadyuvar en el combate de la epidemia de SIDA. Sin embargo, esta propuesta tambien debe examinarse en el contexto legal y economico, considerando que las aplicaciones medicinales de los calanolidos estan protegidas por patentes internacionales otorgadas a companias farmaceuticas. En todo caso, este capitulo ilustra la necesidad de que los paises latinoamericanos cuenten con politicas publicas y programas nacionales de investigacion con el fin de aprovechar su biodiversidad en la solucion de sus problemas de salud. Un ejemplo es el Programa de Investigacion de Plantas Medicinales del Brasil (19821997), desafortunadamente

suspendido (Sant'Ana y Assad, 2004).

Conclusiones

Las dipiranocumarinas tetraciclicas obtenidas de la familia Clusiaceae, en especial el (+)-calanolido A, son potentes inhibidores no nucleosidos de la transcriptasa reversa del VIH-1. Las propiedades farmacologicas y toxicologicas de este compuesto lo hacen un fuerte candidato para incorporarse al cuadro de medicamentos antiVIH-1. Por otra parte, dichas cumarinas podrian eventualmente permitir el desarrollo de fitofarmacos antiVIH a partir de extractos vegetales normalizados.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Carmen Soler Claudin por permitir el uso de la Figura 1, y a la DGAPA-UNAM por el financiamiento del proyecto Busqueda de Compuestos de Origen Vegetal con Posible Actividad Inhibitoria de la Transcriptasa Reversa del VIH-1 (PAPIITIN207301).

Recibido: 13/06/2008. Modificado: 01/06/2009. Aceptado: 02/06/2009.

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Ricardo Reyes Chilpa. Biologo, Universidad Autonoma Metropolitana, Mexico. Doctor en Ciencias, Universidad Nacional Autonoma de Mexico (UNAM). Maestro en Ciencias, Instituto Nacional de Investigaciones sobre Recursos Bioticos (INIREB), Mexico. Investigador, UNAM, Mexico. Direccion: Instituto de Quimica, UNAM. Circuito Exterior, Ciudad Universitaria, Mexico 04510, D.E, Mexico. e-mail: chilpa@servidor.unam.mx

Maira Estrella Huerta Reyes. Biologa y Doctora en Ciencias Biomedicas, UNAM, Mexico. Investigadora, Centro de Investigacion Biomedica del Sur, Instituto Mexicano del Seguro Social, Xochitepec, Morelos. Mexico. e-mail: chilanguisima@yahoo.com
Configuracion                             Calanolidos     Inofium
10 [beta]                                 (R: prendo)     (R: fenilo)

traps, traps (11[alfa]-Me, 12[beta]-OH)   Calanolido A   Inofilum B
traps, cis (11[alfa]-Me, 12[alfa]-OH)     Calanolido B   Inofilum P
cis, traps (11[beta]-Me, 12[alfa]-OH)     --             Inofilum D
cis, cis 11[beta]-Me, 12[beta]-OH         Calanolido C   Inofilum A

Configuracion                             Cordatolidos
10 [beta]                                 (R: metilo)

traps, traps (11[alfa]-Me, 12[beta]-OH)   Cordatolido A
traps, cis (11[alfa]-Me, 12[alfa]-OH)     Cordatolido B
cis, traps (11[beta]-Me, 12[alfa]-OH)     --
cis, cis 11[beta]-Me, 12[beta]-OH         --

Figura 2. Cumarinas aisladas de Calophyllum spp. [alfa] y R: abajo y
arriba del plano del papel, respectivamente.

TABLA I
CUMARINAS NATURALES Y SINTETICAS CON PROPIEDADES ANTIVIH-1

Compuesto                       EC50 *       IC50 **
                                ([micro]M)   ([micro]M)

(+)-Calanolido A (1)            0,1          20,0
(-)-Calanolido B (1)            0,4          15,0
Calanolido F (2)                2,84         12,7

Inofilum B (3)                  1,40         55,0
Inofilum P (3)                  1,60         25,0
Costatolido (4) =
(-)-Calanolido B
Soulatrolido (5) = Inofilum B
(+)12-Oxocalanolido A (6)       0,40         5,8
(+)12-Oxocalanolido A (6)       0,90         >10
(-)12-Oxocalanolido A (6)       3,41         >10

Compuesto                       Fuente

(+)-Calanolido A (1)            C. lanigerum
(-)-Calanolido B (1)            C. lanigerum
Calanolido F (2)                C. lanigerium var.
                                austrocoriaceum
Inofilum B (3)                  C. inophyllum
Inofilum P (3)                  C. inophyllum
Costatolido (4) =               C. teysmannii
(-)-Calanolido B
Soulatrolido (5) = Inofilum B   C. teysmannii
(+)12-Oxocalanolido A (6)       Sintesis
(+)12-Oxocalanolido A (6)       Sintesis
(-)12-Oxocalanolido A (e)       Sintesis

* Concentracion efectiva que inhibe el 50% de la produccion viral,
50% de la infectividad o 50% de los efectos citopaticos inducidos por
el virus.

** Concentracion efectiva que reduce en 50% el crecimiento celular o
la viabilidad de celulas no infectadas.

Referencias: (1) Kashman er al. (1992), (2) McKee et al. (1996),
(3) Patil et al. (1993), (4) Fuller et al. (1994), (5) Pengsuparp et
al. (1996), (6) Xu et al. (1998).
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Author:Chilpa, Ricardo Reyes; Reyes, Maira Huerta
Publication:Interciencia
Date:Jun 1, 2009
Words:7619
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