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Mycoplasmas y anticuerpos anti-Chlamydia en semen de hombres infertiles y su relacion con la calidad seminal y los marcadores de glandulas sexuales accesorias masculinas.

Mycoplasmas and antibodies anti-Chlamydia in semen of infertile men and their relationship with seminal quality and markers of male accessory sex glands.

INTRODUCCION

La prevalencia de la infeccion de las glandulas sexuales accesorias masculinas ha tomado importancia en las ultimas decadas, aunque sus efectos sobre los parametros seminales clasicos y sobre el tracto reproductor femenino ha sido tambien tema de discusion (1-4).

La infeccion puede localizarse en una o mas de las glandulas sexuales accesorias masculinas a nivel de epididimo, vesiculas seminales o prostata, tanto unilateral como bilateralmente (5). La infeccion masculina se ha asociado con cambios seminales como descenso en el volumen, la concentracion y la movilidad espermatica; ademas de cambios en los marcadores quimicos de glandulas sexuales accesorias e incremento de las especies oxigeno reactivas (EROS) (6).

La infeccion de vesiculas seminales se ha relacionado con: alteracion de los niveles de fructosa, volumen seminal, y movilidad espermatica (7, 8). Se ha demostrado que en infeccion prostatica los niveles de acido citrico disminuyen (9) y guardan relacion inversa con la elastasa leucocitaria (10). Por otra parte se ha asociado descenso de marcadores prostaticos con oligoastenoteratozoospermia (10, 11). La epididimitis puede producir astenozoospermia y los productos secretados por esta glandula tienden a ser bajos, sin mostrar cambios en la concentracion de leucocitos (11). El descenso de un importante marcador epididimario como la actividad de [alfa]-glucosidasa neutra (AGN) se ha asociado con obstruccion del transporte espermatico entre epididimo y conducto eyaculatorio, en hipoandrogenismo, y durante o despues de un estado de infeccion/inflamacion (12, 13).

Se han encontrado diversos microorganismos en los cultivos seminales de hombres infertiles con y sin leucocitospermia donde se destacan Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Chlamydia trachomatis, E. coli, Klebsiella, Proteus, Enterococcus, Staphylococcus y Neisseria gonorrheae entre otros (14-16).

A menudo las infecciones causadas Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum son asintomaticas e inespecificas (17-20). Se ha considerado a Chlamydia trachomatis (Cht) el microorganismo mas comun en las enfermedades de transmision sexual hasta en un 40% de las parejas infertiles (21-22). Los anticuerpos anti-Chlamydia trachomatis (Ac-antiCht) del iso-tipo IgA se han asociado con una respuesta inflamatoria del tracto genital masculino, pero no con alteraciones de los parametros seminales (23). Se han encontrado titulos altos de IgA (Ac-antiCht) en suero de hombres infertiles; la IgG (Ac-antiCht) se ha correlacionado con baja movilidad, baja concentracion espermatica, teratozoospermia, y leucocitospermia (24-25).

Entre las especies de Mycoplasma se considera que Ureaplasma urealyticum afecta el contaje espermatico y la movilidad, generando infertilidad (14, 26, 27), mientras que el impacto del Mycoplasma hominis sobre los parametros seminales y la fertilidad han sido tema de discusion (14, 27).

U. urealyticum se ha detectado en el 33,7% de las muestras de semen de hombres infertiles, en las cuales se observo descenso de la [alfa]-glucosidasa neutra y de la calidad espermatica, sin cambios en el volumen seminal, la fructosa ni la fosfatasa acida (28). En otro estudio se observo teratozoospermia con aumento en la concentracion de leucocitos y de especies oxigeno reactivas asociados a la presencia de U. urealyticum (29).

Los objetivos de este estudio fueron evaluar la calidad seminal y los niveles de marcadores quimicos de glandulas sexuales accesorias en hombres infertiles positivos y negativos para la presencia de Mycoplasmas, otros germenes y anticuerpos antiChlamydia.

PACIENTES Y METODOS

Se estudiaron 300 hombres infertiles de edades comprendidas entre 20 y 57 anos. Se consideraron infertiles porque no habian logrado concebir durante el transcurso de un ano manteniendo relaciones sexuales frecuentes (2 a 3 veces por semana) sin el uso de metodos anticonceptivos. Los individuos asistieron por infertilidad primaria o secundaria al Centro de Diagnostico de Infertilidad y Enfermedades Geneticas (CEDIEG) de la Facultad de Farmacia y Bioanalisis, Universidad de Los Andes, Merida-Venezuela, para ser evaluados. Cada participante fue informado sobre la naturaleza, importancia, objetivos y alcances de la investigacion. A aquellos que decidieron participar voluntariamente se les solicito el consentimiento informado por escrito. Para el estudio se excluyeron pacientes clinicamente evaluados con hipogonadismo, varicocele, hidrocele o diabetes. El estudio fue realizado siguiendo los lineamientos establecidos en la Declaracion de Helsinki para investigacion en humanos resenados en el Codigo de Bioetica y Bioseguridad del FONACIT (30).

Tanto las muestras de semen como de suero sanguineo de los 300 hombres fueron muestras individuales de cada paciente. Se determino la frecuencia de los microorganismos en semen y su relacion con los parametros seminales. Se compararon los marcadores quimicos glandulares en los grupos con Ac-antiCht, M. hominis, U. urealyticum y sin infeccion.

Obtencion y procesamiento de las muestras

Espermograma: las muestras de semen fueron obtenidas por masturbacion siguiendo las pautas establecidas por el quinto manual de la Organizacion Mundial de la Salud para el analisis de semen (31).

Seguida la licuefaccion del semen se tomaron 1,5 mL de cada muestra, 1,0 mL se sometio a centrifugacion 1500 g durante 10 minutos para obtener plasma seminal y se guardaron en dos alicuotas de 200 [micron]L c/u a -20[grados]C para (A) la determinacion de fructosa, acido citrico y 1,4 [alfa]-glicosidasa neutra. (B) Los 0,5 mL de semen restante se destinaron para cultivo en placa de bacterias aerobicas y microaerofilas facultativas, cultivo en pozos para Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Candida albicans y Trichomonas sp y (C) medicion de los anticuerpos (Ac) IgA.

Los pacientes con volumenes seminales muy bajos (<0,5 mL) se evaluaron en dos fases, primero el analisis seminal y los marcadores glandulares, y en la segunda fase se solicito una nueva muestra para el analisis microbiologico y deteccion de Ac IgA antiCh.t en un transcurso <15 dias.

Marcadores de glandulas sexuales accesorias masculinas

Fructosa: se determino mediante la prueba de Seliwanoff, para lo cual empleamos resorcinol al 0,5% y HCL concentrado y se expreso en [micron]mol/eyaculado (32, 33).

Acido citrico: se determino mediante reaccion colorimetrica establecida en el metodo de Chambon y Roe que consistio en incubar el plasma seminal con anhidrido acetico al 82% y piridina al 18% al frio, el producto de condensacion de citrato en medio anhidrido se midio espectrofotometricamente y la concentracion se expreso en [micron]mol/eyaculado como indicador de la funcion prostatica (34).

1,4-[alfa]glicosidasa neutra (AGN): se midio de acuerdo al metodo fotometrico (35, 36). La actividad de AGN se calculo midiendo el producto de hidrolisis paranitrofenol tras 2 horas de incubacion a 37[grados]C pH 6,8 y se expreso en UI/eyaculado.

Evaluacion microbiologica

Cultivos en placas: a fin de determinar la presencia de cocos y bacilos aerobicos y microaerofilos facultativos se realizaron cultivos del sedimento seminal en placas de agar para el descarte de Enterobacterias, Neisseria gonorroheae, Streptococcus sp y Staphylococcus sp. Se utilizaron 0,2 mL de semen fresco en 1,8 mL de solucion salina fisiologica esteril, cada muestra fue mezclada se centrifugo a 1.500 g por diez minutos para remover el plasma seminal, se descartaron 1,8 mL del sobrenadante y 0,2 mL del sedimento obtenido fue resuspendido para el cultivo en placa con asa calibrada. El sedimento libre de plasma seminal fue empleado con el objeto de remover sustancias bacteriostaticas propias del semen (37). Los sedimentos se sembraron en 4 placas de agar: sangre 5% (5%C[O.sub.2]), chocolate (5%C[O.sub.2]), Thayer-Martin, manitol salado y Mc Conckey, y se incubaron a 37[grados]C durante 48 horas. A los cultivos positivos se les realizo su antibiograma especifico (38).

Cultivos en pozos de Mycoplasmas M. hominis y U. urealyticum: El semen fue diluido 1:10 en solucion salina fisiologica esteril (0,2 mL+1,8 mL) y sembrado en pozos con medio enriquecido A7 (Mycoplasma System Plus, Diagnostici Liofilchem). El estuche contenia pozos de identificacion para M. hominis y U. urealyticum; con pozos individuales. La identificacion, cuantificacion de colonias y susceptibilidad se realizaron siguiendo las instrucciones de los fabricantes del estuche de diagnostico. El estuche comercial contenia adicionalmente un pozo TR/Y con medio de cultivo para el descarte de Candida albicans y Trichomonas sp., mediante la observacion microscopica de clamydiosporas, hifas o trofozoitos a las 48 h de incubacion.

Determinacion de anticuerpos (Acs) anti Chlamydia

Anticuerpos locales IgA Ac-antiCht: Se uso un estuche comercial (Sero ELISA; El Diagnostico de Savyon, Beer-Sheva, Israel). El procedimiento se realizo segun las instrucciones del fabricante. Los controles positivos y negativos fueron incluidos en cada ensayo.

Anticuerpos en sangre periferica IgG Ac-antiCht: A cada paciente se le extrajeron 3 mL de sangre venosa. Post coagulacion los sueros se obtuvieron por centrifugacion a 1500 g durante 15 minutos y se guardaron a -20[grados]C hasta el momento del analisis, siguiendo las mismas pautas sugeridas por el estuche comercial para IgG Ac-antiCht (Sero ELISA; El diagnostico de Savyon, Beer-Sheva, Israel).

Valores de absorbancia por encima del limite para anticuerpos IgG (perifericos) e IgA (locales) se consideraron positivos para C. trachomatis.

El analisis descriptivo de las variables categoricas se realizo a traves de frecuencias simples y porcentajes simples. Se empleo la prueba de t-student para el analisis inferencial, tomando en cuenta un valor de p < 0,05. Para el analisis estadistico se utilizo el programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS) version 10.0.

RESULTADOS

El estudio de las muestras obtenidas de los 300 pacientes determino que 141 de ellos (46,9%) tenian cultivos positivos o la presencia de Ac-antiCht IgA y/o IgG. Los Ac-antiCht estaban presentes en un 21,3% de los 300 pacientes. De los 64 pacientes positivos para Ac-antiCht 42,3% presentaron las isoformas IgA, 18,7% la forma IgG y ambas un 39%. En los cultivos de semen se identificaron 8 microorganismos diferentes cuya distribucion se encuentra en la Tabla I. Diez de estos 300 pacientes fueron positivos para dos o mas germenes ([mayor que o igual a] 2) simultaneamente mientras que cinco presentaron Ac-antiCht simultaneamente con otro microorganismo.

Al comparar las caracteristicas seminales de los grupos Ac-antiCht, Mycoplasmas (M. hominis + U. urealyticum) y el grupo denominado positivo para otros patogenos (Staphylococcus sp + Streptococus sp + E. coli + Klebsiella sp + Enterobacter sp) con el grupo sin infeccion, no se encontraron diferencias significativas en cuanto al valor promedio de volumen, produccion espermatica, morfologia ni movilidad. En el grupo positivo para Ac-antiCht la concentracion de leucocitos fue significativamente mas alta (p<0,001). Los pacientes con infeccion por dos o mas germenes no se incluyeron en este estudio (Tabla II).

La valoracion bioquimica de los marcadores glandulares revelo que el marcador de vesiculas seminales (fructosa) se encontro disminuido cuando estaban presentes los Ac-antiCht (p<0,001) y los Mycoplasmas (p<0,01); el marcador prostatico (ac. citrico) no presento diferencias significativas en ninguno de los grupos; el marcador epidimario ([alfa]-glucosidasa) estaba significativamente reducido en el grupo con Ac-antiCht (p<0,001) y Mycoplasmas (p<0,005); y se observo aumento significativo del pH en el grupo con Ac-anti Cht al ser comparados con el grupo sin infeccion. Los pacientes con [mayor que o igual a] 2 germenes no se incluyeron en estos grupos (Tabla III).

DISCUSION

La determinacion de anticuerpos IgG e IgA Ac-anti Cht como indicador de que los pacientes han estado o estan expuestos a este patogeno, y la deteccion de otros patogenos por cultivo de semen, demostro que la mayor incidencia en pacientes infertiles positivos para infeccion correspondia a la presencia de anticuerpos anti Ch.t (64/141), coincidiendo con otras investigaciones con similares resultados. Cht no fue detectada directamente sino por la determinacion de sus anticuerpos, considerando su importancia diagnostica porque demuestran si el paciente ha estado en contacto reciente o pasado con Cht. Especialmente la exposicion pasada al patogeno (IgG antiCht) se ha asociado con efectos negativos en el tracto genital masculino (24, 25).

De los 64 pacientes positivos para Ac-antiCht, 52 presentaron el isotipo IgA, lo que indicaria una respuesta inmunologica activa a nivel local, tal como lo han senalado otros autores en poblaciones de hombres infertiles (21, 22). Los Ac-anti Cht tipo IgA se han asociado con una respuesta inflamatoria del tracto genital masculino, pero no con los parametros seminales (23, 24, 39), lo que se confirma con lo observado en este estudio. La evaluacion seminal en este grupo revelo diferencias significativas en lo que se refiere a leucocitospermia y alteraciones de pH; ambos parametros se asocian a presencia de infecciones en el tracto genital masculino y a una activacion de la respuesta inmunologica (36). Por otra parte los grupos de pacientes positivo para Ac-anti Cht y para Mycoplasmas demostraron tener valores significativamente mas bajos en los marcadores quimicos de las glandulas accesorias correspondientes a fructosa y [alfa]-glucosidasa, lo que indicaria alteraciones sobre las secreciones provenientes de vesiculas seminales y el epididimo. El dano tisular causado por infeccion o por inflamacion puede alterar la funcion secretora de las glandulas accesorias que a su vez repercutirian en la fisiologia espermatica (39, 40).

La incidencia de M. hominis y U urealyticum alcanzaron un 8 y 6% respectivamente. Este grupo analizado en conjunto y en comparacion con el grupo negativo para infeccion, demostro que no existian diferencias significativas en sus parametros seminales, lo que coincide con los resultados obtenidos por Sweih en 2011 (41); sin embargo, al igual que en los pacientes positivos para Ac-anti Cht los valores de fructosa y [alfa]-glucosidasa fueron significativamente mas bajos que en el grupo negativo para infeccion, los cuales se asocian con baja funcion glandular, en particular epididimo y vesiculas seminales. Si los parametros seminales: volumen, concentracion, morfologia, movilidad resultan ser normales, existe el riesgo de que la infeccion pase desapercibida si no se miden los valores de marcadores de glandulas accesorias y no se procede de rutina al despistaje de infecciones en el tracto genital masculino, tal como re realizo en este estudio.

La secrecion de las glandulas accesorias y probablemente la funcion espermatica pueden verse afectadas por la presencia de M. hominis, U. urealyticum y la presencia Ac-anti Cht.

El diagnostico junto al antibiograma permitiria controlar la resistencia a los antibioticos. Adicionalmente, en muchos de estos casos los antimicrobianos han tenido limitada eficacia porque se trata de compartimientos anatomicos con barreras que pueden limitar su alcance como por ejemplo la hemato-prostatica (42); las lesiones tisulares son mayores a medida que avanza el tiempo, por ejemplo las prostatitis responden mas rapido al tratamiento que las prostato-vesiculitis y prostato-vesiculo-epididimitis, es decir, se comprometen mas glandulas a medida que avanza el tiempo (6). Ademas, algunos microorganismos tienden a encapsularse o se adhieren con mas fuerza al glicocalix de la matriz extracelular de la glandula, o probablemente los cambios de pH local de vesiculas seminales (alcalino) o prostata (acido) (43-45) limitan la eficacia antimicrobiana.

Se demostro que el 42,3% de las muestras seminales de pacientes infertiles eran positivas para diferentes patogenos en el tracto genital masculino. Este hallazgo justifica plenamente la necesidad de incluir en la evaluacion del hombre infertil el despistaje de infecciones y la determinacion de marcadores quimicos de las glandulas sexuales accesorias masculinas para aplicar la terapia mas adecuada y eficiente.

En conclusion, los cambios seminales sugestivos de infeccion sugieren la necesidad de un protocolo de diagnostico de espermograma, marcadores quimicos de glandulas sexuales masculinas, con un cultivo microbiologico adecuado, donde se descarten M. hominis, U. urealyticum y anticuerpos anti-Chlamydia trachomatis como germenes frecuentes asociados a infertilidad.

Recibido: 20-09-2011. Aceptado: 17-05-2012

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Ricardo Lozano-Hernandez [1], Giovanny Vivas-Acevedo [1] y Maria Gladys Munoz de Vera [2].

[1] Centro Diagnostico de Infertilidad y Enfermedades Geneticas (CEDIEG), Facultad de Farmacia y Bioanalisis, Universidad de Los Andes. Merida, Venezuela.

[2] Departamento de Biologia de los Organismos, Universidad Simon Bolivar. Caracas, Venezuela.

Autor de correspondencia. Ricardo Lozano-Hernandez. Centro Diagnostico de Infertilidad y Enfermedades Geneticas (CEDIEG), Facultad de Farmacia y Bioanalisis, Universidad de Los Andes. Merida, Venezuela. Correo electronico: ricardolozanoh@hotmail.com. Telefonos 0274-2403410 y 0416-9764664.
TABLAI
FRECUENCIA DE BACTERIAS Y DE ANTICUERPOS
ANTI-Chlamydia IDENTIFICADOS EN LOS PACIENTES

                                           n     %

Sin infeccion                             159   53,1
Infeccion                                 141   46,9
  C. trachomatis                           64   21,3
  U. urealyticum                           24    8,0
  M. hominis                               18    6,0
  Staphylococcus sp                        10    3,3
  Streptococus sp                           7    2,3
  E. coli                                   3    1,0
  Klebsiella sp                             3    1,0
  Enterobacter sp.                          1    0,3
  N. gonorrhoeae                            1    0,3
  [greater than or equal to] 2 germenes    10    3,3

Total                                     300

TABLA II

CARACTERISTICAS SEMINALES EN HOMBRES INFERTILES SIN INFECCION Y
POSITIVOS PARA MYCOPLASMAS, OTROS PATOGENOS Y ANTICUERPOS ANTI-
Chlamydia trachomatis

                            Sin infeccion          Positivos para
                                n=159               M. hominis y
                                                   U. urealyticum
                                                        n=42

Volumen seminal (mL)      3,1 [+ o -] 0,13      2,8 [+ o -] 0,22

Produccion espermatica   196,5 [+ o -] 13,21   186,4 [+ o -] 22,54
([10.sup.6]/eyaculado)

Morfologia                28,4 [+ o -] 0,97     24,4 [+ o -] 1,49
(% de normales)

Esp. Moviles              40,4 [+ o -] 1,72     41,1 [+ o -] 3,41
Progresivos (%)

Leucocitos                0,6 [+ o -] 0,04      0,7 [+ o -] 0,06
([10.sup.6]/mL)

                           Otros patogenos         Con Ac-antiCht
                                 n=25               IgA y/o IgG
                                                        n=64

Volumen seminal (mL)      3,3 [+ o -] 0,26      3,0 [+ o -] 0,13

Produccion espermatica   218,6 [+ o -] 45,14   157,7 [+ o -] 17,64
([10.sup.6]/eyaculado)

Morfologia                26,2 [+ o -] 2,22     29,5 [+ o -] 1,88
(% de normales)

Esp. Moviles              44,2 [+ o -] 4,78     42,6 [+ o -] 2,29
Progresivos (%)

Leucocitos                0,7 [+ o -] 0,06      1,4 [+ o -] 0,14
([10.sup.6]/mL)

(a) P<0,001. Valores promedio  [+ o -]  error estandar (EE).
Morfologia (% de formas normales); espermatozoides moviles
progresivos: rapidos + lentos. Pacientes positivos para
Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum [Pos(+) Mh y Uu];
otros patogenos y con Anticuerpos anti-Chlamydia (Ac-antiCht) IgA
y-o IgG comparados con pacientes sin infeccion: a p<0,001 t-
student no pareado de una cola.

TABLA III
MARCADORES GLANDULARES Y pH EN HOMBRES INFERTILES SIN INFECCION
Y POSITIVOS PARA MYCOPLASMAS, OTROS PATOGENOS Y ANTICUERPOS ANTI-
Chlamydia trachomatis

Marcador                  Sin infeccion          Positivos para
                              n=159               M. hominis y
                                                 U. urealyticum
                                                      n=42

Fructosa [micron]       44,4 [+ o -] 2,79    38,0 [+ o -] 2,23 (a)
mol/eyac

Ac.citrico             75,86 [+ o -] 3,01     80,1 [+ o -] 7,85
[micron]mol/eyac

[alfa]-glucosidasa     69,1 [+ o -] 2,02    21,2 [+ o -] 1,37 (b)
U/eyac

pH                      7,8 [+ o -] 0,02      7,9 [+ o -] 0,04

Marcador                    Otros patogenos
                                 n=25

Fructosa [micron]          63,5 [+ o -] 10,6
mol/eyac

Ac.citrico                 73,0 [+ o -] 6,8
[micron]mol/eyac

[alfa]-glucosidasa         58,8 [+ o -] 3,6
U/eyac

pH                         7,8 [+ o -] 0,06

Marcador                  Con Ac-antiCht IgA
                                y/o IgG
                                 n=64

Fructosa [micron]         17,3 [+ o -]  0,8 (c)
mol/eyac

Ac.citrico                 64,9 [+ o -] 4,0
[micron]mol/eyac

[alfa]-glucosidasa       16,5 [+ o -] 9,7 (c)
U/eyac

pH                        8,1 [+ o -] 0,05 (c)

Valores promedio  [+ o -]  error estandar (EE). Concentracion de
fructosa y acido citrico en [micron]mol-eyaculado, actividad de
[alfa]-glucosidasa en Unidades-eyaculado (U-eyac). Pacientes
positivos para Mycoplasma hominis y Urea-plasma urealyticum,
otros patogenos y con Anticuerpos anti-Chlamydia (Ac-antiCht) IgA
y-o IgG comparados con pacientes sin infeccion: (a) p<0,01; (b)
p<0,005; (c) p<0,001 t-student no pareado de una cola.
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Author:Lozano-Hernandez, Ricardo; Vivas-Acevedo, Giovanny; Munoz de Vera, Maria Gladys
Publication:Investigacion Clinica
Article Type:Perspectiva general de la enferm
Date:Jun 1, 2012
Words:4885
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