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Mollicutes isolation and PCR on ovine vaginal mucous and its association with reproductive problems in Piedade, SP, Brazil/Isolamento e PCR para deteccao de Mollicutes em muco vaginal e sua associacao com problemas reprodutivos em ovinos criados na regiao de Piedade, Sao Paulo, Brasil.

INTRODUCAO

A familia Mycoplasmatacea, pertencente a classe Mollicutes, e composta por 14 generos, sendo os de interesse veterinario Mycoplasma, Ureaplasma e Acheloplasma (BERGEY'S, 2001). Considerados os menores microrganismos de vida livre capazes de autoreplicacao (RAZIN, 2006), essas bacterias tem predilecao por membranas serosas ou mucosas (CLAYDE, 1983). As infeccoes por micoplasmas em ovinos podem apresentar-se de forma aguda, porem as manifestacoes cronicas sao mais frequentes. Essas infeccoes podem resultar em disturbios reprodutivos em pequenos ruminantes causando vulvites, vaginites, cervicites e endometrites (RANA et al., 1993) com consequentes perdas economicas na ovinocultura brasileira. Na especie bovina, o Ureaplasma diversum e um dos agentes causadores da vulvovaginete granular ja relatada em rebanhos brasileiros (CARDOSO et al., 2000), assim como o M. bovigenitalium e M. canadenses responsaveis por surtos de vulvovaginite granulopapular (LYSNYANSKY et al., 2009).

O primeiro relato de micoplasmose em ovinos foi realizado na Australia (COTTEW et al., 1974). Mycoplasma (M.) ovine/caprine sorotipo 11, ainda nao classificado como especie, conhecido como cepa 2D foi relacionado a casos de vulvovaginite e problemas reprodutivos em ovinos e caprinos na Australia, Estados Unidos, India, Inglaterra, Franca e Nigeria (NICHOLAS et al., 1999). Inoculacoes experimentais da cepa acima citada causaram quadro de vulvovaginite granular (VVG), caracterizada por edema de vulva, descargas uterinas, vulvitis, vaginite, cervicite e endometrite (KUMAR et al., 1992). Outras especies foram isoladas do trato reprodutivo com poder patogenico, sao elas: M. mycoides subsp. mycoides, M. bovigenitalium, M. agalactiae, M. mycoides subps. capri, M. capricolum, M. arginini, M. alkalencens e Acholeplasma spp. (JONES et al., 1983; KAPOOR et al., 1984). Em rebanhos infectados por ureaplasmas, verificou-se diminuicao na taxa de natalidade, aumento em morte neonatal e repeticao de cio (BALL et al., 1984). LIVINGSTON JUNIOR & GAUER (1983) consideraram a possibilidade de os ureaplasmas estarem associados as perdas reprodutivas devido a falhas na concepcao, na implantacao do embriao no utero ou interferencia no desenvolvimento fetal. A infeccao por ureaplasmas pode resultar em placentite, mas o abortamento nao indica necessariamente a ocorrencia de surto por esse agente (PUGH, 2005). No Brasil, existem poucos estudos que avaliam o envolvimento dos Mollicutes as alteracoes reprodutivas nas especies ovinas e caprinas e esse tema ainda deve ser mais explorado. GREGORY et al. (2004) descreveram o primeiro relato de isolamento desse agente obtido de semen e muco vaginal de ovelhas provenientes do Estado de Sao Paulo. Este estudo teve por objetivo avaliar a presenca das micoplasmoses em pequenos ruminantes e seu impacto na reproducao.

MATERIAL E METODOS

Foram colhidas as amostras durante todo o ano de sessenta ovelhas mesticas, adultas, de aproximadamente 60kg, pertencentes a seis rebanhos situados no municipio de Piedade no estado de Sao Paulo (LA -23[degrees]42'43", LO 47[degrees]25'40') e onde foram utilizados dos rebanhos A, B, C, D, E e F, respectivamente, 19, 17, 11, 5, 5, e 3 ovelhas. Estas foram avaliadas pelo exame ginecologico, sendo 20 sadias e 40 apresentando vulvovaginite, e submetidas a colheita de muco vaginal por meio da friccao de zaragatoa na mucosa. O muco vaginal foi transportado em 3mL de meios especificos, SP4 para micoplasma e UB para ureaplasma, sob refrigeracao. O processamento das amostras foi realizado em periodo inferior a 24 horas apos colheita. Cinquenta microlitros de cada meio de transporte, contendo a amostra, foram inoculados em 1,8mL de meio (UB e SP4), homogeneizados e realizadas tres diluicoes decimais de cada amostra. Da ultima diluicao (10-4), foram retirados 50[micro]L e semeados em meio solido (1% de agar) SP4 e UB. As culturas foram incubadas por 15 dias a 37[degrees]C em aerobiose para o meio UB e microaerofilia para o meio SP4. O crescimento foi caracterizado inicialmente pela producao de colonias em forma de "ovo frito" e pela utilizacao da glicose e/ ou arginina, resultando, respectivamente, em acidez ou alcalinizacao dos meios liquidos (RAZIN & TULLY, 1983). Os ureaplasmas foram caracterizados pela hidrolise da ureia, que resulta em alcalinizacao do meio UB, producao de colonias de coloracao marrom, devido a precipitacao de cations de manganes, e pela aparencia granulosa (RUHNKE & ROSENDAL, 1994). Para a obtencao do DNA, destinado a PCR, foram utilizados 20mL de cultura de cada cepa de referencia de Ureap1asma (U.) diversum ATCC sorogrupo A (49782), A. laidlawaii (PG-8), M. arginini (G-230), M. bovis (Donetta) e um mililitro do material clinico, submetidos a extracao pelo metodo da fervura descrito por FAN et al. (1995). A PCR foi realizada com os primers para classe Mollicutes (GPO e MGSO) (VAN KUPPEVELD et al., 1993), para o genero Ureaplasma (UGPF e UGPS) (LAUERMAN, 1998) e a especie A. laidlawii (UNI e ACH3) (DUSSURGETT & DUSSOIX, 1994), localizados na regiao interna do gene 16S do rRNA. (Tabela 1). Para a reacao em cadeia da polimerase dos Mollicutes foi adicionado a um microtubo (0,2mL) 50pmol de cada primer, 2U de Taq DNA polimerase, 2,0mM de MgCL, 100[micro]M de deoxiribonucleotideos trifosfato (dNTP), 5 [micro]L da amostra de DNA e agua ultrapura ate o volume final de 50[micro]L. A amplificacao foi realizada em termociclador (PCR Express Thermal Cycler--Thermo Hybaid), programado para um ciclo de 94[degrees]C durante cinco min, 35 ciclos de 94[degrees]C durante 30s, 55[degrees]C durante 30s, 72[degrees]C durante 30s e um ciclo final de 72[degrees]C por 10 min. Para a reacao em cadeia da polimerase do genero Ureaplasma spp., foi adicionado a um microtubo (0,2mL) 20pmol de cada primer, 1,25U de Taq DNA polimerase, 2,0mM de Mg[Cl.sub.2], 50 [micro]M de deoxiribonucleotideos trifosfato (dNTP), 5[micro]L da amostra de DNA e agua ultrapura ate o volume final de 50[micro]L. A amplificacao foi realizada em termociclador programado para: 40 ciclos a 94[degrees]C durante 30s, 55[degrees]C durante 30s, 72[degrees]C durante 60s e um ciclo final de 72[degrees]C por cinco min. Para a reacao em cadeia da polimerase de A. laidlawii, foi adicionado a um microtubo (0,2mL) 40pmol de cada primer, 1U de Taq DNA polimerase, 1,2mM de Mg[Cl.sub.2], 200[micro]M de deoxiribonucleotideos trifosfato (dNTP), 1pL da amostra de DNA e agua ultrapura ate o volume final de 50[micro]L. A amplificacao foi realizada em termociclador programado para: um ciclo de 95[degrees]C por 5min, 30 ciclos de 95[degrees]C por 30s, 64[degrees]C por 1,5min, 72[micro]C por 1,5min e um ciclo final de 72[degrees]C por 10min. Os produtos da PCR (10[micro]L) foram separados por eletroforese em gel de agarose a 1,5%, contendo 10 [micro]g [mL.sup.-1] de brometo de etidio em tampao TAE (40mM Tris-acetato; 2mM EDTA, pH 8,0). A visualizacao e fotodocumentacao dos produtos foram realizadas sob luz ultravioleta. O marcador de peso molecular utilizado foi 100pb DNA Ladder (Invitrogen).

RESULTADOS

Foi realizado o exame microbiologico de 60 amostras de muco vaginal em meio SP4 e, destas, 42 sofreram contaminacao por bacterias ambientais e foram descartadas. As 18 amostras nao contaminadas resultaram em seis (33%) isolamentos. No cultivo das 60 amostras cultivadas em meio UB, 22 nao apresentaram contaminacao, resultando em sete (31,8%) isolados (Tabela 2). Os isolados de Mollicutes eram provenientes de amostras de animais que possuiam ou nao no momento do exame ginecologico vulvovaginite, enquanto os isolados de Ureaplasma spp provinham de ovinos com historico de disturbios reprodutivos. Foi realizada a triagem das 60 amostras de muco vulvovaginal com o PCR da classe Mollicutes que resultaram em 45 (75%) reacoes positivas. Quando as amostras foram submetidas a PCR genero Ureaplasma, o resultado foi de 40 reacoes positivas (66,7%). A PCR especie A. laidlawii detectou apenas uma amostra positiva (1,7%). Dentre as amostras positivas para Mollicutes, 88,9% (40/45) foram positivas para o genero Ureaplasma. Os resultados obtidos pela associacao de presenca ou ausencia de vulvovaginite com os resultados das PCRs (Mollicutes e Ureaplasma) encontram-se na tabela 3.

DISCUSSAO

A associacao dos molicutes aos problemas reprodutivos em ovinos e pouco pesquisada no Brasil e em outros paises. O diagnostico ineficaz pode ser decorrente do desconhecimento dessas enfermidades por tecnicos e medicos veterinarios, alem da ausencia de laboratorios especializados (BUZINHANI et al., 2007). No Brasil, ha relatos de isolamentos de M. conjuntivae de ceratoconjuntivite caprina (GREGORY et al., 2003) e ovina (ALMEIDA NETO et al., 2004), Ureaplasma spp em muco vulvovaginal/semen de ovinos e caprinos (GREGORY et al., 2004) e M. agalactiae em leite e liquido sinovial de cabras apresentando artrite e mastite (AZEVEDO et al., 2006). No entanto, as dificuldades no isolamento, devido as necessidades de meios de cultura seletivos, tempo prolongado de incubacao e contaminacao por bacterias indesejaveis, restringem os estudos epidemiologicos a poucos centros de pesquisas no Brasil. Neste trabalho, 70% das amostras cultivadas em SP4 e 63,3% em UB apresentaram contaminacao. O alto percentual de culturas contaminadas evidencia a necessidade de aprimoramento dos meios de cultura e das tecnicas de cultivo destinados ao isolamento de micoplasmas e ureaplasmas em ovinos. Todos os isolados obtidos de ureaplasmas foram de animais apresentando algum sinal clinico de problema reprodutivo, o que sugere a implicacao desse microrganismo em processos patogenicos. Foram descritos o envolvimento dos molicutes nas enfermidades do trato genital de pequenos ruminantes em diferentes paises (COTTEW et al., 1974; DOIG & RUHNKE, 1977; BALL & MCCAUGHEY, 1982; JONES et al., 1983; KAPOOR et al., 1984; LIVINGSTON JUNIOR & GAUER, 1983; NICHOLAS et al., 1999; KIDANEMARIAM et al., 2005). A importancia desses microrganismos na especie bovina como causador de infeccoes que resultam em abortos e infertilidade, alem de surtos da sindrome de vulvovaginite granular (VVG), comprovou envolvimento dos molicutes como patogenos do sistema reprodutivo (RUHNKE & ROSENDAL, 1994; CARDOSO et al., 2000; LYSNYANSKY et al., 2009). Essas bacterias sao consideradas oportunistas por excelencia e a sua patogenicidade, na grande maioria das especies, pode ser questionada, principalmente pela sua presenca em hospedeiros sadios. Fatores predisponentes inerentes aos hospedeiros, ainda nao conhecidos, e a presenca dos molicutes podem estar associados a manifestacao das enfermidades reprodutivas. Em um dos trabalhos de LIVINGSTON JUNIOR & GAUER (1975) foi relatado que entre nove sorotipos de micoplasmas estudados, somente um demonstrou correlacao entre seu isolamento e presenca de alteracoes clinicas no trato genital de ovinos, concordando com varios autores (COTTEW et al., 1974; LIVINGSTON JUNIOR & GAUER, 1983; KAPOOR et al., 1984; NICHOLAS et al., 1999). A resposta imune nas micoplasmoses em animais adultos tem sido indicativo de importante fator da persistencia do microrganismo no trato genital e na ausencia ou presenca de patologias. Para o diagnostico dos molicutes, o cultivo pode ser prejudicado pelo tipo de amostra clinica, metodo de colheita, transporte e tempo no processamento das amostras (RIZZO, 2006). Esses fatores limitantes para o isolamento de molicutes justificam a utilizacao de tecnicas moleculares no diagnostico de rebanhos animais, sendo a PCR de ampla aplicabilidade na Medicina Veterinaria para deteccao desses agentes em diferentes estagios da doenca (RIZZO, 2006; RAZIN & TULLY, 1983). A PCR classe Mollicutes e utilizada principalmente como triagem em rebanhos, nao permitindo identificacao de generos e especies, pois amplifica a regiao conservada do 16S rRNA presente nos generos Achopleplasma, Mycoplamsa, Ureaplasma e Spiroplasma. Neste trabalho, foram obtidas reacoes positivas na PCR classe Mollicutes em amostras provenientes de animais sadios e com vulvovaginite e no teste de correlacao nao houve associacao entre as alteracoes reprodutivas e a presenca desses microrganismos. Na Irlanda do Norte, houve diferencas na patogenicidade entre micoplasmas da mesma especie, isolados de diferentes rebanhos, sendo algumas estirpes patogenicas e outras nao (MCCAUGHEY et al., 1979; BALL & MCCAUGHEY, 1982;). A PCR genero Ureaplasma foi utilizada para avaliar a frequencia desse genero nos rebanhos ovinos e, como na PCR classe Mollicutes, nao houve associacao entre vulvovaginite e PCR positiva. Estes ureaplasmas de origem ovina e caprina nao receberam ainda a designacao de especie, sendo apenas conhecidas suas caracteristicas sorologicas, nas quais e fundamentada a classificacao em nove sorotipos (HOWARD & POCOCK, 1983), sendo o sorotipo IX associado a infertilidade (LIVINGSTON JUNIOR & GAUER, 1978). Alem disso, a PCR e amplamente utilizada na Medicina Veterinaria como diagnostico das doencas infecciosas, entretanto, sua interpretacao deve ser criteriosa, pois detecta o material genetico dos microrganismos, o que nao permite afirmar a viabilidade destes. O diagnostico definitivo deve ser realizado pela associacao dos achados clinicos aos resultados laboratoriais, o que permite a preconizacao do tratamento adequado e consequente controle da doenca no rebanho.

No Brasil, o diagnostico restrito a poucos laboratorios e ausencia de diagnosticos especificos para molicutes, causadores de problemas reprodutivos em ovinos, nao permite avaliar a frequencia desses agentes em nossos rebanhos. Essa dificuldade deve alertar a vigilancia epidemiologica para estabelecer estrategias de controle mais aprimoradas sobre esses agentes infecciosos pouco estudados (DAMASSA et al., 1983; PUGH, 2005; RIZZO, 2006).

CONCLUSAO

Foi confirmada a presenca de Ureaplasma spp e Mycoplasma spp, por meio de isolamento, no rebanho ovino do Estado de Sao Paulo, Brasil. Das 60 amostras estudadas, obteve-se o isolamento de Ureaplasma spp em 31,8% em amostras nao contaminadas, enquanto a deteccao por PCR de Ureaplasma spp foi maior, ou seja, 66,7%. A ocorrencia de isolamento de Ureaplasma spp, somente em ovinos com problemas reprodutivos, sugere a associacao desse microrganismo como patogeno do trato reprodutivo.

COMITE DE ETICA E BIOSSEGURANCA

O projeto intitulado "Avaliacao clinica e estudo da prevalencia de femeas ovinas infectadas por micoplasmas na regiao de Piedade, SP--Avaliacao da infeccao sobre a produtividade do rebanho" foi aprovado pela comissao de bioetica da Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia da Universidade de Sao Paulo na data de 26 de setembro de 2005.

REFERENCIAS

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Huber Rizzo (I) Enoch Brandao de Sousa Meira Junior (I) Rosangela Claret de Oliveira (II) Mauricio Yamaguti (II) Melissa Buzinhani (II) Jorge Timenetsky (II) Lilian Gregory (I) *

(I) Departamento de Clinica Medica, Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia, Universidade de Sao Paulo (USP), 05508-270, Sao Paulo, SP, Brasil. Email: lgregory@usp.br. * Autor para correspondencia

(II) Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciencias Biomedicas, USP, Sao Paulo, SP, Brasil.

Recebido para publicacao 21.07.10 Aprovado em 06.12-10 Devolvido pelo alitor 13.01.11 CR-3868
Tabela 1--Primers para classe Mollicutes (GPO e MGSO), para o genero
Ureaplasma (UGPF e UGPS) e a especie A. laidlawii (UNI e ACH3),
localizados na regiao interna do gene 16S do rRNA utilizados para a
realizacao do PCR das amostras de swab vaginal de femeas ovinas.
Piedade--Sao Paulo, 2005.

Primers                    Sequencia                    Produto

Mollicutes
  GPO3         5'-GGG AGC AAA CAG GAT TAG ATAC CCT-3'       270 pb
  MGSO         5'-TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC-3'
Ureaplasma
  UGPF         5'-GGATGAGGGTGCGACGTATC-3'                    644 pb
  UGPR         5'-GCGTTAGCTACAACACCGAC -3'
A. laidlawii
  UNI          5'- TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3'                   505 pb
  ACH3         5'-AGCCGGACTGAGAGGTCTAC-3'

Primers                  Autor

Mollicutes
  GPO3         Van KUPPEVELD et al., 1993
  MGSO
Ureaplasma
  UGPF         LAUERMAN, 1998
  UGPR
A. laidlawii
  UNI          DUSSURGETT & DUSSOIX, 1994
  ACH3

Tabela 2--Frequencia e percentual de isolamento de Mycoplasma spp em
meio SP4 e Ureaplasma spp em meio UB de culturas nao contaminadas e
contaminadas, obtidos de amostras de muco vulvovaginal de ovinos
criados na regiao de Piedade--Sao Paulo, 2005.

                 Isolamentos de amostras    Isolamentos do
Especies            nao contaminadas       total de amostras

Mycoplasma spp        06/18 (33,0%)           6/60 (10%)
Ureaplasma spp        07/22 (31,8%)          7/60 (11,7%)

Tabela 3--Presenca e ausencia de vulvovaginite segundo PCR classe
Mollicutes e genero Ureaplasma spp em ovinos criados na regiao de
Piedade--Sao Paulo, 2005.

                        Presenca de     Ausencia de
                       vulvovaginite   vulvovaginite   Total     p

Mollicutes       (+)        31              14          45
Mollicutes       (-)        09              06          15     0.752
Ureaplasma spp   (+)        29              11          40
Ureaplasma spp   (-)        11              09          20     0.287

Total                       40              20          60

Valores de P [less than or equal to] (0,05) sao significantes.
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Author:Rizzo, Huber; Meira, Enoch Brandao de Sousa, Jr.; de Oliveira, Rosangela Claret; Yamaguti, Mauricio;
Publication:Ciencia Rural
Date:Feb 1, 2011
Words:3714
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