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Micropropagation of umburana de cheiro /Micropropagacao de umburana de cheiro.

INTRODUCAO

Amburana cearensis (Allem.) A. C. Smith, (Fabaceae), e uma especie nativa da Caatinga, conhecida popularmente como amburana, amburana-de-cheiro, cumaru, cumaru-do-ceara, cumaru-das-caatingas, imburana, imburana-decheiro e umburana, utilizada de modo significativo pela populacao do semiarido, devido o valor madeireiro, ornamental, forrageiro e medicinal. As sementes e cascas do caule sao amplamente utilizadas na medicina popular como medicacao caseira no tratamento de bronquites, asma, gripes, resfriados e em casos de dores reumaticas (MAIA, 2006; LORENZI & MATOS, 2008).

No entanto, toda a coleta da planta para as diversas finalidades de uso, ainda e realizada por meio do extrativismo, que atualmente pode ser classificado como predatorio. A comercializacao das sementes e cascas do caule pode ser observada com frequencia, em feiras livres de diversos municipios localizados no semiarido nordestino, o que contribui para a reducao de populacoes de ocorrencia natural, uma vez que impede a propagacao natural da especie.

A relevancia desses aspectos demonstra a necessidade urgente do estabelecimento de programas voltados a sua producao e conservacao, assim como aumentam a necessidade de pesquisas com alternativas de propagacao. Ate o presente momento, nao existem referencias de pesquisas realizadas neste contexto para a Amburana cearensis.

A cultura de tecidos e uma tecnica importante que pode ser utilizada para a producao de especies nativas passiveis de extincao, uma vez que possibilita a rapida multiplicacao a partir de um unico individuo, em qualquer epoca do ano, com maior controle sobre a sanidade do material propagado (THAKUR & KARNOSY, 2007).

Neste contexto, objetivou-se com este trabalho, estabelecer uma metodologia adequada para a micropropagacao de A. cearensis, a fim de viabilizar a producao de mudas em larga escala, que poderao ser replantadas no habitat de ocorrencia natural amenizando o risco de erosao genetica.

MATERIAL E METODOS

Sementes de Amburana cearensis, obtidas de diferentes plantas matrizes, foram adquiridas em feiras livres do municipio de Euclides da Cunha, BA em 2008 e armazenadas em sacos de papel Kraft a temperatura ambiente, por um periodo de trinta dias. Para a assepsia, as sementes foram deixadas em agua corrente por 10min, imersao em etanol a 70% - 1min, seguido de solucao de hipoclorito de sodio (2,5% de cloro ativo) com duas gotas de detergente neutro 15min. Posteriormente, foram enxaguadas em agua destilada autoclavada e colocadas em tubos de ensaio (25 x 150mm), contendo 10mL do meio de cultura Wood Plant medium (WPM) (LLOYD & MCCOWN, 1980) suplementado com 100mg [L.sup.-1] de mio-inositol, 30g [L.sup.-1]

de sacarose, 7g [L.sup.-1] de agar (Himedia[R]). O pH foi ajustado para 5,7 [+ or -] 0,1 utilizando-se NaOH ou HCl 0,1N antes da autoclavagem. Os tubos de ensaio foram tampados com tampa plastica e vedados com parafilme e mantidos em sala de crescimento com temperatura de 25 [+ or -] 3[degrees]C, fotoperiodo de 16 horas e radiacao fotossintetica ativa de 45-60pmol [m.sup.-2] [s.sup.-1], fornecidos por lampadas do tipo fluorescente branca fria.

Para o experimento de multiplicacao, foram utilizados o apice caulinar (AC), o segmento nodal (SN) e o segmento cotiledonar (SC), retirados das plantas germinadas in vitro, com 45 dias. Os explantes foram colocados verticalmente em meio de cultura WPM suplementado com BAP em cinco concentracoes (0,0; 2,22; 4,44; 8,88 e 17,76[micro]M).

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado (DIC) em esquema fatorial 3x5 (tres tipos de explante x cinco concentracoes de BAP), totalizando 15 tratamentos com cinco repeticoes e cinco tubos por parcela. Aos 45 dias apos a instalacao do experimento, avaliou-se o numero de brotos por explante, o comprimento da parte aerea (cm), biomassa fresca e seca da parte aerea (mg) e porcentagem de explantes com brotos (%).

No experimento de enraizamento, foram utilizados brotos com um par de folhas (~2,0cm de comprimento) provenientes do explante segmento cotiledonar, colocados em meio de cultura WPM suplementado com diferentes concentracoes de AIB (0,0; 2,5; 5,0 e 10,0[micro]M) na presenca ou ausencia de 1,0g [L.sup.-1] de carvao ativado.

O experimento foi instalado em DIC em esquema fatorial 4x2 (quatro concentracoes de AIB x presenca ou ausencia de carvao ativado), totalizando oito tratamentos, com cinco repeticoes e cinco tubos por parcela. Aos 30 dias apos a instalacao do experimento avaliou-se a porcentagem de brotos enraizados (%), numero de raizes por broto, comprimento das raizes (cm), biomassa fresca e seca da raizes (mg). Para a avaliacao da biomassa fresca e seca nos dois experimentos (multiplicacao e enraizamento), o material fresco foi pesado em balanca analitica e posteriormente colocado em estufa com circulacao de ar forcado, na temperatura de 40[degrees]C ate obtencao do peso constante, para avaliacao do peso seco.

As plantas enraizadas in vitro com trinta dias, foram transferidas para copos plasticos de 500mL, contendo uma mistura de terra vegetal e vermiculita (1:1 v [v.sup.-1]), mantidas em casa de vegetacao a 70% de luminosidade, com temperatura e umidade relativa ambiente. Cada planta foi protegida com uma garrafa plastica tipo pet. As tampas das garrafas foram desenroscadas no 2o dia e retiradas no 5o dia. No 10o dia de transplantio, as garrafas foram removidas. Aos 30 e 60 dias da transferencia avaliouse a porcentagem de sobrevivencia das plantas.

Para a analise estatistica dos experimentos, os dados foram submetidos a analise de variancia, sendo os dados quantitativos avaliados por regressao no software estatistico SISVAR (FERREIRA, 2011).

RESULTADOS E DISCUSSAO

Todas as variaveis analisadas apresentaram distribuicao normal e, no experimento de multiplicacao, a analise de variancia demonstrou efeito altamente significativo (P [less than or equal to] 0,01) da interacao dupla para todas as variaveis observadas, enquanto que para a porcentagem de explantes responsivos o efeito foi significativo (P [less than or equal to] 0,05). Para o explante segmento nodal, observou-se uma tendencia no aumento do numero de brotos em meio suplementado com o BAP ate a concentracao 4,44[micro]M (1,24). Para o apice caulinar, o maior numero de brotos (1,2) foi obtido em meio WPM suplementado com 2,22[micro]M de BAP e para o explante segmento cotiledonar na presenca de 4,44[micro]M de BAP, foi possivel obter 2,36 brotos por explante (Figura 1A). Mesmo que este valor nao seja o desejavel em protocolos de micropropagacao, avancos foram obtidos, o que e relevante considerando o risco de extincao da especie.

Os resultados obtidos neste trabalho em relacao aos explantes testados, corroboram com aqueles encontrados para a copaiba (Copaifera langsdorfii) (NOLETO & SILVEIRA, 2004) e urucum (Bixa orellana) (CARVALHO et al., 2005), em que a proliferacao de brotos a partir de segmentos cotiledonares tambem apresentou os melhores resultados quando comparado a outros tipos de explantes.

Diferentemente deste trabalho com a umburana, a maior parte das pesquisas para o estabelecimento de protocolos de micropropagacao, tem sido realizada utilizando-se o segmento nodal para a multiplicacao (SOUZA et al., 2004; SANTANA et al., 2011; SOUZA et al., 2011). SOUZA et al. (2011), comentam que dentre os tipos de explantes mais utilizados, as gemas apicais e axilares e os segmentos nodais, promovem clones true-to-type, ou seja, identicos a planta matriz e por isso sao os mais indicados para a multiplicacao e conservacao in vitro de genotipos elites. Contudo, cada resposta depende da especie estudada.

Em relacao a concentracao de 4,44[micro]M de BAP resultados semelhantes tambem foram reportados para outras especies com potencial terapeutico, como a fruta do macaco (Feronia limonia) (HIREGOUDAR et al., 2003) e a framboesa (Rubus idaeus) (VILLA et al., 2006). Mas para outras especies medicinais, como o urucum (Bixa orellana) (CARVALHO et al., 2005), canjerana (Cabralea canjerana) (ROCHA et al., 2007) e peroba rosa (Aspidosperma polyneuron) (RIBAS et al., 2005), os autores observaram que o maior numero de brotos foi obtido em concentracoes diferentes de 4,44[micro]M de BAP. Esta variacao de resultados, esta de acordo com CALDAS et al. (1998), quando sugerem que a concentracao dos reguladores vegetais no meio de cultura sao fatores determinantes no crescimento e no padrao de desenvolvimento na maioria dos sistemas de cultura de tecidos.

Contudo, alem da acao direta dos reguladores vegetais nas diferentes etapas de um protocolo de micropropagacao, o crescimento e desenvolvimento de plantas cultivadas em condicoes in vitro, ainda e um processo complexo que envolve fatores endogenos e exogenos nao completamente elucidados. O genotipo, a nutricao mineral, condicoes inerentes a planta matriz, concentracoes endogenas de hormonios, dentre outros fatores, tambem podem interferi no processo. Desse modo, cada protocolo deve ser estabelecido considerando-se, principalmente, a especie de interesse.

Para o comprimento das brotacoes, o aumento da concentracao desta citocinina foi prejudicial e maior valor medio (1,64cm) foi observado na presenca de 2,22[micro]M de BAP (Figura 1B). Esta resposta ja poderia ser esperada, considerando que o BAP, em excessivas concentracoes, pode causar toxicidade e prejudicar o crescimento de brotacoes induzidas in vitro. Resultados similares foram reportados para a arnica da serra (Lychnophora pinaster) (SOUZA et al., 2004) e a framboesa (Rubus idaeus) (VILLA et al., 2006). Segundo GRATTAPAGLIA & MACHADO (1998), as citocininas utilizadas durante a multiplicacao in vitro promovem formacao de parte aereas, mas seu excesso pode ser toxico e levar ao encurtamento dos entrenos, principalmente o BAP.

Para a variavel materia seca da parte aerea, o maior incremento para o explante apice caulinar (5,78mg), ocorreu em meio acrescido de 2,22[micro]M de BAP e para o segmento cotiledonar, o maior valor (5,46mg) foi obtido na ausencia de BAP (dados nao mostrados).

A maior porcentagem de explantes responsivos ocorreu em meio suplementado com 4,44 e 2,22[micro]M de BAP, para segmento nodal (68,0%) e apice caulinar (76,0%), respectivamente. Para o explante segmento cotiledonar, verificouse modelo matematico linear decrescente, sendo a melhor competencia do explante (96,0%) observada na ausencia do BAP (Figura 1C). Esses resultados diferem daqueles obtidos por KIELSE et al. (2009), uma vez que os autores obtiveram 98,75% de resposta do segmento cotiledonar cultivado em meio de cultura suplementado com BAP.

Na etapa de enraizamento, maior porcentagem de brotos enraizados (92,0%) foi observado na presenca de 10,0[micro]M de AIB e ausencia de carvao ativado (Figura 2A). Na mesma condicao, foram obtidos os resultados mais eficientes para materia seca (17,32mg), comprimento (2,28cm) e numero de raizes (3,12) (Figura 2B e 2C).

Segundo GRATTAPAGLIA & MACHADO (1998), os efeitos beneficos do carvao ativado podem ser fisico, uma vez que simula uma condicao de escuro mais favoravel ao desenvolvimento de raizes adventicias, como tambem, quimico adsorvendo substancias prejudiciais ao enraizamento, como os compostos fenolicos. Entretanto, pode tambem adsorver auxinas e nutrientes do meio, necessarios ao enraizamento e desenvolvimento normal da parte aerea.

Para ASSIS & TEIXEIRA (1999), especies lenhosas, em geral, sao beneficiadas com o uso de carvao ativado. Contudo, esta substancia possui alta capacidade de adsorcao e pode reter parte dos elementos que compoem o meio de cultura, inclusive substancias promotoras do enraizamento, o que pode ter ocorrido neste experimento com a especie Amburana cearensis.

Assim como neste estudo, em culturas de pereira (Pyrus serotina) (ERIG et al., 2004), pequi (Caryocar brasiliense) (SANTOS et al., 2006) e jenipapo (Genipa americana) (ROCHA et al., 2008), que tambem apresentam propriedades terapeuticas, a presenca de carvao ativado nao favoreceu a inducao de raizes in vitro. De acordo com MCCOWN (1988), o efeito do carvao in vitro depende da composicao quimica do meio, mas tambem do genotipo da planta.

Durante a aclimatizacao, houve 40% de sobrevivencia das plantas, apos sessenta dias da transferencia para o substrato. Estes resultados sao semelhantes aos encontrados para outras especies lenhosas como angico (Parapiptadenia rigida) (KIELSE et al., 2009) e barbatimao (Stryphnodendren adstringens) (NICIOLI et al., 2008), em que taxas de aclimatizacao abaixo de 50% tambem foram relatadas.

Diversos fatores podem contribuir para o insucesso no processo de aclimatizacao como as condicoes ambientais, condicoes de cultivo e manutencao em casa de vegetacao, alem das condicoes funcionais dos tecidos vegetais formados em condicoes de laboratorio. Mesmo que o numero de mudas de A. cearensis obtidas em condicoes in vitro, tenha sido menor que 50%, os resultados apresentados anteriormente, mostraram que nao existiram dificuldades para o estabelecimento do protocolo de micropropagacao da especie.

CONCLUSAO

A micropropagacao de A. cearensis foi favorecida com a utilizacao do explante segmento cotiledonar em baixas concentracoes de BAP. Na etapa do enraizamento, a presenca do AIB favoreceu a emissao de raizes, porem o carvao ativado nao foi benefico. O processo de aclimatizacao das mudas de A. cearensis nao foi eficiente nas condicoes testadas.

Recebido 28.02.12

Aprovado 05.07.12

Devolvido pelo autor 24.01.13

CR-6875

REFERENCIAS

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Vania Celene Alecrim Campos (I) Alone Lima-Brito (II) Ingrid Estefania Mancia de Gutierrez (III) Jose Raniere Ferreira de Santana (IV) Ana Valeria Vieira de Souza (V)

(I) Programa de Pos-graduacao em Recursos Geneticos Vegetais, Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS), Feira de Santana, BA, Brasil.

(II) Programa de Pos-graduacao em Botanica, UEFS, Feira de Santana, BA, Brasil.

(III) Programa de Pos-graduacao em Biotecnologia, UEFS, Feira de Santana, BA, Brasil.

(IV) Departamento de Biologia, UEFS, Feira de Santana, BA, Brasil.

(V) Embrapa Semiarido, Centro de Pesquisa Agropecuaria do Tropico Semiarido (CPATSA ), BR 482, Km 152, Zona Rural, CP 23, 56302-970, Petrolina, PE, Brasil. E-mail: ana.valeria@cpatsa.embrapa.br. Autor para correspondencia.
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Author:Campos, Vania Celene Alecrim; Lima-Brito, Alone; de Gutierrez, Ingrid Estefania Mancia; de Santana,
Publication:Ciencia Rural
Date:Apr 1, 2013
Words:3085
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