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Micropropagacion de Stevia rebaudiana Bertoni, un endulzante natural a traves de explantes con meristemos pre-existentes.

Micropropagation of Stevia rebaudiana Bertoni, a natural sweetener, through pre existing meristem explants

Introduccion

Stevia rebaudiana (Asteraceae) es fuente de esteviosidos y rebaudiosidos, unos glucosidos de diterpenos no toxicos y no mutagenicos usados comercialmente como edulcorantes naturales bajos en calorias y propicios para pacientes diabeticos ya que no aumentan los niveles de glucosa en la sangre (Kinghorn y Soejarto, 1986; Ishima y Katayama, 1976; Tanaka, 1982; Matsui et al., 1996; Brandle, 2000). La propagacion sexual de estevia es dificil debido a los bajos porcentajes de germinacion, dificultad para cosechar la semilla y los altos grados de variabilidad genetica (Toffler y Orio, 1981). Alternativamente, el habito de crecimiento y el tamano limitado de la planta hacen la propagacion por estacas lenta e ineficiente para producir grandes cantidades de plantas (Sakaguchi y Kan, 1992; Machado y Zaidan, 1995). La micropropagacion ha mostrado ser un metodo que garantiza alta eficiencia y gran estabilidad genetica en las plantas producidas; sin embargo, los estudios en produccion masiva in vitro de plantas de estevia son limitados (Tamura et al., 1984; Bespalhok et al., 1992), y las publicaciones recientes enfatizan la necesidad de tecnicas para la produccion in vitro de los esteviosidos y rebaudiosidos (Akita et al., 1994; Bondarev et al., 2001; Bondarev et al., 2003) o incremento del material vegetativo via organogenesis (Bondarev et al., 2003; Jain et al., 2009). El presente trabajo tuvo como objetivo desarrollar un metodo eficiente para producir masivamente plantas de estevia en condiciones in vitro mediante el cultivo de explantes con meristemos pre-existentes.

Materiales y metodos

Material vegetativo

Los explantes fueron colectados a partir de plantas de estevia variedad Morita I de aproximadamente dos meses de edad y en estado de desarrollo vegetativo plantadas en la Granja Experimental de la Facultad de Ciencias Agricolas de la Universidad de Cordoba, Monteria--Colombia (8[grados] 52" LN y 76[grados] 48" LO). Las plantas fueron mantenidas en eras alzadas con incidencia controlada de luminosidad (polisombra del 50%) y riegos diarios por aspersion.

Establecimiento y multiplicacion

Los explantes, consistentes de segmentos de tallos con un par de yemas axilares (1.0-2.0 cm), fueron trasladados al Laboratorio de Biotecnologia Vegetal de la Facultad de Ciencias Agricolas de la Universidad de Cordoba (Monteria--Colombia, 8[grados] 52" LN y 76[grados] 48" LO). Una vez enjuagados con agua potable por aproximadamente media hora, fueron desinfectados superficialmente con 1.25% hipoclorito de sodio por 15 minutos, enjuagados tres veces con agua esteril y establecidos en medios de 1/2 (MS) Murashige y Skoog (1962) y suplementado (en mg [L.sup.-1]) con sacarosa (30,000), myo-inositol (100), tiamina HCl (0.4) y TC-agar (Sigma[R]) (6,000), con cambios a medio fresco de la misma formulacion cada tres semanas.

Los explantes, de 1.0 a 1.5 cm de longitud, se establecieron in vitro en medio 1/2 MS adicionado con cinco concentraciones de benzilaminopurina (BAP) (0.0, 2.22, 4.44, 8.88 y 17.6 [micron]M). Estos fueron incubados durante cuatro semanas, al final de los cuales se evaluaron las variables de respuesta; tasa de multiplicacion (numero de nuevos brotes por explante), longitud promedio de los brotes (mm) y el numero de nuevas hojas por planta producidas.

Enraizamiento y aclimatizacion

Los tallos multiplicados fueron independientemente subcultivados durante cuatro semanas en 1/2 MS con cinco concentraciones (0.0, 2.69, 5.37, 10.74 y 21.48 [micron]M) de acido naftalenacetico (ANA). Al final de periodo del cultivo se evaluo el porcentaje de enraizamiento, el numero de raices por tallo y la longitud promediode raices de cada tratamiento.

Los tallos enraizados in vitro y sin enraizar que se obtuvieron en la fase de multiplicacion (sin tratamiento adicional o tratados con polvo enraizador al 0.4% de ANA en la base), fueron trasplantados en una mezcla de sustrato 1:1 (suelo:arena) contenida en bandejas plasticas de 30 alveolos cada una. Un total de 200 tallos por cada tratamiento fueron establecidos (600 unidades experimentales), los cuales fueron mantenidos cubiertos con una polisombra del 50% y con riego permanente durante ocho semanas, al final de las cuales se registro el numero de plantas adaptadas a condiciones ex vitro.

Consideraciones generales

El pH de todos los medios fue ajustado a 5.7-5.8 previo a la adicion del agar y esterilizado a 121[grados]C y 1.1 kg-f [cm.sup.-2] por 15 min. Los cultivos fueron mantenidos a 25[grados]C, con 12 horas de luz diaria (40 [micron]M [m.sup.-2] [s.sup.-1]). Los tratamientos de los experimentos in vitro fueron distribuidos con un diseno completamente al azar con 15 repeticiones por tratamiento, cada repeticion consistio de un explante establecido en un recipiente y cada experimento fue repetido una vez. Los datos fueron analizados con un analisis de varianza con base en el modelo estadistico [Y.sub.ij] = [my] + [a.sub.i] + [[epsilon].sub.ij], donde p es el promedio general, [a.sub.i] fue el efecto de los reguladores BAP o ANA y [[epsilon].sub.ij] el efecto del error experimental. Los promedios fueron separados con la prueba de Tukey ([alfa] = 0.05).

Resultados

Multiplicacion

Los nuevos brotes crecieron a partir de los meristemos axilares presentes en los explantes (figura 1a y 1b). El analisis de varianza (Pr = 0.017) y la separacion de medias muestra que la presencia de BAP en el medio de cultivo incrementa significativamente el numero de nuevos brotes producidos por cada explante en comparacion al tratamiento control, alcanzandose un promedio maximo de 5.5 nuevos brotes por cada explante cuando el medio 1/2 MS es adicionado con 8.8 [micron]M de BAP (tabla 1). Con la variable longitud de brotes, existieron diferencias significativas entre los tratamientos con y sin fitohormona, siendo el tratamiento control donde la longitud de los brotes resulto significativamente mayor (Pr = 0.0014) comparado con aquellos desarrollados en los tratamientos suplementados con BAP (tabla 1). Con la variable numero de hojas se encontraron diferencias significativas (Pr = 0.0150) entre tratamientos siendo la menor concentracion (BAP 2,22 [micron]M) la que registro un valor significativamente mayor con 30.30 hojas por vitroplanta producida. A mayor concentracion de BAP se observa una disminucion del numero de hojas aunque para las concentraciones de 4.44 y 8.88 [micron]M de BAP el nivel de significancia es igual.

Enraizamiento y aclimatizacion

El crecimiento de raices adventicias ocurrio en todos los tratamientos (figura 1c); sin embargo, el mayor porcentaje de enraizamiento (87%) se registro en presencia de 10.74 [micron]M de ANA (tabla 2). El ANOVA permitio detectar diferencias estadisticas (Pr < 0.001), mientras que la prueba de Tukey mostro que la presencia de 10.74 [micron]M de ANA en el medio indujo el mayor numero de raices por tallo. Diferencias significativas fueron igualmente detectadas (Pr < 0.0001) con la variable longitud de raices (tabla 2); sin embargo, las diferencias entre el tratamiento sin y con enraizador fueron minimas, mostrando que el enraizamiento in vitro no fue necesario para la adaptacion ex vitro de las plantas micropropagadas (figura 1d). El 67% de los tallos micropropagados sin enraizar y sin tratamiento exogeno con enraizador lograron adaptarse a condiciones ex vitro, seguido por los tallos enraizados in vitro (50% de supervivencia), mientras que solo el 33% de los tallos sin enraizar y tratados con 0.4% de ANA sobrevivieron.

Discusion

Se determino una tasa de multiplicacion de 5.5 nuevos brotes por explante con la concentracion de 8.88 [micron]M de BAP adicionado al medio de cultivo, lo cual representa un incremento en la tasa de multiplicacion con una disminucion en la concentracion utilizada en estudios previos. Tamura et al., (1984) reportaron el desarrollo de uno a tres nuevos brotes por explante de las mismas caracteristicas cultivados en presencia de 9.29 [micron]M de kinetina y una tasa menor de multiplicacion cuando la misma cantidad de kinetina fue utilizada en combinacion con 1.07 [micron]M de ANA. Un comportamiento similar en cuanto a disminucion de la tasa de multiplicacion fue observado con la interaccion ANA y BAP utilizada para multiplicar brotes obtenidos a partir de explantes con meristemos pre-existentes (Suarez et al., 2006). Sivaran y Mukundan (2003), trabajando con la variedad Morita II, reportaron una mayor tasa de multiplicacion en presencia de 4.44 o 8.88 [micron]M de BAP registrando 6.3 y 8.5 nuevos brotes por explante, respectivamente, superando las tasas de multiplicacion del presente estudio; sin embargo, en el actual estudio se registro una respuesta morfogenetica mas rapida obteniendo brotes de Stevia rebaudiana en menor tiempo. Bondarev et al. (2003) reportan que al comparar el efecto de 6.66 [micron]M de BAP solo o en combinacion con 8.05 [micron]M de ANA en el medio de cultivo no se encontraron diferencias significativas; sin embargo, cuando se comparan estos tratamientos con el tratamiento control sin suministro de reguladores de crecimiento se obtiene un incremento de 1.5 veces en el numero de nuevos brotes. Esto muestra que la interaccion de ANA y BAP incide favorablemente no solo en el numero de brotes/explante, sino tambien en el en el incremento del tamano de los brotes producidos, lo cual contrasta con lo reportado por los resultados de Suarez et al. (2006) donde se observa una disminucion significativa de la longitud de los tallos cuando BAP y ANA son combinados en el medio de cultivo. Anbazhagan et al. (2010) observaron una tasa de multiplicacion de ocho nuevos tallos producidos a partir de explantes nodales con yemas axilares cultivados en un medio con 4,44 [micron]M de BAP y 8.05 [micron]M de ANA en un periodo de 40 dias de cultivo. En la presente investigacion se observo una disminucion en la longitud de los tallos producidos en presencia de BAP, la cual se agudiza con el incremento de la dosis de esta fitohormona. Efectos similares fueron registrados por Bondarev et al. (2003) cuando adicionaron BAP en el medio.

Recientemente, Jain et al. (2009) reportaron incrementos significativos hasta de seis nuevos brotes caulinares a partir de explantes consistentes de hojas de estevia cuando estas fueron establecidas en medios suplidos con concentraciones de CuS[O.sub.4] cinco veces por encima de la cantidad normal del medio MS. Estos resultados pueden considerarse en futuros estudios para incrementar las tasas de multiplicacion a partir de explantes con meristemos pre-existentes.

[FIGURA 1 OMITIR]

Similarmente a lo observado en la presente investigacion, reportes anteriores muestran poca correlacion con respecto a los efectos de la presencia de BAP u otros reguladores sobre la produccion de hojas in vitro de estevia (Sivaran y Mukundan, 2003; Bondarev et al., 2003).

De acuerdo con los resultados, un incremento en el suministro de ANA favorece un mejor enraizamiento de los brotes micropropagados. Esto contrasta con lo reportado por Bondarev et al. (2003) quienes no observaron diferencias en el enraizamiento in vitro de estevia con ANA. A diferencia de Sivaran y Mukundan (2003) quienes reportaron un 100% de enraizamiento y un promedio de 12 raices por tallo con 4.9 [micron]M de acido indolbutirico (AIB), indicando que posiblemente el AIB tiene un mayor efecto auxinico sobre el enrai zamiento in vitro de estevia. Los resultados obtenidos en la fase de adaptacion de plantas a las condiciones ex vitro, permiten obviar el estado de enraizamiento in vitro, lo cual permitiria reducir significativamente los costos y los riesgos de perdida de material in vitro, como lo refieren Martin et al. (2003 y Lara et al. (2003). Los resultados permiten estimar una produccion aproximada de 4.5 x [10.sup.6] nuevas plantas a partir de un solo explante en un ano.

Recibido: febrero 15 de 2013

Aprobado: abril 4 de 2014

Agradecimientos

Los autores del presente trabajo expresan sus agradecimientos a la Universidad de Cordoba y a la Division de Investigaciones por su apoyo en la realizacion del presente estudio.

Referencias bibliograficas

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Anbazhagan, M.; Kalpana, M.; Rajendran, R.; Natarajan, V.; Dhanavel, D. 2010. In vitro production of Stevia rebaudiana Bertoni. Emirates Journal of Food and Agriculture. 22(3):216-222

Bespalhok, J.; Hashimoto, J.; Vieira, L. 1992. Factores influenciando a micropropagao in vitro de gemas axilares de Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal. 4:59-61.

Bondarev, N.; Reshetnyak, O.; Nosov, A. 2003. Effect of nutrient media composition on development of Stevia rebaudiana shoots cultivated in the roller bioreactor and their production of steviol glycosides. Plant Science. 165:845-850.

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Brandle, J. Stevia. Natures natural low calorie sweetener. http://res2. agr.ca/London/faq/stevia_e.htm. [Accedido el: 06-25-2006] Ishima, N.; Katayama, O. 1976. Sensory evaluation of stevioside as sweetener. Reports National Food Research Institute. 31:80-85.

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Isidro E. Suarez, Universidad de Cordoba, Departamento de Ingenieria Agronomica y Desarrollo Rural, Carrera 6 No. 76-103. Monteria-Colombia. isuarez@sinu.unicordoba.edu.co. Fax: (57-1) (4) 786 0255,

Irma R. Quintero, MSc. Universidad del Magdalena. Carrera 32 No. 22-08. Santa Marta--Colombia.
Tabla 1. Efecto de diferentes concentraciones de BAP sobre la
multiplicacion in vitro de Stevia rebaudiana Bertoni.

BAP ([micron]M)    Numero     Longitud de    Numero
                  de brotes   brotes (cm)   de hojas

0.00               1.78 b       6.21 a      15.11 b *
2.22               4.86 a       1.53 b       30.30 a
4.44               4.89 a       1.96 b      21.70 ab
8.88               5.50 a       1.95 b      21.00 ab
17.76              4.60 a       1.64 b       18.00 b
Media               4.32         2.66         21.22
[r.sup.2]                        0.93         0.88
C.V.                             3.23         5.17

* Valores con la misma letra dentro de columnas no difieren
significativamente (Tukey P [menor que o igual a] 0.05)

Tabla 2. Efecto de diferentes concentraciones de ANA sobre el
enraizamiento in vitro de Stevia rebaudiana Bertoni.

ANA ([micron]M)   Enraizamiento (%)   Numero de raices   Longitud de
                                         por tallo       raices (cm)

0.00                     60                1.20 b          2.79 a
2.69                     77               2.80 ab          2.87 a
5.37                     80               2.46 ab          2.37 b
10.74                    87                4.07 a          2.82 a
21.48                    40                1.13 b          2.42 b
Media                   68.8                2.33            2.25
[r.sup.2]                                   0.89            0.91
C.V.                                        5.42            4.96

Valores con la misma letra dentro de columnas no difieren
significativamente (Tukey P [menor que o igual a] 0.05)
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Author:Suarez, Isidro E.; Quintero, Irma R.
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2014
Words:2902
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