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Micropropagacion de Ilex kunthiana Triana & Planchon (Aquifoliaceae), una especie de gran importancia en programas de revegetalizacion.

Introduccion

En la actualidad son innegables los vaguvosos pelbgvos que se filtran en los ecosistemas de montana en el mundo entero, y especialmente los perjuicios se han dispuesto como extremos y significativos en los Andes. De hecho, Colombia es un pais megadiverso que presenta peligros de desaparicion de su diversidad, situacion que orienta a emplear estrategias y metodologias que aseguren la perpetuacion de las especies vegetales, en especial aquellas que juegan un papel muy importante en los programas de revegetalizacion de zonas que son afectadas ecologicamente (Okada, 2001).

Como consecuencia de las alteraciones negativas medioambientales de varios ecosistemas, se ha informado que numerosas especies vegetales que son indispensables en programas de recuperacion de ecosistemas vulnerables. Esta situacion motiva el desarrollo de estudios ecologicos, fisiologicos y de recuperacion basados en los modelos de desarrollo sostenible, referentes a la conservacion y proteccion ambiental, donde las especies vegetales, como llex kunthiana justifican su propagacion mediante tecnicas biotecnologicas que se encuentran encaminadas hacia la preservacion, recuperacion y proteccion de especies en vias de extincion con categoria vulnerable, en peligro y en peligro critico.

I. kunthzana, registrada en categoria vulnerable, es una especie frecuente de los bosques que aun quedan en los alrededores del nor te de la Sabana de Bogota, especialmente en Subachoque, Chia y alrededores de Suba, sobre todo en el humedal La Conejera, siendo tambien reportada en Antioquia: Urrao; en Boyaca: Sogamoso y Villa de Leyva; en Cundinamarca: Monserrate, Vereda El Verjon Sumapaz y Chingaza; en Santander: Paramo del Almorzadero; en Venezuela, Panama y Costa Rica (Instituto Alexander ron Humbolt, 1997).

Sobre el desarrollo de protocolos de propagacion o conservacion de I. kunthiana, no se han realizado investigaciones orientadas hacia su potencial uso como especie indispensable en programas de repoblacion de areas naturales que evidencian alteraciones ecosistematicas. Por esta razon, una gran propagacion es un prerrequisito para compensar las exigencias de repoblacion de areas naturales y de esa forma evitar la erradicacion de esta planta que se encuentra en vias de extincion. Para las exigencias ecologicas de repoblacion, utilizando plantas pioneras, y para la conservacion de esta especie en vias de extincion, es necesario establecer metodos de propagacion rapida y a gran escala.

De esta forma, la propagacion in vitro permite la produccion de gran numero de plantulas en un corto periodo de tiempo. Este trabajo evalua el cultivo de tejidos vegetales in vitro como una alternativa en la preservacion y recuperacion de I. kunthzana, en el sentido de pertenencia, proteccion y conservacion del patrimonio natural, porque la propagacion in vitro es una fuente importante en la conservacion del germoplasma vegetal que ofrece bienes y servicios a la humanidad.

Materiales y metodos

Material vegetal y adaptacion a condiciones in vitro

La recoleccion del material vegetal se realizo en regiones de montanas cercanas a Subachoque y Tenjo, donde se encontraban las plantas en optimas condiciones fitosanitarias, a diferencia del ejemplar encontrado en el humedal La Conejera donde el arbol manifiesta contaminacion causada por hongos de los generos Aspergillus y Peniallb'um que se encuentran presentes en toda la superficie del tallo y de las hojas. El material vegetal seleccionado fueron los frutos maduros de L kunthiana completamente sanos en donde se recolectaron las semillas que despues fueron conservadas en toallas de papel humedecida y empacadas en bolsas plasticas para el transporte al laboratorio de Biotecnologia Vegetal de la Universidad Distrital FJC.

Las semillas fueron sumergidas en una solucion de Benlate[R] a 0,5% durante 12 horas y posteriormente se realizaron cuatro enjuagues consecutivos con solucion jabonosa y agua destilada, esteril. Posteriormente, las semillas fueron escarificadas mecanicamente a fin de facilitar la germinacion in vitro. Enseguida, las semillas se sumergieron en solucion de etanol a 70% durante 30 segundos y luego se colocan en una solucion de hipoclorito de sodio en concentraciones de: 0,5, 1,0, 1,5 y 2,0% durante 5, 10 y 15 min, generando 12 tratamientos que se describen en la tabla 1. Finalmente, se realizan tres enjuagues en agua destilada y esteril, previo a la siembra en los medios de cultivo.

Medios empleados y condiciones de cultivo

Como medio basico en el establecimiento in vitro de las semillas de I. kunthzana se utilizo el MS (Murashige y Skoog,1962), enriquecido con el acido giberelico ([AG.sub.3]) (0,0, 0,5 y 1,0 mg/L) produciendo un total de tres tratamientos. De las plantulas germinadas, se aislaron los nudos y se cultivaron con los siguientes fitoreguladores: acido indol butirico (AIB) (0,0, 0,5 y 1,0 mg/L) y bencilaminopurina (BAP) (0,0, 0,5 y 1,0 mg/L) para un total de nueve tratamientos (tabla 2). En el proceso de enrizamiento de los brotes proliferados se utilizo el acido indol butirico (AIB) (0,0, 0,5 y 1,0 mg/L) y el acido naftalen acetico (ANA) (0,0, 0,5 y 1,0 mg/L) generando nueve tratamientos (tabla 3). A todos los medios se les suministro 3% (w/v) de sacarosa y 0.8% (w/v) de agar. El pH de los medios fue ajustado a 5,8 antes de ser esterilizados a una presion de 1,06 kg/cm. por 20 min.

Incubacion. Una vez fueron sembrados los explantes en los diferentes tratamientos, bajo condiciones asepticas en la cabina de flujo de aire laminar horizontal, ellos fueron incubados durante 12 semanas de observacion, en un cuarto de crecimiento a temperatura ambiente de 23 [grados]C, a 25-30 Iuruol [m.sup.-2][s.sup.-1] (tubos fluorescentes de luz dia FL-20D/18, 20 W, China Electric Co., Taipei), y un fotoperiodo de 14 horas de irradiacion luminica.

Analisis estadistico

El experimento fue desarrollado bajo un diseno completamente al azar con arreglo factorial 6 x 4 (0,0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 y 3.0% del hipoclorito de sodio y 1,0; 5,0; 10 y 15 minutos de su exposicion) en el proceso de desinfeccion de las semillas. 3 x 3 (0,0; 0,5 y 1,0 mg/L para el AIB y 0,0; 0,5 y 1,0 mg/L para el BAP), en el cultivo de nudos. 3 x 3 (0,0; 0,5 y 1,0 mg/L para el AIB y 0,0; 0,5 y 1,0 mg/L de ANA), en el enraizamiento de los brotes proliferados. En cada uno de los tratamientos de desinfeccion, germinacion, proliferacion de brotes y enraizamiento se trabajaron diez replicas, donde cada replica estaba representada por un frasco de cultivo, con un explante. Los datos fueron estadisticamente analizados durante las 20 semanas de evaluacion en terminos de porcentaje y los promedios de los tratamientos fueron comparados empleando la prueba de Fischer (Steel y Torrie, 1985) a fin de establecer el mejor tratamiento de micropropagacion de L kunthiana.

Resultados y discusion.

En la adaptacion a condiciones in vitro y la micropropagacion de I. kunthzana, los tratamientos evaluados presentaron diferencias estadisticamente significativas (P<0,01); a continuacion se describen los diferentes resultados logrados en esta investigacion.

Adaptacion a condiciones in vitro. La germinacion de semillas de I. kunthiana bajo condiciones in vitro se realizo porque los nudos colectados a campo abierto se oxidaron y se murieron en un 100%, aunque fueron tratados con acido citrico y acido ascorbico con 100 mg/L, tanto en pretratamientos como en los medios de cultivo. Esta situacion concuerda con lo expuesto por Perez y Jimenez (1995), quienes recomiendan la incubacion en condiciones de oscuridad como metodo que evita la sintesis de fenoles, porque los productos de la oxidacion fenolica se forman bajo condiciones de iluminacion, que se manifiestan en al zona basal del corte del nudo, y en las lesiones que dejaron las hojas al ser retiradas de los nudos. Las situaciones de estres generalizadas como la desecacion, los danos mecanicos, los danos en la desinfeccion, y los cambios en los potenciales hidrico, salino y osmotico al ser incubados en el medio de cultivo y cambos de pH, hacen que el metabolismo de los tejidos vegetales estimulen la accion de los compuestos fenolicos las cuales son faciles de oxidar, esta oxidacion tiene un caracter fitotoxico por lo que son capaces de alterar procesos morfogeneticos de crecimiento y desarrollo (Lopez y Cazorla, 2002).

En este contexto, la obtencion del explante para iniciar un cultivo in vitro implica invariablemente la necesidad de causar heridas en el tejido vegetal. Estas heridas facilitan la respuesta del tejido al permitir la entrada de nutrientes y fitorreguladores, como por ejemplo en la organogenesis. Sin embargo, cualquier tejido vegetal herido excreta una gran cantidad de compuestos que intervienen en el proceso de cicatrizacion y defensa contra patogenos, la mayoria de los cuales pertenecen al grupo de los compuestos fenolicos. Estos compuestos, al contacto con la atmosfera tienden a ser oxidados causando un oscurecimiento del tejido. Esta oxidacion conlleva la generacion de radicales como las quinonas que resultan altamente toxicas para los tejidos vegetales (Pedroza et al., 2005). Asi mismo, es importante senalar que los tejidos de especies lenosas, particularmente de angiospermas como I. kunthzana, liberan al medio de cultivo polifenoles y taninos, donde la sintesis de los precursores de fenoles es mas activa y compleja en tejidos maduros que en tejidos jovenes, y esta influenciada por el contenido de sales y reguladores de crecimiento en el medio de cultivo; si las sustancias fenolicas permanecen en el medio del cultivo pueden inhibir el desarrollo de brotes y ocasionar la muerte del material vegetal. El control de la oxidacion puede lograrse mediante la adicion de antioxidantes en diferentes concentraciones al medio de cultivo (Carrizosa, 1994), o mediante los recultivos con alta frecuencia. Ademas, teniendo en cuenta que el empleo del hipoclorito de sodio en el proceso de desinfeccion de I. kunthiana, tambien contribuyo con el efecto oxidante en los explantes trabajados, porque Chung y Carrasco (2002) y Pedroza et al., (2007) han demostrado que el uso de cloro comercial induce la oxidacion de los tejidos en Salbx spp y Dodonea viscosa L.

Ante esta situacion, las plantulas germinadas de I. kunthiana son la fuente de explantes eficientes en el desarrollo de los procesos de micropropagacion porque son asepticos y no manifiestan procesos de oxidacion. De esta forma, en el control de los agentes contaminantes superficiales de las semillas, el Benlate[R] y el hipoclorito de sodio respondieron favorablemente, eliminando en un 100% tanto los hongos como las bacterias. De acuerdo con los resultados obtenidos, el tratamiento uno (hipoclorito de sodio al 0,5% durante 1 min) es el tratamiento eficaz para la fase de desinfeccion porque causa menos danos a los exceantes, situacion que se evidencia cuando las semillas estuvieron libres de patogenos y en excelentes condiciones fisiologicas durante su germinacion. Ademas, es importante tener en cuenta que a medida que se incrementan las concentraciones del hipoclorito de sodio, aunque el control de los agentes infecciosos es muy bueno, las condiciones fisiologicas de los exceantes son fuertemente alteradas, generando la necrosis y la muerte de los tejidos cultivados. Por esta razon, los ultimos 12 tratamientos (12-24), aunque manifestaron 100% del control de la contaminacion, no produjeron germinacion como consecuencia de los danos generados a los embriones. . De hecho, las soluciones que contienen cloro son empleadas regularmente por su seguridad, adecuado costo, simplicidad de uso, rapidez de accion y gran espectro antimicrobiano. Este compuesto es activo frente a bacterias, virus, hongos y esporas bacterianas; por tanto una solucion de hipoclorito de sodio, en la concentracion adecuada, puede emplearse como un desinfectante quimico. Sin embargo, la aplicacion practica de tan utiles propiedades se contrapone por la accion oxidante que estas soluciones exhiben y que provocan dano en las superficies sobre las que actua (Princ, 1998).

De otra parte, segun Carmona (2003) y Navas y Subero (1995), las combinaciones de diferentes desinfectantes como el Benlate[R] y el hipoclorito de sodio son ampliamente usados por el alto grado de control que ejercen contra los agentes contaminantes.

El Benlate[R] es un fungicida sistemico, que controla los hongos patogenos antes de su penetracion en la planta (accion preventiva) o bien cuando la infeccion comienza (accion curativa) (Carmona, 2003). Por esta razon, los trabajos relacionados con especies forestales como Salgx sp. y Aniba pevutilis, han comprobado que el empleo de una mezcla de fungicidas (Benlate[R]-Captam) y NaOCl a 10% por 30 y 20 min permite mantener niveles de asepsia mayores a 70% (Chung y Carrasco, 2002; Marulanda, 2004). Situacion que evidencia que el Benlate[R] pose un efecto de control sobre una amplia gama de enfermedades causadas por hongos en diversos cultivos de importancia economica.

En este contexto, de acuerdo con Jimenez et al., (2004), la zona del tejido que se utiliza para iniciar el cultivo in vitro tiene gran influencia en la eficiencia de la desinfeccion. Cuando las plantas se encuentran en crecimiento vegetativo, los explantes seleccionados se desinfectan con gran facilidad a diferencia de los explantes de plantas adultas, porque la desinfeccion es muy complicada (Perez y Jimenez, 1995; Rodriguez y Rodriguez., 2003).

Germinacion. El mejor tratamiento que indujo la germinacion de las semillas de L. kunthiana fue el 2, donde se utilizo 0,5 mg/L de [AG.sub.3], lograndose el 93% de germinacion (figura 1). Adicionalmente, la realizacion de la prueba de viabilidad utilizando el tetrazolio confirmo la baja capacidad germinativa de las semillas de Rex kunthzana al obtener un valor aproximado de embriones viables de 27%. Esta prueba se basa en la reaccion bioquimica de algunas enzimas de las celulas vivas con las sales de tetrazolio mediante la reduccion del tetrazolio hasta formar un compuesto rojo llamado formazan. La actividad de esas enzimas decrece al igual que la viabilidad de las semillas. Es asi como una coloracion roja intensa indica celulas vivas en el embrion y por el contrario, la ausencia de coloracion o coloracion rosa palido indican la muerte o poca viabilidad de las celulas embrionarias. La reaccion ocurre dentro de las celulas y dado que el pigmento que se forma es insoluble, no hay difusion del color rojo a las otras celulas (Moreno, 1996).

[FIGURA 1 OMITIR]

Adicionalmente, en la realizacion de un conteo de 1000 semillas de I. kunthiana se encontro que 53% eran maduras y bien desarrolladas, mientras que 31,5% eran inmaduras y un 15,5% se encontraban parasitadas por larvas en desarrollo de un himenoptero de la familia Eupelmidae como se observa en la figura 2.

El porcentaje de semillas inmaduras se manifiesta por el hecho de que los embriones de varias especies no se desarrollan tan rapida mente como el resto de los tejidos contiguos, asi que cuando caen de la planta, los embriones todavia estan imperfectamente desarrollados. Lo que significa que su germinacion esta completamente impedida hasta que se de por terminada la formacion del embrion y esto puede ocurrir durante o antes de la germinacion (Moscoso et al, 1980). En las especies del genero Ilex es comun la existencia de un alto grado de inmadurez, presentando un embrion diminuto, rudimentario o inmaduro en el momento de la dispersion, adquiriendo su tamano y forma tiempo despues por lo que muchas de estas especies requieren de lo que se conoce como posmaduracion (Rocas, 1988).

[FIGURA 2 OMITIR]

Es importante senalar que el aumento del porcentaje de germinacion de semillas con testa dura se logra cuando previamente se rea liza el tratamiento de escarificacion mecanica. Estos resultados demuestran como la testa de las semillas de Ilex kunthiana esta influyendo directamente en la baja tasa de germinacion bajo condiciones naturales porque su efecto negativo depende de la composicion y las caracteristicas anatomicas del tipo de tejido de la exo, meso y endotesta y de su estado de madurez y desarrollo (Trujillo, 1995). La dureza de la testa es un aspecto que probablemente afecta en ocasiones la germinacion, provocando latencia por la naturaleza de las cubiertas seminales debido a la resistencia mecanica que impide la expansion del embrion y el contenido de la semilla. La permeabilidad o impermeabilidad de la testa como en el caso de las semillas de I. kunthiana, estaria causando una restriccion al paso del agua y del oxigeno, lo que provoca la causa principal y frecuente de las dificultades en la germinacion en una alta cantidad de especies. En la germinacion el agua y el oxigeno influyen directamente, para ello se requiere cierta permeabilidad en la testa de la semilla, que permita el paso de estos elementos al interior de la misma (Moscoso et al, 1980; Florez y Pedroza, 2006).

El efecto representativo de 0,5 mg/L del acido giberelico en la germinacion de las semillas de I. kunthiana, se explica por la accion es timulante que tienen las giberelinas en semillas de varias especies, especialmente en condiciones sub-optimas. Es asi como una semilla que requiere luz puede germinar en la oscuridad y evitar a menudo los efectos inhibitorios de la temperatura y la salinidad elevada (Luckwill, 1994). Adicionalmente, la presencia de las giberelinas y su sintesis por parte del embrion despues de la hidratacion de la semilla, inicia el proceso de germinacion, induciendola a secretar amilasa y maltasa que tienen la capacidad de transformar el almidon a glucosa convirtiendose en fuente de energia para el embrion. En seguida se producen citoquininas, que junto al [AG.sub.3], inducen la sintesis de enzimas. Contando con la energia de la glucosa, con proteinas solubles, y con la accion de las citoquininas, las celulas del embrion se multiplican activamente, iniciandose la germinacion cuando el primordio de la raiz principal es capaz de romper la testa (Rojas y Ramirez, 1987).

La germinacion observada en el desarrollo de las semillas es de tipo epigea, en donde el hipocotilo se alarga y aleja a los cotiledones del sustrato, que ademas de su funcion de almacenamiento de nutrientes tiene frecuentemente color verde y realiza funciones fotosinteticas en la primera etapa de crecimiento de la planta. La testa de las semillas en la germinacion epigea se debe desprender permitiendo la expansion de las hojas cotiledonarias (Vazquez, 1997; Florez y Pedroza, 2006). Era comun observar en las semillas a las que no se retiraba completamente la testa, como para las primeras hojas de la planta en desarrollo les era imposible librarse de ella y poder emerger, haciendose visible unicamente la raiz, provocando finalmente su muerte semanas despues.

[FIGURA 3 OMITIR]

Cultivo de nudos. Segun los analisis de varianza, existe una diferencia significativa (P<0,01) entre los tratamientos que evaluan el efecto del AIB y del BAP tanto en el proceso de caulogenesis como en el de rizogenesis de los nudos obtenidos de las vitroplantulas germinadas in vitro de I. kunthiana.

Caulogenesis. El tratamiento cinco (0,5 mg/L de BAP y 0,5 mg/L de AIB), evidencio la mayor proliferacion de 49 brotes a partir de los nudos cultivados in vitro durante 12 semanas con 6 subcultivos (figura 3). De acuerdo con estos resultados, I. kunthiana necesita la presencia de la citoquinina BAP y de la auxina AIB para la proliferacion de brotes, lo que difiere de los resultados obtenidos por Luna, (2002) en Ilex aquifolium, y de Morte (1991) en Ilex paraguarienses que obtuvieron la regeneracion de brotes solo con la adicion de BAP en el medio de cultivo. Por esta razon, a pesar de pertenecer al mismo genero, cada especie genera necesidades diferentes en cuanto a la capacidad de multiplicacion celular y de regeneracion. Esta capacidad esta determinada por la carga genetica y el estado fisiologico de cada planta (Fuentes, 1998).

El tratamiento nueve (1,0 mg/L BAP y 1,0 mg/LAIB) manifesto un rendimiento similar al tratamiento cinco al alcanzar la regeneracion de 39 brotes, que en un inicio, mostraba el mejor comportamiento. Ademas, se encontro que los tratamientos cuatro (0,5 mg/LAIB y 0,0 mg/L BAP) y siete (1,0 mg/LAIB con 0,0 mg/L BAP) a lo largo de las observaciones en la proliferacion de brotes, generaron una menor respuesta con respecto al resto de los tratamientos, principalmente por la ausencia de BAP en el medio de cultivo donde se sembraron los nudos dada la importancia ya demostrada de su correlacion con el AIB para mejorar los resultados (figura 4). El hecho de que los medios de cultivo en los tratamientos cuatro y siete solo estuvieron enriquecidos con auxinas provoco muy seguramente una elongacion celular pero una baja induccion en la multiplicacion celular, para lo cual es indispensable la presencia de las citoquininas. Teniendo en cuenta que las citoquininas son sintetizadas en su mayoria en la raiz, y que las auxinas controlan los niveles de citoquininas activas, se puede llegar a inhibir su sintesis o promover la formacion de N- glucosidos o la activacion de citoquinina oxidasa que reducirian al minimo las cantidades de citoquininas endogenas producidas por el tejido meristematico de las yemas (Segura, 2000).

[FIGURA 4 OMITIR]

La presencia e interaccion del AIB con el BAP es determinante, a pesar del papel destacado por parte del BAP, la adicion de auxinas favorece el crecimiento de los brotes anulando el efecto depresivo acumulado de las concentraciones de citoquinina en los brotes axilares y restableciendo su normal crecimiento (Garcia, 2000). De igual forma, la presencia de citoquininas de distinta naturaleza dependen en su accion del estado de desarrollo de la planta o de un tejido concreto, sugiriendo que el metabolismo de citoquininas y las interconversiones de las hormonas en otras podrian estar directamente implicadas en la regulacion de los procesos de maduracion y envejecimiento de la planta (Fernandez, 2004).

De la respuesta obtenida en el comportamiento del BAP en presencia del AIB, cabe destacar que a 0,0 mg/L del BAP, a medida que las concentraciones de AIB aumentan, decrece la regeneracion de brotes, esto se puede atribuir a la caracteristica de las auxinas, que a concentraciones bajas estimulan el metabolismo y el desarrollo (Rojas y Ramirez, 1987), pero a medida que las concentraciones se incrementan, tanto el porcentaje de explantes que regeneran como la eficiencia se reducen (Fuentes, 1998). De la misma manera, entre varios compuestos, como las auxinas, ellas retrazan el crecimiento si se utilizan en una concentracion suficientemente elevada. Si se restablecen los niveles apropiados de reguladores de crecimiento el sistema podria volver a restablecer su normal funcionamiento (Luckwill, 1994). De hecho, los mejores resultados de respuesta organogenica de los segmentos nodales cultivados in vitro varian de acuerdo a la relacion hormonal AIB : BAP U imenez et al, 2004; Uribe y Cifuentes, 2004).

Por pruebas realizadas se cree que existen sistemas saturables de receptores capaces de ser inhibidos por altas concentraciones de reguladores de crecimiento. Se considera que si el receptor posee varios puntos de contacto se provocaria su inhibicion al unirsele varias moleculas de auxina, impidiendo su union eficaz y la accion fisiologica adecuada (Fuentes, 1998; Salisbury, E; Ross, 2000).

[FIGURA 5 OMITIR]

Rizogenesis. El tratamiento cuatro (0,5 mg/L de AIB y 0,0 mg/L de ANA) favorecio el enraizamiento de todos los brotes regenerados z. n vitro de I. kunthiana (figura 5). Situacion que significa que el proceso de rizogenesis esta intimamente ligado con la multiplicacion celular, proceso que es favorecido por la presencia de auxinas (Vadillo, 2004). Ademas, el aumento en la concentracion del AIB reduce el comportamiento favorable en la induccion de raices, especificamente al sobrepasar los 0,5 mg/L.

Segun Kantolic y Carmona, (2005) el grado de absorcion y posterior liberacion de auxinas y citoquininas puede variar segun el ge notipo de la planta y segun la auxina utilizada (Harturan et al., 1997), lo que indica que quizas I. kunthiana requiere de una cantidad adecuada de hormonas, puesto que para su enraizamiento efectivo es necesario agregar una baja concentracion de la auxina AIB. De otra parte, las auxinas desempenan un papel decisivo en muchos procesos del desarrollo vegetal como crecimiento, tropismos, enraizamiento de esquejes y diferenciacion vascular, entre otros. Teniendo en cuenta la localizacion de la biosintesis de la auxina, se debe considerar que el transporte de la hormona desde los lugares de biosintesis hasta los tejidos y organos implicados en las respuestas puede resultar clave en estos procesos (Acosta, 2004).

En terminos generales, estos resultados indican que la rizogenesis de los brotes de I. kunthzana, no es independiente de la adicion exogena de auxinas al medio de cultivo. Segura (2000) y Pedroza et al, (2005) afirman que muchos efectos fisiologicos pueden explicarse por su interaccion con las auxinas, porque ellas participan en el control mutuo de su abundancia y, en general, las citoquininas incrementan los niveles de auxinas mientras que las auxinas disminuyen las concentraciones de citoquininas activas.

Estos resultados demuestran el efecto que ejercen los reguladores de crecimiento en la respuesta morfogenetica del explante. Igual mente, se hace evidente el efecto de las auxinas en la elongacion celular y en la proliferacion de raices, con lo que se puede corroborar la importancia del balance endogeno--exogeno de auxinas y citoquininas en la propagacion efectiva de una especie vegetal, teniendo en cuenta que ambos reguladores mantienen y controlan mutuamente los niveles endogenos de si mismos (Taiz y Zeiger, 1998).

En terminos generales, se logra la produccion de plantas completas de I. kunthiana obtenidas a partir de los nudos que son obtenidos de vitroplantulas germinadas bajo condiciones in vitro y cultivados en medio MS enriquecido con 0,5 mg/L de BAP y 0,5 mg/L AIB, en la fase de proliferacion de brotes, mientras que en la fase de enraizamiento de los brotes regenerados 0,5 mg/L AIB permiten obtener un sistema radicular bien desarrollado (figura 6). De esta forma, se evidencia que la micropropagacion es una tecnica que ha aprovechado los conocimientos fisiologicos y bioquimicos de las plantas (Jimenez, 1998; Yepez, 2003; Albany et al., 2006). En este contexto, es importante resaltar que el empleo de las semillas, como fuente de explantes para la micropropagacion de I. kunthiana, son muy especiales porque mantienen la diversidad genetica entre la poblacion de las plantulas regeneradas bajo condiciones z. n vitro, logrando de esta forma mantener la conservacion de la biodiversidad de plantas altoandinas con altos riesgos de extincion.

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Conclusiones

El cultivo de tejidos vegetales in vitro es una alternativa en la preservacion y recuperacion de I. kunthiana. Se establecio que las plantulas de I. kunthiana germinadas bajo condiciones in vitro son la principal fuente de explantes en los programas de micropropagacion. En este contexto, la adaptacion de las semillas bajo condiciones in vitro se logra con el empleo del Benlate[R] a 0,5% durante 12 horas y el hipoclorito de sodio a 0,5% por 1 min que permiten obtener 100% de semillas completamente asepticas. Se determino que 0,5 mg/L de [AG.sub.3] favorecio la germinacion de las semillas, y que posteriormente 0,5 mg/L del BAP y 0,5 mg/L del AIB permiten la obtencion de 49 brotes en 12 semanas de incubacion, que enseguida son exitosamente enraizados con 0,5 mg/L de AIB, estableciendo las condiciones mas adecuadas para la propagacion in vitro de Ilex kunthiana.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Facultad de Ciencias y Educacion de la Universidad Distrital Francisco Jose de Caldas.

Recibido: agosto 27 de 2008 Aprobado: noviembre 24 de 2008

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Jaime Alonso Pedroza-Manrique (1); William Alberto Tupaz-Villacorte (2).

(1) Biologo Profesor Asociado Universidad Distrital Francisco Jose Caldas. Correo electronico: jpedroza@udistrital.edu.co

(2) Licenciado en Biologia. Universidad Distrital Francisco Jose de Caldas
Tabla 1. Tratamientos de desinfeccion para la
obtencion de semillas de I. kunthiana libres de
patogenos bajo condiciones in vitro, mediante
el empleo del hipoclorito de sodio.

Hipoclorito    Tiempo
de sodio (%)   (min.)   Tratamiento

0,5                 1             1
                    5             2
                   10             3
                   15             4

1,0                 1             5
                    5             6
                   10             7
                   15             8

1,5                 1             9
                    5            10
                   10            11
                   15            12

2,0                 1            13
                    5            14
                   10            15
                   15            16

2,5                 1            17
                    5            18
                   10            19
                   15            20

3,0                 1            21
                    5            22
                   10            23
                   15            24

Tabla 2. Efecto del AIB y del BAP
en el desarrollo morfogenico de yemas
axilares de I. kunthiana bajo condiciones
in vitro.

Acido indol   Bencil
butirico      aminopurina
(mg/L)        (mg/L)        Tratamientos

0,0               0,0            1
                  0,5            2
                  1,0            3

0,5               0,0            4
                  0,5            5
                  1,0            6

1,0               0,0            7
                  0,5            8
                  1,0            9

Tabla 3. Efecto del AIB y del ANA en el
enraizamiento de brotes propagados de I.
kunthiana bajo condiciones in vitro.

              Acido
Acido Indol   Naftalen
Butirico      Acetico
(mg/1)        (mg/1)     Tratamientos

0,0           0,0        1
              0,5        2
              1,0        3

0,5           0,0        4
              0,5        5
              1,0        6

1,0           0,0        7
              0,5        8
              1,0        9
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Author:Pedroza-Manrique, Jaime Alonso; Tupaz-Villacorte, William Alberto
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Dec 1, 2008
Words:6415
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