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Microorganismos tolerantes a metales pesados del pasivo minero Santa Rosa, Jangas (Peru).

Heavy metals tolerant microorganisms from mine tailing wastelands Santa Rosa, Jangas (Peru)

Introduccion

Una de las fuentes de contaminacion con metales pesados es la mineria, que es considerada como la segunda actividad humana mas antigua, pero deja suelos y materiales indeseables en forma de vertederos recubiertos, relaves y pozas de cenizas reemplazando los ecosistemas naturales (Juwarkar et al., 2010). Becerra-Castro et al. (2012) califica a la mineria como la actividad mas contaminante de suelos; por lo tanto para la adecuada proteccion y restauracion de estos ecosistemas contaminados con metales pesados se requieren su caracterizacion y remediacion (Wuana & Okieimen, 2011). En el Peru, la mineria tambien es una actividad economica importante, pero debido a los inadecuados planes de cierre y biorremediacion--especialmente de las minas antiguas--numerosos residuos (pasivos) mineros han sido dejados abandonados a lo largo de todo el pais, constituyendose un riesgo para la salud. Asi mismo, en los paises en desarrollo, la restauracion de estos ecosistemas es escaza pero urgente porque reduciria los riesgos asociados y repondria suelos para la agricultura (Wuana & Okieimen, 2011). Por otro lado, estos ambientes contaminados poseen una biota de interes (Colpaert et al. 2011) porque los organismos resistentes a estos metales pueden ser utilizados para limpiar ambientes contaminados a traves de aplicaciones biotecnologicas (Colin et al. 2012) gracias a que poseen mecanismos de sobrevivencia y desintoxicacion (Munoz et al. 2012) que les permite tolerar y acumular los metales pesados (Colin et al. 2012); es asi que, los microorganismos tolerantes aislados de ambientes contaminados con metales pesados son una buena alternativa para limpiar y remediar estos ecosistemas (Vargas-Garcia et al. 2012, Krishna et al. 2013). Asi mismo como primer paso para el diseno de los procesos de biorremediacion se sugiere determinar los microrganismos existentes en las areas perturbadas (Guo et al., 2010), porque los microorganismos nativos ademas de tolerar los metales tambien estan adaptadas a las condiciones ambientales de temperatura, humedad, pH, etc. del area interes. En este contexto, debido a que en la zona sierra peruana existen suelos perturbados por la industria minera cuya microflora no ha sido o esta escazamente caracterizada y estudiada, el objetivo de esta investigacion fue conocer la composicion microbiana de los suelos del pasivo minero Santa Rosa de Jangas (Ancash, Peru) y su tolerancia a varios metales pesados con el fin de identificar microorganismos promisorios que permitan desarrollar tecnicas biotecnologicas para la bioremediacion de ambientes contaminados con metales pesados.

Material y metodos

Colecta y caracterizacion fisicoquimica del suelo. La colecta se realizo en el mes de marzo del 2014 y se tomaron cuatro muestras de suelo de aprox. 1 kg, a 25 cm de profundidad. El area de muestreo fue de aprox. 250 [m.sup.2] correspondiente al pasivo minero de la planta concentradora Santa Rosa de Jangas de la Universidad Nacional Santiago Antunez de Mayolo (Ancash-Peru) ubicado a 9[grados]23'38.4"S, 77[grados]34'55.2"W y 2893 m de altitud, a 1 km del pueblo de Jangas y 150 m del rio Santa aprox. Las muestras fueron transportadas al laboratorio en recipientes esteriles a 8[grados]C aproximadamente. Tambien se colectaron plantas asociadas a los suelos, estas fueron identificadas en el Herbario David Smith de la Universidad Nacional Santiago Antunez de Mayolo (UNASAM).

Una parte de los suelos se uso para su caracterizacion fisico quimica: composicion de metales pesados de acuerdo al APHA (Standard methods for examination of water and wastewater) codigos MS08 (Cd), MS11(Cu), MS22(Ni), MS24(Pb), MS32(Zinc) y MS33 (Cr VI) en el Laboratorio de Calidad Ambiental de la Universidad Nacional Santiago Antunez de Mayolo; y el analisis fisicoquimico de fertilidad de suelos donde se evaluo el tipo de suelo, pH, conductividad electrica (CE), composicion de materia organica (MO), nitrogeno total (Nt), fosforo (P) y potasio (K) en el Laboratorio de Suelos de la Universidad Nacional Santiago Antunez de Mayolo. La otra parte del suelo fue utilizada para el aislamiento de los microorganismos.

Aislamiento de hongos y bacterias.--Previo al aislamiento, se enriquecio el cultivo inoculando 10 g de suelo en 90 mL del medio salino LPS (Jiang et al. 2008) con la diferencia que se agrego solo 5 g[L.sup.-1] de glucosa, y el LPS esteril fue suplementado con plomo (II) 0.1 mM esteril. Se incubo a 24[grados]C y 60 rpm en un bano maria con agitacion horizontal por 7 dias y se sub-cultivo tres veces transfiriendo 1 mL del cultivo a un medio fresco.

El aislamiento se realizo por el metodo de diluciones seriadas de [10.sup.-1] a [10.sup.-6], 100 [micron]L de las diluciones fueron inoculadas en placas con LPSA (LPS mas 15 g x [L.sup.-1] de agar-agar) suplementado con 1 mM Pb (II). Adicionalmente, para seleccionar hongos se agrego 0.01% de Triton X-100, 50 [micron]g x [mL.sup.-1] de tetraciclina y 50 [micron]g x [mL.sup.-1] de estreptomicina; mientras que para bacterias se agrego 100 [micron]g x [mL.sup.-1] de cicloheximida. Todas las siembras se hicieron por duplicado e incubadas a 28[grados]C por 7 dias.

Las colonias diferentes fueron aisladas y sembradas por estrias en placas con Agar Sabouraud (SA) en el caso de hongos y Agar Tripticasa de Soya (TSA) en el caso de bacterias; luego fueron cultivadas en tubos con medio de cultivo inclinado a 28[grados]C y almacenados a 4[grados]C.

Caracterizacion molecular de hongos y bacterias. Los hongos se cultivaron en caldo Saboraud a 28[grados]C con agitacion orbital (180 rpm) por 72 h. Se colecto el micelio mediante centrifugacion y se extrajo el ADN con el Kit AxyPrep Multisource Genomic Miniprep (Axygen, USA) usando el protocolo del fabricante. Se amplifico la region ITS del ADNr usando los primers ITS1-ITS4 y el secuenciamiento se realizo en Canadian Center for DNA Bar-coding (CCBD) con los primers ITS5-ITS4.

El ADN de las bacterias se extrajo con el Kit AxyPrep Bacterial Genomic Miniprep (Axygen, USA) de acuerdo al protocolo del fabricante. La amplificacion (PCR) del gen 16S del ADNr se realizo siguiendo la metodologia descrita por Tamariz-Angeles et al. (2014). El secuenciamiento se realizo en la compania Macrogen Korea Inc. (http://www.macrogen.com) con los primers 518F y 800R.

La limpieza y el analisis de secuencias se realizaron con el software CodonCode v.7.2. Se obtuvieron secuencias similares a las secuencias consenso preferentemente de los registros tipo del GenBank mediante el BlastN del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Todas las secuencias se alinearon con ClustralX v.2.0 y se elaboraron los arboles filogeneticos con Mega v.6 usando la metodologia Maximum likelihood y Neighbor-Joinning, Kimura 2-parametros y 1000 bootstraps.

En el caso de los hongos los datos taxonomicos, fotografias y secuencias se ingresaron a la plataforma BOLDSYSTEMS--The Barcode of Life Data Systems (www.boldsystems.org/) para la elaboracion de los codigos de barras de ADN.

Tolerancia a metales pesados.--Para el caso de los hongos se siguio la metodologia descrita por Munoz et al. (2012) con algunas modificaciones. La tolerancia a metales se realizo sobre placas Petri con LPSA suplementado con los metales pesados: 1.0 mM de [Pb.sup.+2], [Cu.sup.+2], [Ni.sup.+2] o [Zn.sup.+2] preparados a partir de Pb[(N[O.sub.3]).sub.2], Cu[(N[O.sub.3]).sub.2], 5[H.sub.2]O, Ni [(N[O.sub.3]).sub.2], 6[H.sub.2]O, ZnS[O.sub.4], 7[H.sub.2]O; y 0.1mM de [Cr.sup.+6], [Cd.sup.+2] o [Ag.sup.+1] preparados a partir de [K.sub.2][Cr.sub.2][O.sub.7], Cd[Cl.sub.2], 2[H.sub.2]O, AgN[O.sub.3]. Todas las soluciones stock de los metales pesados fueron esterilizados por filtracion y se agregaron al medio de cultivo antes de la inoculacion. Se inocularon discos de 5 mm de diametro de los cultivos de 5 dias en Agar Saboraud. Se incubaron por 7 dias a 28[grados]C y se determino el nivel de tolerancia como porcentaje de tolerancia (%[T.sub.H]) que se obtuvo multiplicando x 100 el indice de tolerancia (I[T.sub.h]); el mismo que fue calculado como I[T.sub.h] = Diametro del hongo en el medio con metal / Diametro del hongo en medio sin metal (Munoz et al. 2012).

Para las bacterias se utilizo 5mL de LPS suplementado con metales pesados a las mismas concentraciones que se indica para el caso de los hongos. Como inoculo se uso 20 [micron]L de cultivo joven (16 horas) a [OD.sub.620] entre 0.08-0.1. Luego se incubo a 24[grados]C y 60 rpm de agitacion horizontal por 24 horas. Se calculo el porcentaje de tolerancia de la siguiente manera (%[T.sub.B]) = [(Densidad optica del cultivo con el metal--Densidad del medio con metal sin inoculo)/Densidad del cultivo sin metal] x 100.

Analisis estadisticos.--Para evaluar la tolerancia a los metales pesados se hicieron cuatro repeticiones en un diseno completamente al azar (DCA), donde se calculo promedios, desviaciones estandares y se compararon las medias mediante el analisis de variancia ANOVA y la comparacion de las medias de Duncan (P < 0.05).

Resultados y discusion

Caracteristicas fisico-quimicas del suelo y aislamiento de los hongos y bacterias.--En el pasivo minero Santa Rosa se encontro escaza vegetacion representada principalmente por Bidens pilosa; esta especie tambien fue reportada en pasivos mineros de cobre en China (He et al. 2010).

Respecto a las caracteristicas de los suelos, las muestras M1 y M3 mostraron pH alcalino, salinidad ligera, materia organica, nitrogeno y fosforo fue pobre; mientras que los suelos MO y M2 mostraron pH neutro, suelo no salino, materia organica, nitrogeno y fosforo en cantidades medianas (Tabla 1). Entre los metales pesados, el plomo (Pb) fue el mas abundante, por lo tanto este metal fue utilizado en el medio de cultivo durante el enriquecimiento y aislamiento de los microorganismos.

Se aislaron un total de 41 cepas incluyendo 22 hongos filamentosos, 1 levadura y 18 bacterias. Segun Guo et al. (2010), los microorganismos juegan un rol importante en la biorremediacion de metales pesados tanto como bioacumuladores (manera directa) o interactuando con las plantas para facilitar la bioacumulacion de las plantas (manera indirecta); asi mismo su diversidad depende de la etapa de restauracion del ecosistema por lo cual tambien podrian ser usados como bioindicadores (Li et al. 2016).

Caracterizacion molecular de hongos y bacterias. Las secuencias del ITS de los hongos aislados fueron editadas a un tamano de 590 bp que corresponde a la region completa del ITS (ITS1-5.8S-ITS2). En el analisis BlastN se obtuvo 98-100% similitud de identidad con cepas tipo del GenBank. Las secuencias fueron depositadas al Genbank con los numeros de accesion MH980118-MH980140 que se encuentran despues del codigo de la cepa (Fig. 1). Tambien se elaboraron los codigos de barra de ADN que se adjunta en el material suplementario DOI: dx.doi.org/10.5883/DS-CTLM.

De acuerdo al analisis filogenetico de los hongos se identificaron 12 especies distribuidos en 5 generos (Fig. 1A-D), donde el genero Fusarium estuvo representada por 6 especies: F. fujikuroi, F. inflexum, F. nygamai, F. oxysporum, F. ramigenum y F. temperatum; el genero Penicillium estuvo representada por 3 especies: P. digitatum, P. rubens y P vanluykii; mientras que los generos Aspergillus, Mucor y Rhodotorula solo tuvieron una especie: A. versicolor, M. griseocynus y R. dairenensis, respectivamente. Estas especies estan ampliamente distribuidos en los suelos; pero a su vez varias investigaciones senalan la potencialidad de especies del genero Fusarium para la biorremediacion de metales pesados (Chen et al. 2010, Parameswari et al. 2010, Munoz et al. 2012, Iram et al. 2013, Oladipo et al. 2018a). Del mismo modo varias especies del genero Penicillium, Aspergillus, Mucor y Rhodotorula aislados de ambientes contaminados han mostrado capacidades para la bioremediacion de metales pesados (Iram et al. 2013, Mani & Kumar 2014, Munoz et al. 2012, Oladipo et al. 2018a, Parameswari et al. 2010, Vargas-Garcia et al. 2012).

Respecto a las bacterias aisladas, todas las secuencias fueron editadas a un tamano de 1200-1450bp correspondiente al gen 16S ADNr. En el analisis BlastN se obtuvo porcentajes de identidad de 97-100% con cepas tipo del GenBank. Las secuencia de las cepas aisladas fueron depositadas al Genbank y su numero de accesion se encuentra posterior al codigo de la cepas en la Figura 2.

El analisis filogenetico de las bacterias muestra la presencia de 7 especies agrupadas en 4 generos (Fig. 2A-C), donde el genero Bacillus estuvo representada por tres especies: B. licheniformis, B. subtilis y B. cereus; tambien se aislaron cepas de Staphylococcus epidermidis y especies de los generos Serratia y Enterobacter. Numerosas investigaciones reportan la amplia utilidad biotecnologica de las especies del genero Bacillus; entre las cuales, las cepas de Bacillus sp. y Bacillus cereus aisladas de ambientes contaminados han mostrado tolerancia a metales pesados asi como capacidades para la bioremediacion (Zahoor & Rehman 2009, He et al. 2010, Guo et al. 2010, Valverde et al. 2011). Ahemad (2014) reporta que varias especies del genero Bacillus promotores de crecimiento vegetal vienen siendo aplicadas a procesos de desintoxicacion de ambientes contaminados con metales pesados; Gupta y Diwan (2017) encontraron que algunos microorganismos--entre ellos especies de Bacillus--tienen potencialidades para contribuir con la desintoxicacion de ambientes contaminados mediante la produccion exopolisacaridos con capacidad de quelar metales pesados. Respecto a las especies de los generos Serratia, Enterobacter y Staphylococcus, Chen et al. (2010) aislaron algunas cepas de Serratia nematodiphila y Enterobacter aerogenes endofiticas resistentes a metales pesados; asi mismo Yu et al. (2014) encontraron una cepa de Staphylococcus epidermidis con capacidad de reducir Hg (II) debido a la presencia del operon mer, ademas una cepa de Staphylococcus capitis mostro tolerancia a cadmio, plomo, zinc, cobre, niquel y cromo (IV) reduciendo este ultimo metal en porcentajes cercanos a 80% (Zahoor & Rehman 2009).

Respecto a las especies por muestra de suelo, en las muestras M2 (rizosfera de B. pilosa) y M3 (rizosfera de S. americanum) se aislaron los mayores numeros de generos y especies de hongos; mientras que en M1 (rizosfera de R. communis) solo se aislaron especies del genero Fusarium (Fig. 3A). Asi mismo, se aislaron hasta 4 especies de bacterias de las muestras M0 y M2; mientras que en M1 y M3 se encontraron 3 y 2 especies, respectivamente. Tambien se observo que F. oxysporum estuvo presente en las muestras M0, M2 y M3 (Fig. 3A); mientras que por lo menos una cepa del genero Bacillus estuvo presente en todas las muestras y cepas del genero Serratia se encontraron en las muestras M0, M1 y M2 (Fig. 3B).

Tolerancia a metales pesados.- Se evaluo la capacidad de tolerancia a siete metales pesados con diversos niveles de toxicidad y los resultados se muestran en las Tablas 2 y 3. Oladipo et al. (2018a) consideran tolerancia muy baja cuando el indice de tolerancia (IT) se encuentra entre 0.00-0.39, tolerancia baja cuando el IT es 0.40-0.59, tolerancia moderada con IT 0.60-0.79, tolerancia alta con IT 0.80-0.99 y tolerancia muy alta con IT [mayor que o igual a] 1.00; en este sentido se encontro que varios microorganismos mostraron alta y muy alta tolerancia.

En el caso del plomo, 70% de los hongos mostraron alta tolerancia a 1mM de plomo. Este metal es uno de los cuatro metales mas toxicos de la tierra porque causa problemas en la salud humana y ecosistema (Rhee et al. 2014), es uno de los mas persistentes en el ambiente (Mani & Kumar 2014) y respecto a los tres ciclos pasados su presencia como contaminante se ha incrementado hasta 1000 veces mas (Naik & Dubey 2013). Por lo tanto, los microorganismos con habilidades de sobrevivir y tolerar concentraciones altas de Pb (II) son punto de partida para mayores estudios con fines de biorremediacion. Los hongos con muy alta tolerancia y mejores resultados fueron Fusarium temperatum CTLM05 seguido de F. oxysporum CTLM17 y F. oxysporum CTLM18. En concordancia, especies del genero Fusarium han sido reportadas como tolerantes a Pb(II), Cd (II), entre otros metales pesados (Vargas-Garcia et al. 2012). En el caso de las bacterias solo B. subtilis SSR3 y Serratia sp. SSR2 mostraron tolerancia moderada a 1mM de plomo (II), mientras que las demas cepas presentaron baja o muy baja tolerancia. Syed y Chinthala (2015) encontraron cepas del genero Bacillus entre ellas B. subtilis NSPA13 con significativa capacidad de biosorcion de plomo.

Respecto al cobre, este metal es un micronutriente esencial para los seres vivos pero puede ser toxico en bajas concentraciones (Ahemad 2014, Cornu et al. 2017). Por lo tanto la celula posee mecanismos homeostaticos para regular su concentracion y minimizar su toxicidad pero su exceso puede afectar al cerebro, rinon, higado, intestino (Colin et al. 2012, Cornu et al. 2017). Su alta toxicidad esta relacionada con su capacidad de formar radicales libres (Rohini & Jayalakshme 2015). La contaminacion con este metal se debe a factores naturales y la actividad humana tales como la mineria, industria, agricultura y combustion (Cornu et al. 2017, Hock et al. 2017). Frente a este problema, algunas bacterias (Cornu et al. 2017) y ciertos hongos (Hock et al. 2017) son promisorios para los procesos de biorremediacion porque han mostrado capacidades para bioabsorber este metal. En este sentido, se evaluo el nivel de tolerancia a 1 mM de cobre (II), encontrandose que la levadura Rhodotorula dairenensis CTLM24, y las bacterias Serratia sp. SSR15 y Bacillus cereus SSR1 mostraron tolerancia muy alta a diferencia de la mayoria de microorganismos evaluados que mostraron tolerancia baja a este metal. En relacion a R. dairenensis, la especie R. mucilaginosa UANL-001L ha sido reportada como resistente a varios metales pesados entre ellos cobre (Garza-Gonzalez et al. 2016). Asi mismo, estudios sobre resistencia a cobre de otras cepas de R. mucilaginosa muestran que estas poseen la capacidad de bioabsorver el cobre y mecanismos para tolerarlo (Colin et al. 2012, Irazusta et al. 2012). Este grupo de levaduras producen pigmentos de tipo carotenoides que probablemente minimizan la toxicidad de los metales pesados (Irazusta et al. 2012). Respecto a las bacterias, Cidre et al. (2017) han reportado algunas cepas del genero Serratia y Bacillus con alto nivel de resistencia a cobre, habiendo encontrado la presencia de genes pertenecientes al cluster pco multicobre oxidasa y al cluster sil involucrado en la resistencia a Cu y Ag en especies del genero Serratia y otras gram negativas. Del mismo modo, Behera et al. (2014) en el estudio de respuesta antioxidativa de B. cereus frente a cadmio y cobre, encontraron que ambos metales inducian diferentes respuestas, donde la respuesta frente al cobre estaria relacionada con la produccion de catalasas. Asi mismo, algunas cepas de B. cereus mostraron alta capacidad de biosorcion de cobre (Rohini & Jayalakshme 2015, Oladipo et al. 2018b), encontrandose la presencia de genes de resistencia al cobre en el cromosoma y que el grado de biosorcion era dependiente a las condiciones del medio cultivo y entorno (Rohini & Jayalakshme 2015).

El zinc como elemento traza es un metal importante para el desarrollo normal de diversas vias metabolicas celulares y en la salud del ser humano (Wuana & Okieimen 2011, Ahemad 2014). La contaminacion de aguas y suelos con zinc proveniente de actividades humanas principalmente la mineria, la combustion de carbon y desechos, y la industria del acero viene generando riesgos en la salud y ecosistema (Wuana & Okieimen 2011), por lo tanto es necesario los esfuerzos para la biorremediacion de ecosistemas contaminados con este metal. Entre los microorganismos evaluados y cultivados con 1mM de Zn (II) se encontro que los hongos R dairenensis CTLM24, F. temperatum CTLM7 y CTLM8, y F. nigamai CTLM16 mostraron alta tolerancia a zinc. Asi mismo, las bacterias mostraron niveles de tolerancia variados, de los cuales la cepa B. licheniformis SSR18 alcanzo un indice de 3.00, es decir no solo fue altamente tolerante sino que fue estimulada por este metal; tambien B. licheniformi SSR06 y Serratia sp. SSR15 mostraron alta tolerancia. En concordancia, Munoz et al. (2012) encontraron que las bacterias y hongos aisladas de aguas residuales toleraron altas cantidades de zinc, pero la cepa R. mucilaginosa mostro menor tolerancia. Sin embargo, Garza-Gonzalez et al. (2016) encontraron que R mucilaginosa UANL-001L mostraba alta tolerancia a zinc y plomo, atribuyendo esta propiedad a la formacion de exopolisacaridos. Contrariamente, R. dairenensis CTLM24 no tolero 1mM de plomo, pudiendo dar indicios de la presencia de otros mecanismos involucrados. Por otro lado, Krishna et al. (2013) encontraron una cepa de Bacillus sp. que bio-acumulaba altos niveles de zinc a pH 9.

El niquel es contaminante industrial que esta presente en el ambiente solo en muy bajas concentraciones (Wuana & Okieimen 2011), como otros metales es esencial para los seres vivos en muy bajas dosis pero a mayores concentraciones es causante de varios tipos de cancer (Wuana & Okieimen 2011, Macomber & Hausinger 2011). Wuana y Okieimen (2011) indican que a pesar de su efecto negativo en el crecimiento de los microorganismo, algunos desarrollan resistencia. En concordancia, se encontro que todas las cepas de hongos y bacterias mostraron tolerancia a 1mM de niquel. Los hongos con mejor respuesta fueron F. oxysporium CTLM18, P rubens CTLM14 y F. oxysporum CTLM3 que mostraron alta tolerancia. Entre las bacterias B. licheniformis SSR18 seguido de Serratia sp. SSR15 mostraron muy alta tolerancia con valores mayores a 1.96 [+ o -] 0.02 y 1.66 [+ o -] 0.3, respectivamente. Se han encontrado varios mecanismos de tolerancia en bacterias y eucariotas (Macomber and Hausinger, 2011), donde la tolerancia de Bacillus cereus esta asociada a un gen cromosomal (Shoeb et al. 2010).

Respecto a la tolerancia a plata, todas las cepas de hongos excepto A. versicolor CTLM19 mostraron algun grado de tolerancia a 0.1mM de plata (I) donde las cepas F. oxysporium CTLM03, CTLM12, CTLM18 y F. inflexum CTLM22 fueron muy altamente tolerantes. Por lo contrario, la mayoria de bacterias no mostraron tolerancia a este metal. Sin embargo, las cepas Serratia sp. SSR13, Serratia sp. SSR15 y B. cereus SSR1 mostraron muy alta tolerancia. Este metal es toxico para las bacterias porque forman complejos con el azufre (Ahemad 2014), esta actividad antibacteriana esta siendo rescatada por la nanotecnologia y se estan estudiando algunos hongos tolerantes capaces de formar nanoparticulas de plata (Devi & Joshi 2015, Majeed et al. 2017).

El cromo (VI) es altamente toxico, mutagenico y carcinogenico, deriva principalmente de la actividad humana, por su alta solubilidad se moviliza a otros lugares diferentes de su origen (Ahemad 2014, Viti et al. 2014). Atraviesa la membrana celular por la via de ingreso del sulfato y genera iones intermediario Cr(V) y/o Cr(IV), radicales libres y como producto final Cr(III) que afecta la replicacion del ADN, causa mutagenesis, y afecta a las enzimas (Viti et al. 2014). En el caso de los hongos la mayoria mostraron alta y muy alta tolerancia, entre ellos destaco F. nygamai CTLM10 que alcanzo un indice de 3.17 seguido de F oxysporum CTLM12 y CTLM18. Concordantemente, Iram et al. (2013) aislaron varias especies de hongos resistentes a Cr y Pb a partir de suelos, entre ellos a Fusarium solani. La mayoria de bacterias mostraron algun nivel de tolerancia a este metal, entre ellas B. cereus SSR1 mostro muy alta tolerancia. Concordantemente, Upadhyay et al. (2017) encontraron que B. subtilis MNU16 aislada de suelos de minas de carbon con un gran nivel de resistencia a cromo (VI), el mismo que es reducido a Cr (III).

Junto con el mercurio y el plomo, el cadmio es el tercer metal mas contaminante sin funcion biologica conocida (Wuana & Okieimen 2011). La contaminacion con este metal proviene de la mineria, efluentes de las textileras, industrias de electroplatinados y galvanizados y las baterias de cadmio (Fazli et al. 2015). Catorce cepas de hongos mostraron algun nivel de tolerancia a 0.1 mM de cadmio (II) de los cuales F oxysporum CTLM02, F. oxysporum CTLM03, y F. oxysporum CTLM18 mostraron muy alta tolerancia. Concordantemente, otras investigaciones senalan el alto potencial de los hongos para la descontaminacion del cadmio (An et al. 2015, Fazli et al. 2015). Asi mismo, la mayoria de bacterias mostraron tolerancia a este metal y el 44% mostro muy alta tolerancia. B. licheniformis SSR18 crecio hasta 150% mas que el control sin metal (IT 2.53). La biomasa viva o muerta o los EPS (polisacaridos extracelulares) de algunas especies del genero Bacillus han mostrado resistencia y potencial de remover cadmio (Shameer 2016, Wu et al. 2016).

Finalmente, la aplicacion de los sistemas microbianos para la biorecuperacion y bioprocesos de los metales ha recibido gran importancia en los ultimos anos (Liang & Gadd 2017). En este sentido, en los suelos del pasivo minero Santa Rosa se ha encontrado una microflora de hongos y bacterias resistente a metales pesados, los cuales podrian jugar el rol de promotores de crecimiento vegetal protegiendo a las plantas de los efectos toxicos de los metales (Jiang et al. 2008), pero tambien podrian tener el rol de bioacumulacion y reduccion de los metales pesados. Estos bioprocesos podrian ser aprovechados para procesos de bioremediacion, por lo cual son necesarias mayores investigaciones.

Material suplementario

Codigos de barra de ADN de los hongos se encuentra en la siguiente direccion DOI dx.doi.org/10.5883/DS-CTLM

doi: http://dx.doi.org/10.15381/rpb.v26i1.15914

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Agradecimientos:

--Biodiversity Institute of Ontario Herbario (BIO) de la Universidad de Guelph (Canada)

--La Dra. Nataly Ivanova y el Dr. Alex Borisenko del BIO

--Canadian Center for DNA barcoding (CCDB)

Rol de los autores:

LMS, POG, MST y CTA disenaron la investigacion, LMS desarrollo la parte experimental, POG y MST apoyaron en la parte experimental, CTA realizo el analisis molecular y escribio el borrador del manuscrito, LMS, POG, MST y CTA aprobaron el manuscrito. Los autores manifiestan que no existen conflictos de intereses.

Conflicto de intereses: Los autores no incurren en conflictos de intereses.

Aspectos eticos / legales: Este trabajo no incurrio en ningun problema legal.

Fuentes de financiamiento:

El secuenciamiento de los hongos tuvo el apoyo del Canadian Center of DNA Barcoding (CCDB) y Biodiversity Institute of Ontario (BIO) de la Universidad de Guelph a traves del proyecto "DNA barcoding to support the biodiversity conservation, sustainable harvesting and trade in Peru".

Loyer Munoz-Silva (1), Percy Olivera-Gonzales (2), Miguelina Santillan-Torres (3), y Carmen Tamariz-Angeles * (2)

(1) Facultad de Ciencias Ambientales, Universidad Nacional Santiago Antunez de Mayolo, Peru.

(2-3) Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Santiago Antunez de Mayolo, Peru.

Presentado: 10/10/2018

Aceptado: 13/01/2019

Publicado online: 18/03/2019

Correspondencia:

(1) Facultad de Ciencias Ambientales, Universidad Nacional Santiago Antunez de Mayolo.

(2) Laboratorio de Biologia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Santiago Antunez de Mayolo.

(3) Laboratorio de Quimica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Santiago Antunez de Mayolo.

* Autor para correspondencia

Email LMS: loyermunoz@gmail.com

Email PO-G: poliverag@unasam.edu.pe

Email MS-T: msantillant@unasam.edu.pe

Email CT-A: ctamariz@unasam.edu.pe

Leyenda: Figura 1: Analisis comparativo de la secuencias de la region ITS de las cepas aisladas del Pasivo minero Santa Rosa de Jangas y especies relacionadas del NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Se uso el metodo Kimura 2-parametros, Maximum likelihood y 1000 boot straps. Fusarium boothii, Mucor ellipsoides y Rodhotorula araucariae se usaron como raices y los numeros de accesion se encuentran al final de cada nombre.

Leyenda: Figura 2: Analisis comparativo de la secuencias 16S ADNr, de las cepas de bacterias aisladas con especies relacionadas del NCBI GenBank. Los arboles elaborados con el metodo Kimura 2-parametros, Neighbour-Joining y 1000 boot straps, B. cereus y S. aureus como raices, y los numeros de accesion se encuentran al final de cada nombre.

Leyenda: Figura 3. Numero de cepas por especies y por muestra. A. Hongos, y B. Bacterias.
Tabla 1. Analisis fisico-quimico y microorganismos aislados de los
suelos del Pasivo minero Santa Rosa

Muestra                                       M0

Especie
vegetal

Analisis de        Tipo de suelo            Franco
fertilidad               pH                  7.35
                       M.O %                 3.886
                       Nt. %                 0.194
                      P (ppm)                 22
                      K (ppm)                 118
                     C.E (dS/m)              1.29

Metales        Cd (mg x [kg.sup.-1])         0.083
pesados        Cu (mg x [kg.sup.-1])         0.47
               Ni (mg x [kg.sup.-1])         0.02
               Pb (mg x [kg.sup.-1])         9.11
               Zn (mg x [kg.sup.-1])         1.86
              Cr VI (mg x [kg.sup.-1])       0.01

Hongos             Cantidad (%)*            4 (50)
                      Codigos            CTLM01-CTLM04

Bacterias          Cantidad (%)*            4 (50)
                      Codigos             SSR01-SSR04

Muestra                                          M1

Especie                                   Ricinus communis
vegetal

Analisis de        Tipo de suelo              Arenoso
fertilidad               pH                     9.26
                       M.O %                   1.273
                       Nt. %                   0.064
                      P (ppm)                    4
                      K (ppm)                    99
                     C.E (dS/m)                 2.11

Metales        Cd (mg x [kg.sup.-1])           0.088
pesados        Cu (mg x [kg.sup.-1])            0.65
               Ni (mg x [kg.sup.-1])            0.02
               Pb (mg x [kg.sup.-1])            6.18
               Zn (mg x [kg.sup.-1])            1.27
              Cr VI (mg x [kg.sup.-1])          0.01

Hongos             Cantidad (%)*               4 (44)
                      Codigos              CTLM05-CTLM08

Bacterias          Cantidad (%)*               5 (56)
                      Codigos            SSR05-SSR08, SSR10

Muestra                                        M2              M3

Especie                                  Bidens pilosa       Solanum
vegetal                                                    americanum

Analisis de        Tipo de suelo             Franco          Franco
fertilidad               pH                   7.19             8.2
                       M.O %                 3.484            2.01
                       Nt. %                 0.174            0.101
                      P (ppm)                  16               4
                      K (ppm)                  91              127
                     C.E (dS/m)              0.968            2.21

Metales        Cd (mg x [kg.sup.-1])         0.108            0.118
pesados        Cu (mg x [kg.sup.-1])          1.13            0.02
               Ni (mg x [kg.sup.-1])          0.02            0.02
               Pb (mg x [kg.sup.-1])          6.73            5.52
               Zn (mg x [kg.sup.-1])          1.41            1.39
              Cr VI (mg x [kg.sup.-1])        0.01            0.01

Hongos             Cantidad (%)*             8 (62)          7 (64)
                      Codigos            CTLM09- CTLM16   CTLM17-CTLM24

Bacterias          Cantidad (%)*             5 (38)          4 (36)
                      Codigos             SSR11-SSR15     SSR16- SSR19

* el porcentaje se calculo considerando el total de organismos
aislados por cada muestra.

Tabla 2: Porcentaje de tolerancia a metales pesados de los hongos
aislados del suelo del Pasivo Minero Santa Rosa

Cepas                                   1 mM

                            [Pb.sup.+2]     [Cu.sup.+2]

F. oxysporum CTLM1         116 [+ o -] 5    35 [+ o -] 6
F. oxysporum CTLM2         120 [+ o -] 5    36 [+ o -] 8
F. oxysporum CTLM3         117 [+ o -] 4    55 [+ o -] 6
P. digitatum CTLM4         76 [+ o -] 4          --
F. temperatum CTLM5        149 [+ o -] 3    47 [+ o -] 3
F. ramigenum CTLM6         124 [+ o -] 4    6 [+ o -] 0
F. temperatum CTLM7        123 [+ o -] 9    47 [+ o -] 5
F. temperatum CTLM8        115 [+ o -] 8    40 [+ o -] 5
F. fujikuroi CTLM9         110 [+ o -] 2    11 [+ o -] 0
F. nygamai CTLM10          109 [+ o -] 4    28 [+ o -] 3
P. vanluykii CTLM11        85 [+ o -] 4          --
F. oxysporum CTLM12        114 [+ o -] 4    43 [+ o -] 7
F. fujikuroi CTLM13        83 [+ o -] 6     20 [+ o -] 4
P. rubens CTLM14           74 [+ o -] 5     9 [+ o -] 4
F fujikuroi CTLM15         119 [+ o -] 4    25 [+ o -] 4
F. nygamai CTLM16          125 [+ o -] 4    45 [+ o -] 3
F. oxysporum CTLM17        128 [+ o -] 9    28 [+ o -] 8
F. oxysporum CTLM18        131 [+ o -] 6    46 [+ o -] 6
A. versicolor CTLM19       81 [+ o -] 7          --
M. circinelloides CTLM20   107 [+ o -] 2         --
F. oxysporum CTLM21        99 [+ o -] 9     27 [+ o -] 3
F inflexum CTLM22          117 [+ o -] 6    65 [+ o -] 4
R. dairenensis CTLM24 *         --         100 [+ o -] 10

Cepas                                   1 mM

                            [Zn.sup.+2]    [Ni.sup.+2]

F. oxysporum CTLM1         69 [+ o -] 3    69 [+ o -] 3
F. oxysporum CTLM2         87 [+ o -] 5    69 [+ o -] 3
F. oxysporum CTLM3         82 [+ o -] 10   81 [+ o -] 4
P. digitatum CTLM4         28 [+ o -] 3    59 [+ o -] 9
F. temperatum CTLM5        88 [+ o -] 3    53 [+ o -] 3
F. ramigenum CTLM6         78 [+ o -] 5    41 [+ o -] 0
F. temperatum CTLM7        92 [+ o -] 7    54 [+ o -] 2
F. temperatum CTLM8        90 [+ o -] 8    63 [+ o -] 2
F. fujikuroi CTLM9         47 [+ o -] 6    50 [+ o -] 7
F. nygamai CTLM10          70 [+ o -] 4    40 [+ o -] 4
P. vanluykii CTLM11        65 [+ o -] 9    61 [+ o -] 7
F. oxysporum CTLM12        86 [+ o -] 4    68 [+ o -] 5
F. fujikuroi CTLM13        80 [+ o -] 5    64 [+ o -] 2
P. rubens CTLM14           47 [+ o -] 7    84 [+ o -] 8
F fujikuroi CTLM15         89 [+ o -] 7    62 [+ o -] 2
F. nygamai CTLM16          90 [+ o -] 3    48 [+ o -] 2
F. oxysporum CTLM17        80 [+ o -] 4    55 [+ o -] 5
F. oxysporum CTLM18        85 [+ o -] 9    88 [+ o -] 6
A. versicolor CTLM19       41 [+ o -] 6    56 [+ o -] 9
M. circinelloides CTLM20   82 [+ o -] 5    21 [+ o -] 2
F. oxysporum CTLM21        73 [+ o -] 3    50 [+ o -] 3
F inflexum CTLM22          87 [+ o -] 8    77 [+ o -] 7
R. dairenensis CTLM24 *    96 [+ o -] 8    54 [+ o -] 8

Cepas                                   0.1 mM

                            [Ag.sup.+1]     [Cr.sup.+6]

F. oxysporum CTLM1         69 [+ o -] 3     96 [+ o -] 3
F. oxysporum CTLM2         95 [+ o -] 5    134 [+ o -] 8
F. oxysporum CTLM3         125 [+ o -] 4   140 [+ o -] 6
P. digitatum CTLM4         44 [+ o -] 7     78 [+ o -] 6
F. temperatum CTLM5        76 [+ o -] 6    101 [+ o -] 11
F. ramigenum CTLM6         66 [+ o -] 4    116 [+ o -] 5
F. temperatum CTLM7        69 [+ o -] 4    117 [+ o -] 6
F. temperatum CTLM8        77 [+ o -] 0    134 [+ o -] 6
F. fujikuroi CTLM9         65 [+ o -] 4    101 [+ o -] 4
F. nygamai CTLM10          77 [+ o -] 4    131 [+ o -] 7
P. vanluykii CTLM11        61 [+ o -] 0    217 [+ o -] 20
F. oxysporum CTLM12        123 [+ o -] 5   153 [+ o -] 5
F. fujikuroi CTLM13        70 [+ o -] 3    102 [+ o -] 0
P. rubens CTLM14           48 [+ o -] 4     73 [+ o -] 7

F fujikuroi CTLM15         75 [+ o -] 4    115 [+ o -] 2
F. nygamai CTLM16          70 [+ o -] 3    125 [+ o -] 0
F. oxysporum CTLM17        84 [+ o -] 3    108 [+ o -] 6
F. oxysporum CTLM18        117 [+ o -] 8   161 [+ o -] 10
A. versicolor CTLM19            --               --
M. circinelloides CTLM20   53 [+ o -] 3    106 [+ o -] 1
F. oxysporum CTLM21        64 [+ o -] 3     90 [+ o -] 2
F inflexum CTLM22          104 [+ o -] 0   142 [+ o -] 0
R. dairenensis CTLM24 *    12 [+ o -] 3     70 [+ o -] 9

Cepas                         0.1 mM

                            [Cd.sup.+2]

F. oxysporum CTLM1         87 [+ o -] 3
F. oxysporum CTLM2         110 [+ o -] 3
F. oxysporum CTLM3         112 [+ o -] 4
P. digitatum CTLM4              --
F. temperatum CTLM5        29 [+ o -] 0
F. ramigenum CTLM6         31 [+ o -] 5
F. temperatum CTLM7             --
F. temperatum CTLM8        19 [+ o -] 4
F. fujikuroi CTLM9              --
F. nygamai CTLM10               --
P. vanluykii CTLM11             --
F. oxysporum CTLM12        51 [+ o -] 5
F. fujikuroi CTLM13        10 [+ o -] 3
P. rubens CTLM14           34 [+ o -] 7
F fujikuroi CTLM15              --
F. nygamai CTLM16               --
F. oxysporum CTLM17        33 [+ o -] 8
F. oxysporum CTLM18        110 [+ o -] 3
A. versicolor CTLM19            --
M. circinelloides CTLM20   97 [+ o -] 2
F. oxysporum CTLM21        24 [+ o -] 4
F inflexum CTLM22          98 [+ o -] 5
R. dairenensis CTLM24 *    11 [+ o -] 2

* Fue evaluada con la metodologia descrita para bacterias. Los valores
corresponden a la media de 4 repeticiones [+ o -] DS, y las letras
corresponde a los grupos a las cepas con mayores indices de tolerancia
de acuerdo al analisis de Duncan (P<0.05).

Tabla 3: Porcentaje de tolerancia a metales pesados de las bacterias
aisladas del suelo del Pasivo Minero Santa Rosa

Cepas                                       1 mM

                         [Pb.sup.+2]    [Cu.sup.+2]     [Zn.sup.+2]

B. cereus SSR1           9 [+ o -] 4    84 [+ o -] 7    80 [+ o -] 5
Serratia sp. SSR2             --             --         55 [+ o -] 8
B. subtilis SSR3         53 [+ o -] 2    8 [+ o -] 2    59 [+ o -] 17
S. epidermidis SSR4      26 [+ o -] 5    5 [+ o -] 1         --
Serratia sp. SSR5        50 [+ o -] 1        --         68 [+ o -] 4
B. licheniformis SSR6    23 [+ o -] 1   19 [+ o -] 0    92 [+ o -] 25
Serratia sp. SSR7        26 [+ o -] 1        --         64 [+ o -] 1
B. licheniformis SSR8    29 [+ o -] 4    6 [+ o -] 1     6 [+ o -] 1
S. epidermidis SSR10     38 [+ o -] 4    5 [+ o -] 1    69 [+ o -] 1
Serratia sp. SSR11       33 [+ o -] 0        --         67 [+ o -] 9
Enterobacter sp. SSR12   34 [+ o -] 5        --         78 [+ o -] 11
Serratia sp. SSR13       5 [+ o -] 0    20 [+ o -] 1    90 [+ o -] 2
B. cereus SSR14          36 [+ o -] 3    2 [+ o -] 0    72 [+ o -] 3
Serratia sp. SSR15       16 [+ o -] 4   98 [+ o -] 11   92 [+ o -] 4
B. subtilis SSR16        21 [+ o -] 4   39 [+ o -] 7    64 [+ o -] 1
B. subtilis SSR17        5 [+ o -] 1         --         80 [+ o -] 5
B. licheniformis SSR18   13 [+ o -] 1   10 [+ o -] 2    312 [+ o -] 2
B. subtlis SSR19         11 [+ o -] 2   12 [+ o -] 3    54 [+ o -] 11

Cepas                         1 mM            0.1 mM

                         [Ni.sup.+2]      [Ag.sup.+1]

B. cereus SSR1            78 [+ o -] 7    103 [+ o -] 10
Serratia sp. SSR2         77 [+ o -] 1          --
B. subtilis SSR3         109 [+ o -] 5          --
S. epidermidis SSR4       5 [+ o -] 1      5 [+ o -] 1
Serratia sp. SSR5         27 [+ o -] 1          --
B. licheniformis SSR6     76 [+ o -] 8          --
Serratia sp. SSR7         28 [+ o -] 1          --
B. licheniformis SSR8     10 [+ o -] 1     8 [+ o -] 1
S. epidermidis SSR10      5 [+ o -] 1      5 [+ o -] 0
Serratia sp. SSR11        18 [+ o -] 1          --
Enterobacter sp. SSR12    17 [+ o -] 2     6 [+ o -] 1
Serratia sp. SSR13        63 [+ o -] 9    143 [+ o -] 9
B. cereus SSR14           27 [+ o -] 3          --
Serratia sp. SSR15       166 [+ o -] 3    108 [+ o -] 10
B. subtilis SSR16         70 [+ o -] 9          --
B. subtilis SSR17         56 [+ o -] 6     50 [+ o -] 4
B. licheniformis SSR18   196 [+ o -] 20    6 [+ o -] 3
B. subtlis SSR19         100 [+ o -] 10         --

Cepas                                 0.1 mM

                         [Cr.sup.+6]     [Cd.sup.+2]

B. cereus SSR1           115 [+ o -] 9    98 [+ o -] 1
Serratia sp. SSR2        75 [+ o -] 3    114 [+ o -] 10
B. subtilis SSR3         20 [+ o -] 1     87 [+ o -] 2
S. epidermidis SSR4      29 [+ o -] 4          --
Serratia sp. SSR5        61 [+ o -] 4    102 [+ o -] 1
B. licheniformis SSR6    19 [+ o -] 1    102 [+ o -] 7
Serratia sp. SSR7        95 [+ o -] 1    109 [+ o -] 11
B. licheniformis SSR8    12 [+ o -] 2     85 [+ o -] 1
S. epidermidis SSR10     26 [+ o -] 1    105 [+ o -] 11
Serratia sp. SSR11       65 [+ o -] 4    86 [+ o -] 12
Enterobacter sp. SSR12   61 [+ o -] 7     93 [+ o -] 1
Serratia sp. SSR13            --         112 [+ o -] 3
B. cereus SSR14          59 [+ o -] 1     90 [+ o -] 1
Serratia sp. SSR15       78 [+ o -] 4    116 [+ o -] 3
B. subtilis SSR16        37 [+ o -] 7     88 [+ o -] 3
B. subtilis SSR17             --          78 [+ o -] 8
B. licheniformis SSR18   56 [+ o -] 1    253 [+ o -] 8
B. subtlis SSR19         70 [+ o -] 8     96 [+ o -] 8

Los valores corresponden a la media de 4 repeticiones [+ o -] DS, y
las letras corresponde a los grupos a las cepas con mayores indices de
tolerancia de acuerdo al analisis de Duncan (P<0.05).
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Title Annotation:Trabajos originales
Author:Munoz-Silva, Loyer; Olivera-Gonzales, Percy; Santillan-Torres, Miguelina; Tamariz-Angeles, Carmen
Publication:Revista peruana de biologia
Date:Feb 1, 2019
Words:7959
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