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Metodo de diagnostico para el monitoreo de resistencia a insecticidas en poblaciones de "picudo del algodonero", Anthonomus granais (Coleoptera: Curculionidae).

A diagnostic test for insecticide resistance monitoring in "cotton boll weevil" Anthonomus granais (Coleoptera: Curculionidae) populations

Las poblaciones de Anthonomus grandis Boheman son deficientemente controladas a traves de sus enemigos naturales, de modo que el control quimico es, por el momento, la herramienta mas efectiva contra esta plaga (Stadler & McKibben, 1997; Stadler, 1996). Sin embargo, diferentes autores han senalado que la aplicacion intensiva y extensiva de insecticidas, en la lucha contra A. grandis en EEUU, provoco un rapido desarrollo de resistencia, que fue relevada tempranamente en ese pais (Roussel & Clower, 1957; Graves et al., 1967).

Para identificar las causas de los fenomenos de resistencia, se requiere el estudio de los mecanismos bioquimicos que la confieren, asi como del grado de seleccion de los mismos. En cambio, para determinar los cambios en la susceptibilidad a un principio activo, basta con someter un grupo representativo de una poblacion de la plaga a bioensayos toxicologicos (Robertson & Preisler, 1992). Sobre la base de esta informacion, los factores operacionales tales como tipo de insecticida, dosis y modo de aplicacion, pueden seleccionarse para conformar una estrategia que permita retrasar el desarrollo de la resistencia, y prolongar la vida util de los insecticidas en uso. Por estos motivos, el monitoreo de resistencia a insecticidas es una eficaz herramienta para detectar a tiempo la aparicion de focos donde se presenta este fenomeno, evitando el fracaso de las medidas de control y los inconvenientes asociados (Frisbie et al., 1989).

El objetivo del presente trabajo es describir en forma detallada una nueva tecnologia para el diagnostico en el campo, de los focos de resistencia a insecticidas en poblaciones de A. grandis (Stadler et al., 2008) para que la misma pueda ser transcrita y aplicada por investigadores y extensionistas, en funcion de optimizar la eficiencia de las campanas de control de esta plaga tan destructiva. Esta nueva tecnologia puede ser aplicada en el campo y en el marco de las condiciones geograficas, economicas y socio-culturales de la region algodonera argentina. El "kit" de monitoreo de resistencia representa un avance en las practicas de control de la plaga, ya que permite optimizar las estrategias de manejo, a traves de la alternancia de productos y la reduccion del impacto ambiental como consecuencia del uso racional de agroquimicos.

Fundamento del metodo de diagnostico de resistencia

El metodo se basa en la "tecnica del vial" (Kanga & Plapp, 1992), que consiste en exponer los insectos adultos recolectados en el campo a una concentracion discriminante (CD) del insecticida a evaluar y aplicada en las paredes internas de viales de vidrio boro-silicato (Fig. 1; Stadler et al., 2008). La concentracion discriminante se calcula a partir del valor de la concentracion letal 99 [CD se define como el doble de la CL99 (Robertson & Preisler, 1992)]. Finalmente, el diagnostico de la resistencia se realiza a partir del porcentaje de mortalidad de los insectos expuestos al insecticida.

Materiales para el desarrollo del metodo de diagnostico de resistencia a insecticidas

Trampa para la recoleccion de insectos adultos: La trampa Scout modificada (Fig. 2 [Stadler et al., 2008]) se utiliza para capturar el numero de insectos suficiente para el ensayo ([mayor que o igual a] 100) y asegurar su supervivencia por, al menos, 24 horas hasta su incorporacion al "kit". Las modificaciones introducidas en la trampa Scout comprenden la incorporacion de un recipiente de polietileno de 9 cm de alto por 8 cm de diametro (Fig. 2 a) que contiene la feromona, y un aro de esponja sintetica embebida en agua (Fig. 2 b) para evitar la deshidratacion de los insectos.

Dispositivo para la impregnacion de viales con insecticida: Este dispositivo fue disenado para revestir las paredes internas de viales de vidrio boro-silicato, de 20ml de capacidad, con una pelicula uniforme del insecticida (Fig. 3; Stadler et al., 2008). Consta de un marco metalico y cinco rodillos torneados que forman canales (Fig. 3 a), donde se depositan 16 viales (Fig. 3 b). Los rodillos giran siete vueltas por minuto y son movidos sincronicamente por un motor electrico con reductor de velocidad. A ambos lados de los rodillos, se encuentran dos niveles que permiten asegurar la horizontalidad del sistema (Fig. 3 c) y garantizar asi, la uniformidad de la pelicula de insecticida que se deposita sobre las paredes internas de los viales. El dispositivo sobre el cual rotan los viales (Fig. 3) opera dentro de una estufa (Fig. 4a), donde se acelera el proceso de evaporacion del solvente de la solucion insecticida que esta en los viales, mientras se impregnan uniformemente las paredes internas de los mismos. La estufa consiste en un cubo con paredes de acrilico transparente (Fig. 4 b) y un sistema de calefaccion, que permite mantener la temperatura a 30 [+ o -] 2[grados]C durante el proceso de secado. La circulacion del aire dentro de la estufa es continua y forzada a traves de un sistema de ventilacion (Fig. 3 d, c).

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

Kit para el diagnostico de resistencia a insecticidas: La funcion del "kit" de diagnostico es exponer los insectos al insecticida, para el cual se desean monitorear los cambios en la susceptibilidad. El "kit" de diagnostico (Fig. 1) consiste en una caja de carton corrugado (14,5 x 14,5 x 8,5 cm) con tapa y divisiones internas, tiene 25 viales de vidrio boro-silicato con cierre hermetico, 20 de ellos contienen la concentracion discriminante del insecticida [pseudo-replicas] y los cinco restantes son testigos. Los valores de toxicidad ([CL.sub.99]), para calcular la concentracion discriminante (CD) de insecticidas para la preparacion del "kit", se obtienen a partir de bioensayos de laboratorio por el metodo del film (contacto tarsal) dentro de los mismos viales.

A los lados de la caja del "kit" se encuentran las instrucciones para su uso (Tabla I), las recomendaciones y advertencias (Tabla II) y un modelo, a modo de ejemplo, para realizar el diagnostico del ensayo (Tabla III; Stadler etal., 2008).

Planilla de datos y resultados que acompanan al kit: La planilla que acompana al "kit" consiste en un formulario con casilleros, en la que se volcara la informacion complementaria y los resultados del ensayo (numero de insectos vivos y muertos) a las 24 horas de iniciado el mismo (Tabla 4; Stadler et al., 2008).

Preparacion de los viales para el armado del kit

1.--Establecer el tipo de insecticida a utilizar para el control de A. grandis, sobre la base de estudios previos de eficacia (Stadler & McKibben, 1997; Mulrooney, 2002) en el marco del programa de manejo de plagas establecido para cada region.

2.--Determinar la [CL.sub.99] por el metodo del film, dentro de viales de vidrio borosilicato de 20mL para el insecticida seleccionado (ver punto 1), sobre la base de una muestra representativa de insectos provenientes de diferentes localidades de la zona a monitorear (Zerba et al, 1999, 2001).

3.--Calcular la CD (Robertson & Preisler, 1992).

4.--Enjuagar 3 veces los 25 viales de vidrio boro-silicato de 20mL, con 5mL de acetona y dejar evaporar completamente. Rotular con numeros los viales y tapas respectivas.

5.--Preparar una solucion del insecticida, utilizando un solvente adecuado (eter, acetona, etc.) en una concentracion tal, que cada 0,3mL de la solucion contenga la dosis discriminante calculada (ver punto 3; Zerba et al, 1999, 2001). Ejemplo: Si la dosis discriminante para la cipermetrina es de 58,2 pg/vial, deben prepararse 10mL de una solucion que contenga 1,94 mg de insecticida.

6.--Colocar 20 viales limpios y secos (ver punto 4) sobre el dispositivo para impregnacion (Fig. 3) y colocar dentro de cada uno, 0,3mL de la solucion insecticida (ver punto 5) previamente preparada. Ejemplo: 58,2 [micron]g de cipermetrina en 0,3mL de solucion/vial [viales tratados].

7.--Completar el proceso de secado y formacion de la pelicula de insecticida en la estufa (Fig. 4).

8.--Colocar 5 viales limpios y secos sobre el dispositivo para impregnacion y colocar dentro de cada uno, 0,3mL del solvente [viales control].

9.--Completar el proceso de secado en la estufa (Fig. 4).

10.--Colocar los 25 viales en la caja del "kit" (Fig. 1), cerrar y conservar en lugar fresco y al abrigo de la luz.

[TABLA 4 OMITIR]

Procedimiento para el monitoreo de resistencia

I.--Colocar trampas Scout modificadas en la zona a muestrear, en numero suficiente para obtener muestras representativas. En funcion de la extension del area a registrar y del numero de muestras disponibles, es posible utilizar varios "kit" para las distintas zonas en una region. En caso de disponer de un numero relevante de trampas, pero de pocos insectos en cada una, pueden agruparse los insectos en un pool y extraerlos al azar para completar los frascos.

II.--Luego de un periodo de captura de 24 hs, recoger las trampas y colocar los insectos dentro de los viales de un "kit", de acuerdo al criterio expuesto (ver punto I). De los insectos capturados, se introduce un minimo de 4 a un maximo de 10 insectos por vial (segun disponibilidad) hasta completar los 25 viales que componen el "kit" (Fig. 1).

III.- Colocar el "kit" en un sitio resguardado y al abrigo de la luz.

IV.--Evaluar mortalidad luego de 24 horas de exposicion, anotar los valores en la planilla "ad hoc" (Tabla IV) y completar la misma con la informacion complementaria.

V.--Realizar el diagnostico en base al ejemplo (Tabla III). Cuando la mortalidad en los frascos tratados resulta menor del 100%, es recomendable repetir el test antes de alternar el insecticida.

VI.--Incorporar la informacion contenida en la planilla (Tabla IV) a un sistema de informacion geografica (Ravelo et al, 2001).

[FIGURA 3 OMITIR]

Validacion del kit de monitoreo de resistencia a insecticidas para A. granais

Para establecer la fecha de caducidad del "kit", Zerba et al. (1999, 2001) determinaron la vida media de los insecticidas dentro de los viales sobre la base de CIPAC MT 46 y del analisis por cromatografia de gases; se fija la fecha de vencimiento del "kit" a los doce meses de la fecha de preparacion. Las CD para malation y cipermetrina, asi como el empleo del "kit" y el metodo de monitoreo en su conjunto, fueron validados por Zerba et al. (1999, 2001) a traves de ensayos en los campos experimentales del Instituto Agronomico Parana-IAPAR (Londrina-Brasil), en el Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Geneticos y Biotecnologia EMBRAPA--CENARGEN (Brasilia-Brasil) y en el Instituto Agronomico Nacional-IAN del Ministerio de Agricultura y Ganaderia (Caacupe-Paraguay).

[FIGURA 4 OMITIR]

Consideraciones finales

Los insecticidas son una pieza clave en los programas de manejo integrado de plagas (MIP). Sin embargo, a partir del auge de los insecticidas organo-clorados en los anos '40, un promedio de una clase de insecticida cada diez anos se ha perdido, a causa del fenomeno de resistencia. Por este motivo, un componente principal del MIP es el manejo de la resistencia a insecticidas (MRI), cuya funcion es prevenir el desarrollo de la misma a metodos especificos de control de plagas, tales como los productos fitosanitarios.

El metodo de diagnostico de resistencia en el campo, que se describe en este trabajo, puede ser inmediatamente incorporado en un programa de control de A. grandis, ya que es compatible con las practicas de MIP en el cultivo del algodon. Los resultados obtenidos, a las 24 horas de aplicado este metodo, permiten diagnosticar "in situ" y sin necesidad de estudios bioquimicos de laboratorio, posibles focos de resistencia y, de ser necesario, identificar un insecticida alternativo y proponer la tecnica de control apropiada.

Incorporando las modificaciones pertinentes a nivel de muestreo, tipo de sustancia y CD, el uso de este metodo de diagnostico puede hacerse extensivo al monitoreo de resistencia a insecticidas quimicos y/o biologicos, en poblaciones de diferentes especies de insectos plaga de la agricultura, asi como tambien de parasitos y vectores de enfermedades humanas y animales. El "kit" es aplicable en todos aquellos casos en los que la deteccion temprana de la resistencia a insecticidas resulte una alternativa viable para evitar fracasos en campanas de control de plagas y representa, ademas, una contribucion significativa a la reduccion de los riesgos derivados del uso de pesticidas para el hombre y el ambiente.

AGRADECIMIENTOS

El autor agradece a la Lic. Maria Ines Zerba y a la Ing. Agr. Dolores Martinez Gines por su intensa y profesional participacion en el proceso de validacion y optimizacion de este importante desarrollo tecnologico para el control de una plaga clave, que pone en riesgo la economia de la region algodonera argentina. Agradezco tambien la colaboracion del Instituto Agronomico Parana-IAPAR (Londrina-Brasil), del Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Geneticos y Biotecnologia (EMBRAPA-CENARGEN, Brasilia-Brasil) y del Instituto Agronomico Nacional-IAN del Ministerio de Agricultura y Ganaderia (Caacupe-Paraguay) por poner a disposicion de este proyecto sus instalaciones y campos experimentales. Este trabajo fue financiado por el Common Fund for Commodities a traves del "Project on Integrated Pest Management of the Cotton Boll Weevil in Argentina, Brazil and Paraguay CFC/ICAC/04".

BIBLIOGRAFIA CITADA

(1.) CIPAC. 1995. MT 46 Accelerated storage procedure. En: Dobrat, W. & A. Martijn (eds.) CIPAC Handbook Physio-chemical Methods for Technical Formulated Pesticides: 148-152.

(2.) FRISBIE, R. E., K. EL ZIK, & L.T. WILSON. 1989. Integrated Pest Management systems and cotton production. Wiley, New York, 437 pp.

(3.) GRAVES, J. B., J. S. ROUSSEL, J. GIBBENS & D. PATTON. 1967. Laboratory Studies on the Development of Resistance and Cross-Resistance in the Boll Weevil. J. Econ. Entomol. 60: 47-50.

(4.) KANGA, L. H. B. & F. W. PLAPP Jr. 1992. Development of a glass vial technique for monitoring resistance to organophosphate and carbamate insecticides in the tobacco budworm and the boll weevil. En: Proc. Beltwide Cotton Prod. and Res. Conf., National Cotton Council, Memphis, TN, pp 731-734.

(5.) MULROONEY, j. E. 2002. Efficacy of fipronil aerially applied in oil adjuvants and drift retardants against boll weevils, Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera:Curculionidae) Southw. Entomologist 27(2): 201-208.

(6.) ROBERTSON, j. L. & H. K. PREISLER. 1992. Pesticide Bioassays with Arthropods. CRC Press. Boca Raton, FL, 127pp.

(7.) RAVELO, A. C., M. GRILLI & j. A. SANTA. 2001. Monitoreo del picudo del algodonero mediante utilizacion de informacion satelital y terrestre. En: Proceedings of the Cotton in the Southern Cone--Project on Integrated Pest Management of the Cotton Boll Weevil in Argentina, Brazil and Paraguay CFC/ICAC/04, PART 1, 26-28 Fortaleza, Brazil, pp. 215-224.

(8.) ROUSSEL, j. S. & D. F. CLOWER. 1957. Resistance to Chlorinated Hydrocarbon Insecticides in the Boll Weevil. J. Econ. Entomol. 50: 462-468.

(9.) STADLER, T. 1996. Susceptibilidad a Insecticidas y Fenomenos de Resistencia a Insecticidas en Poblaciones de Anthonomus grandis. En: Proceedings Integrated Pest Management of the Cotton Boll Weevil in Argentina, Brazil and Paraguay, Londrina-Brasil, pp. 153-162.

(10.) STADLER, T. & G. H. McKIBBEN. 1997. Dose-mortality response of the cotton boll weevil Anthonomus grandis Boheman, 1843 (Coleoptera: Curculionidae) to selected insecticides. Arthropod Management Tests 22: 416.

(11.) STADLER, T. & M. BUTELER. 2007. Migration and dispersal of Anthonomus grandis (Coleoptera: Curculionidae) in South America. Rev. Soc. Entomol. Argent. 66 (3-4): 205-217.

(12.) STADLER, T., M. I. ZERBA & D. MARTINEZ GINES. 2008. Metodo para el diagnostico a campo de resistencia a insecticidas quimicos y biologicos en poblaciones de insectos plaga de la agricultura y parasitos o vectores de enfermedades humanas y animales. Patente de INVENCION, MOSP: P19990106270/1999; INPI. Res N AR025279B1/2008; Titular CONICET.

(13.) ZERBA, M. I., D. MARTINEZ GINES & T. STADLER. 1999. Development of a protocol for pesticide resistance monitoring on Anthonomus grandis'. En: Proceedings of the Cotton in the Southern Cone--Project on Integrated Pest Management of the Cotton Boll Weevil in Argentina, Brazil and Paraguay CFC/ICAC/04, PART 1,26-28 Fortaleza, Brazil, 2001, pp. 159-163.

(14.) ZERBA, M. I., D. MARTINEZ GINES & T. STADLER. 2001. Nuevo metodo de diagnostico a campo de resistencia a insecticidas para el picudo del algodonero (Anthonomus grandis). En: Proceedings of the Cotton in the Southern Cone--Project on Integrated Pest Management of the Cotton Boll Weevil in Argentina, Brazil and Paraguay CFC/ICAC/04, PART 1, 26-28 Fortaleza, Brazil, pp. 249-256.

STADLER, Teodoro

Laboratorio de Toxicologia Ambiental, Instituto de Medicina y Biologia Experimental de Cuyo (IMBECU), Centro Regional de Investigaciones Cientificas y Tecnologicas (CRICYT CONICET), CC. 131, M5500 IRA, Mendoza, Argentina; e-mail: lpe@mendoza-conicet.gov.ar
Tabla I. Instrucciones. Informacion que se encuentra en uno de los
lados de la caja del "kit" de monitoreo (Stadler et al., 2008).

INSTRUCCIONES VENCE:   Mes[] Ano []

1. Verificar la fecha de vencimiento.

2. Introducir cuidadosamente 4 a10 insectos adultos sanos en cada
   frasco siguiendo el orden de la numeracion indicada en los frascos.
   Tapar bien cada frasco y ubicarlo en su posicion original dentro de
   la caja.

3. Cerrar la caja y ubicarla con el lado indicado hacia arriba en
   un lugar fresco y a la sombra.

4. Transcurridas 24 horas, observar el numero de insectos vivos y
   muertos en cada frasco y anotar los datos en la planilla
   correspondiente respetando la numeracion.

5. Finalizado el diagnostico, entregar la caja utilizada y la
   planilla a la agencia responsable del monitoreo.

Tabla II. Recomendaciones y advertencias. Informacion que se
encuentra en uno de los lados de la caja del "kit" de monitoreo
(Stadler et al., 2008).

RECOMENDACIONES

--Se recomienda utilizar una caja por lote de igual manejo
fitosanitario.

--En caso de escasa infestacion, completar la mayor cantidad de
frascos posible con un minimo de 5 frascos.

ADVERTENCIAS

--No utilizar los insectos danados o con comportamiento anormal.

--No utilizar insectos provenientes de trampas de redes de
monitoreo.

--No intercambiar insectos entre frascos.

--No abrir los frascos hasta el momento de ser utilizados.

Tabla III. Guia para realizar el diagnostico de resistencia con los
tres resultados posibles del monitoreo. Informacion que se encuentra
en uno de los lados de la caja del "kit" de monitoreo (Stadler et
al., 2008).

                       RESULTADO--MORTALIDAD EN:
CASO
           FRASCOS TESTIGO               FRASCOS CON
        (No 3, 8, 13, 18 y 23)           INSECTICIDA
                                          (tratados)

1           Mayor del 20%          Ensayo NO valido por la
          Mas de 4 insectos         alta mortalidad en los
          muertos del total            frascos testigo.
          de picudos de los
        frascos testigo (20).

2           Menor del 20%                    100%
        Menos de 4 muertos del    Todos los insectos muertos
       total de picudos de los              en los
        frascos testigo (20).      frascos con insecticida.

3           Menor del 20%               Menor del 100%
        Menos de 4 muertos del         Algunos insectos
       total de insectos de los    vivos en los frascos con
        frascos testigo (20).            insecticida.

CASO
                DIAGNOSTICO

1             Repetir ensayo
       la recoleccion de insectos y
         repetir el procedimiento
       respetando las instrucciones
                  de uso.

2        Susceptibilidad esperada
          El producto es eficaz.

3        Susceptibilidad alterada
         Sospecha de resistencia *
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Title Annotation:NOTA CIENTIFICA
Author:Stadler, Teodoro
Publication:Revista de la Sociedad Entomologica Argentina
Date:Jan 1, 2009
Words:3280
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