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Medicion de la citotoxicidad y produccion de citocinas en fibroblastos gingivales humanos estimulados con Mercurius-Heel[R]S: un estudio piloto.

Cytotoxicity measurement and cytokine production in human gingival fibroblasts stimulated with Mercurius-Heel[R]S: Pilot Study

Medicao de citotoxidade e producao de citocinas em fibrobastos gengivais humanos estimulados com Mercurius--Heel[R][R]S: Estudo piloto

Introduccion

La enfermedad periodontal es una patologia de origen infeccioso, caracterizada por ocasionar secuelas destructivas al tejido de soporte del diente; producto de una elevada respuesta inflamatoria. Es asi, como el tratamiento va encaminado a la destruccion de los agentes etiologicos, control en la respuesta inflamatoria y la regeneracion periodontal (Chen & Jin 2010). Los intentos para controlar una exacerbada respuesta inflamatoria del huesped durante el curso de la enfermedad periodontal, involucran farmacos complementarios a la terapia basica (Sinha et al. 2012). Una alternativa es la medicina antihomotoxica (Clausen et al. 2011, Almirantis 2013).

La homotoxicologia fue desarrollada en el ano 1955 por el medico aleman Hans--Heinrich Reckeweg, sin embargo, el reciente interes de los medicos y odontologos en proveer terapeuticas naturales que estimulen, controlen y fortalezcan el sistema inmunitario de su paciente, ha fomentado el planteamiento de proyectos innovadores en odontologia, ciencia en la cual se ha iniciado la aplicacion por pocos periodoncistas con medicamentos antihomotoxicos como coadyuvantes a su tratamiento tradicional (Mathie & Farrer 2007, Shaw 2010, Eames & Darby 2011).

Actualmente, se han establecido diversos protocolos de manejo biologico que incluyen este tipo de medicamentos, los cuales son administrados en dosis diluidas (decimales y centesimales) adecuados para cada patologia (de Oliveira et al. 2011). El Mercurius-Heel[R]S, es uno de estos medicamentos, indicado en procesos infecciosos y con propiedades anti-inflamatorias. Es propuesto como parte del tratamiento de base o primera eleccion en la via oral para el manejo de la gingivitis, abscesos, aftas orales y para el tratamiento sintomatico de la periodontitis; enfatizando su utilidad en enfermedades supurativas e inflamatorias no solo a nivel oral sino tambien en tejidos periamigdalares (Mousavi et al. 2009, de Oliviera et al. 2011, Nayak et al. 2012, Farrer et al. 2013). En un estudio realizado recientemente en el reino unido, evaluaron la prescripcion homeopatica en enfermedad periodontal aguda y cronica hecha por tres odontologos a 51 pacientes durante 18 meses, encontrando resultados positivos en cuanto a la reduccion de la bolsa periodontal, sugiriendo que la homeopatia es un area promisoria en el tratamiento de la enfermedad periodontal (Farrer et al. 2013).

Su composicion es Mercurius solubilis Hahnemanni D10 consistente en mercurio amidonitrato, Heparsulfuris D8, Lachesis D12, Phytolacca americana D4, Ailanthus altissima D3, Echinacea angustifolia D3 30 mg, Atropa belladonna D4. Sus excipientes son estearato de magnesio y lactosa.

El mercurius solubilis, uno de los componentes principales de Mercurius-Heel[R]S, es extraido del cinabrio y esta presente en fuentes termales y volcanes. Cuando es utilizado en homotoxicologia y homeopatia, es disuelto en acido nitrico, formando particulas que se secan y se pulverizan (de Oliveira et al. 2011, Almirantis 2013). La seguridad y citotoxicidad de Mercurius-Heel[R]S sobre fibroblastos gingivales, representan un obstaculo etico para la implementacion clinica de este tipo de medicamento. De igual manera no se ha documentado si los efectos nocivos ocasionados a la intoxicacion por mercurio aparecen como resultado de la administracion de este medicamento (Datta et al. 2004). Aunque los indices terapeuticos sugeridos por el laboratorio farmaceutico Heel es disolver bajo la lengua una tableta tres veces al dia aclaran que dentro de las reacciones adversas producidas por este medicamento puede presentarse sialorrea y casos de hipersensibilidad en casos aislados de acuerdo al tratado practico de medicina bioreguladora (consultar: www.heel.es/pdfs/B.pdf).

Los fibroblastos gingivales, son celulas con diferentes funciones en el periodonto como son la produccion y mantenimiento de la lamina propia del tejido gingival blando, ademas de la formacion de fibras de colageno y elastina y participan activamente en los eventos inmunes e inflamatorios de la enfermedad periodontal (Acosta 2006). Junto a estos fibroblastos y otras celulas de defensa, se producen citocinas pro-inflamatorias (Ara et al. 2013, Baek et al. 2013) como la Interleucina 1[beta] (IL 1[beta]; Bhawal et al. 2012, Sawada et al. 2013), Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF[alfa]; Guimaraes et al. 2011, Arancibia et al. 2013) y citocinas anti-inflamatorias como lainterleucina10 (IL-10); que controla una respuesta inflamatoria exacerbada (Morandini et al. 2011, Gomez-Florit et al. 2013). De esta forma, la regulacion de las funciones de remodelacion del tejido conectivo y respuesta inflamatoria de los fibroblastos gingivales con medicamentos antihomotoxicos, podria tener un gran potencial terapeutico en periodoncia (Saini et al. 2012). El objetivo de esta investigacion, fue establecer el efecto de Mercurius-Heel[R]S sobre fibroblastos gingivales cultivados in vitro en diferentes tiempos y concentraciones, con el fin de dar una explicacion cientifica al uso del Mercurius-Heel[R]S en enfermedades orales como la periodontitis.

Materiales y metodos

Este estudio fue dividido en dos fases: 1. En la primera fase, se establecio la viabilidad de los fibroblastos gingivales humanos cultivados in vitro estimulados durante 15 minutos y 2 horas con Mercurius-Heel[R]S y 2. En la segunda fase se determinaron los perfiles de citocinasproinflamatorias: Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNF[alfa]) e Interleucina 1 Beta (IL 1 [beta]) y antinflamatorias: Interleucina 10 (IL10), que fueron producidas por los fibroblastos luego de su estimulo.

Cultivo celular: Se utilizaron fibroblastos gingivales humanos ATCC CRL-2014 obtenidos del Centro de Investigaciones Odontologicas de la Facultad de Odontologia de la Pontificia Universidad Javeriana. Las celulas fueron cultivadas de acuerdo a las recomendaciones de ATCC con medio D-MEM (medio esencial modificado de Dulbecco) suplementado con Suero Fetal Bovino (SFB) al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina (SIGMA, USA). Los pases se realizaron mediante desprendimiento enzimatico, con tripsina 0.25% (SIGMA, USA) y EDTA 1mM (GIBCO) a 37[grados]C durante 2 minutos. Transcurrido ese tiempo se inactivo la tripsina con medio DMEM suplementado y se centrifugo durante 5 minutos a 2000 rpm.

Preparacion de Mercurius-Heel[R]S: Se trituraron 2 tabletas de 300 mg de Mercurius-Heel[R]S, (Biologische Heilmittel Heel GmbH. Berlin-Alemania) en un triturador de pastillas de Acu--Life[R] y posteriormente fueron anadidas al DMEM para lograr las concentraciones deseadas 300 mg/ml a 0.0005 mg/ml, realizando diluciones en base de 3 a partir de 300 mg/ml.

Prueba de citotoxicidad: La prueba utilizada fue un ensayo colorimetrico utilizando el reactivo de tetrazolio (MTS: 3--(4,5--dimethylthiazol--2--yl)--5 --(3--carboxymethoxyphenyl)--2--(4--sulfophenyl)--2H--tetrazolium, inner salt) Promega[R]. Para esta prueba se utilizaron placas de 96 pozos y se sembraron 4.000 celulas por pozo de acuerdo a lo recomendado por el fabricante. Se permitio su adherencia durante 24 horas, se cambio el medio y se aplicaron los tratamientos por triplicado con Mercurius-Heel[R]S, a concentraciones de 300 mg/ml a 0.0005 mg/ml, durante 15 minutos y 2 horas y se retiro el tratamiento (Figura 1). El grupo control consistio en celulas mantenidas en medio de cultivo y no tratadas. Posteriormente fue colocado a cada pozo medio D--MEM completo y se incubo por 24 horas mas. Transcurrido ese tiempo se adiciono el reactivo MTS segun las recomendaciones del fabricante. Finalmente luego de 2 horas fueron leidas en el espectrofotometro a 490 nm.

[FIGURA 1 OMITIR]

Medicion de citocinas: En la segunda fase se realizo el Ensayo Inmunoenzimatico Ligado a Enzimas (ELISA) para establecer perfiles de citocinas, para esta prueba se utilizaron cajas de cultivo de 25 [cm.sup.2] colocando 500.000 celulas por caja manteniendo la misma proporcion de celulas por area de crecimiento utilizada en la prueba de citotoxicidad. Transcurridas 24 horas posteriores al tratamiento se tomaron los sobrenadantes que inmediatamente fueron colocados a -70[grados]C hasta su uso para determinar la concentracion de Interleucina 1 Beta (IL 1[beta]), Interleucina 10 (IL10) y Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNF[alfa]). Los controles fueron de forma similar a la prueba del MTS. Se seleccionaron las concentraciones de 0,13 mg/ml a 0,0005 mg/ml y se utilizo la concentracion de 300 mg/ml como referencia a la cantidad de Mercurius presente por tableta. Los kits utilizados fueron Quantiquine (R&D Systems), siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Analisis estadistico: En la primera parte del analisis estadistico, se inicio evaluando si las variables seguian distribucion normal utilizando la prueba de Shapiro Wilk. Dado que no se identificaron desviaciones de dicha distribucion, se supusieron normales. Luego se compararon los promedios entre cada uno de los grupos a traves de la prueba t para grupos independientes. Posteriormente, se realizo un analisis descriptivo que permitio establecer perfiles de citocinas producidos por fibroblastos gingivales cultivados in vitro y estimulados con Mercurius-Heel[R]S.

Resultados

Se presentan los datos del promedio de absorbancia y el porcentaje de viabilidad segun los diferentes tiempos de exposicion al Mercurius-Heel[R]S (Tabla 1). Se observo, que los porcentajes de viabilidad fueron los tratamientos de 15 minutos con respecto al de las dos horas. Al realizar comparacion entre estos dos tiempos, se observaron diferencias significativas p = 0.009, observando que los resultados obtenidos luego de 15 minutos de tratamiento muestran mayor proliferacion celular con respecto a las 2 horas.

Por otra parte, los porcentajes de viabilidad independientemente del tratamiento de 15 minutos y 2 horas (Tabla 1), arrojo concentraciones mas bajas de Mercurius-Heel[R]S aproximadamente desde la concentracion de 3,7 mg/ml hasta 0.0005 mg/ml.

A los 15 minutos de tratamiento, se observaron diferencias significativas a partir de la concentracion de 3,7 mg/ml de Mercurius-Heel[R]S con respecto al control (celulas sin tratamiento) p < 0,001, mientras que a las dos horas de tratamiento, se observaron diferencias significativas a las concentracion de 3,7 mg/ml a 0,4 mg/ml y de 0,015 mg/ml a 0,0005 mg/ml de Mercurius-Heel[R]S con respecto al control p = 0,0005.

Estos resultados sugieren en primer lugar que el medicamento no muestra ningun efecto citotoxico sobre los fibroblastos gingivales en las concentraciones y tiempos evaluados. En segundo lugar, se muestra que a los 15 minutos (tiempo aproximado en disolverse una tableta del medicamento en boca) se observa incluso proliferacion celular en comparacion a las celulas no tratadas.

En la segunda fase del estudio, se evaluaron las concentraciones de citocinas producidas por los fibroblastos gingivales humanos luego del estimulo del Mercurius-Heel[R]S. Ver perfiles de IL-1 [beta], TNF[alfa], e IL-10 (Figura 1). En este caso y basados en los resultados del MTS las celulas fueron tratadas a concentraciones de 300 mg/ml y desde 0,13 mg/ml hasta 0,0005 mg/ml de Mercurius-Heel[R]S; concentraciones que presentaron mayor viabilidad celular.

Con respecto a la IL-1[beta] (Figura 1a) se observa en general mayor produccion en concentraciones intermedias del tratamiento (0.13 a 0.005 mg/ml) mientras que, a concentraciones bajas (0.0005 mg/ml) y elevadas (300 mg/ml) del medicamento su produccion fue menor. A traves del tiempo (15 minutos y dos horas) de exposicion, no se observaron diferencias significativas ni entre tiempos ni entre tratamientos p = 0,71 y p = 0,18 respectivamente.

En referencia al TNF[alfa] (Figura 1b), no se observa tendencia definida relacionada con las concentraciones en ninguno de los tiempos estudiados. Sin embargo, la mayor produccion se observa a 0.13 y 0.01 mg/ ml tanto a los 15 minutos como a las 2 horas. En las menores concentraciones de 0.005, 0.0005 mg/ml, asi como en altas concentraciones 300 mg/ml y 0.04 mg/ ml de Mercurius-Heel[R]S disminuye la produccion de TNF[alfa] por parte de los fibroblastos gingivales humanos. Al comparar la cinetica de esta citocina es muy similar tanto a los 15 minutos como a las 2 horas de tratamiento. No se observan diferencias significativas en estos tiempos p = 0,66. Con respecto a los diferentes tratamientos tampoco se observaron diferencias significativas p = 0,16.

Por ultimo, la produccion de IL-10 (Figura 1c) fue la citosina, que junto con la IL1[beta] tuvieron menor concentracion en el presente estudio (menor a 400 mg/ml de citocina). Se puede observar que tanto a los 15 minutos como a las 2 horas, existe tendencia a aumentar la concentracion de IL-10 a medida que disminuye la concentracion de Mercurius-Heel[R]S, encontrandose las concentraciones mas altas de esta citocina a los 0.0005 mg/ml. Contrario a esto, las concentraciones mas bajas de IL-10 se observan a mayor concentracion del medicamento (300 mg/ml). Adicionalmente, la produccion resulta similar a los 15 minutos comparada con las 2 horas. No se observan diferencias significativas ni entre tiempos ni entre tratamientos p = 0,98 y p = 0,34 respectivamente.

Discusion

Esta investigacion, se planteo con el fin de determinar el efecto del Mercurius-Heel[R]S sobre la viabilidad de los fibroblastos gingivales humanos cultivados in vitro; con el fin de ver su posible uso como parte del tratamiento de la enfermedad periodontal. Esta enfermedad esta caracterizada por respuesta inflamatoria generada por bacterias periodontopatogenas como la Porphyromona gingivalis ocasionando reabsorcion osea y perdida en el tejido de soporte del diente (Hajishengallis et al. 2011, Glowacki et al. 2013).

El Mercurius-Heel[R]S es administrado colocando una tableta de forma sublingual, hasta que se disuelva en boca tres veces al dia, de acuerdo a lo recomendado por el laboratorio farmaceutico que lo produce. Un estudio realizado por Farrer et al. (2013), evaluo la prescripcion homeopatica en enfermedad periodontal aguda y cronica principalmente con Heparsulphuris, Arsenicumalbum, Calcarea carbonicum, Mercurius corrosivus, entre otros. Dichas prescripciones fueron hechas por tres odontologos a 51 pacientes durante 18 meses en el Reino Unido, encontrando resultados positivos en cuanto a la reduccion de la bolsa periodontal; sugiriendo que la homeopatia es un area promisoria en el tratamiento de la enfermedad periodontal.

Se ha propuesto que el Mercurius-Heel[R]S puede ser utilizado para diversas patologias orales como gingivitis y periodontitis, sin embargo no se ha documentado el efecto que presenta este medicamento en los fibroblastos gingivales humanos; debido a que estas celulas son importantes para la cicatrizacion y regeneracion periodontal (Acosta 2006) y pueden estar en contacto con el farmaco debido a su via de administracion.

El principal hallazgo fue el aumento de la viabilidad celular. Se observo que el Mercurius-Heel[R]S no presento ningun efecto citotoxico en los fibroblastos gingivales humanos, al utilizar concentraciones entre 300 mg/ml (una tableta) a 0,0005 mg/ml. Al igual que en el estudio de Oliveira et al. (2011), se obtuvo tambien resultados en concentraciones bajas del medicamento, lo que favorece lo descrito por la homotoxicologia, donde se considera que cuanto mas diluido este un medicamento homeopatico, mas potentes es (Gold et al. 2008, Novella et al. 2008, Rutten 2011). Por otra parte, se observo que en periodo corto (15 minutos) es suficiente para obtener buenos resultados, tiempo en el cual la tableta se disuelve en boca (Chandira et al. 2010, Patel et al. 2010), y su efecto puede observarse hasta 48 horas despues de ejercido el estimulo.

En la segunda fase del estudio, se establece que los niveles de citocinas pro-inflamatorias TNF[alfa] e IL--1 [beta] producidas por fibroblastos tratados con Mercurius-Heel[R]S son mayores a concentraciones bajas del medicamento; siendo muy poca la diferencia a traves de los tiempos de exposicion. De igual manera, la citocina anti-inflamatoria IL-10, demostro aumentar a medida que disminuye la concentracion de Mercurius-Heel[R]S.

Kubo et al.(2014), describen que el TNF[alfa] al igual que la IL1[alfa] muestran efecto positivo en procesos de cicatrizacion principalmente en estadios tempranos (inflamacion y proliferacion) mientras que en estadios tardios como la maduracion la IL10 inhibe la proliferacion celular favoreciendo el remodelamiento de la matriz extracelular (Moroguchi et al. 2004). De acuerdo a los hallazgos, se sugiere para posible regeneracion periodontal, la necesidad de incremento de citocinas como la IL1[alfa] y la IL10, ya que estas citocinas ademas de cumplir papel importante en respuesta inflamatoria, pueden regular otros procesos celulares como la proliferacion (Battergay et al. 1995).

Con respecto a los perfiles de citocinas, el unico estudio con Mercurius solubilis fue realizado por de Oliviera et al. (2011), donde se muestra que en macrofagos peritoneales de raton (celulas capaces de modular la respuesta inmune) a muy bajas concentraciones del Mercurius, la respuesta del macrofago se incrementaba con perfiles de citocinas y especies reactivas de oxigeno y nitrogeno. Esto estudio, indica la activacion en la respuesta inmune e inflamacion por aumento del oxido nitrico y la produccion IFN[alfa]. Sin embargo, luego de la eliminacion del agente causal de la inflamacion, es necesario la activacion de respuesta anti-inflamatoria como la IL4, la cual observaron que tambien se incrementaba. De esta manera, de Oliviera et al. (2011) sugieren que el Mercurius solubilis es capaz de modular la respuesta del macrofago induciendo un balance y homeostasis entre respuesta pro-inflamatoria y anti-inflamatoria, estimulados con concentraciones centesimales de Mercurius solubilis de 10 mg a 300[micron]g y encontrando que IFN[alfa] e IL4 aumenta su expresion en sobrenadantes. Sin embargo, TNF[alfa], IL-2 e IL-5 no cambian su expresion con respecto al grupo no tratado, resultados similares a los obtenidos en esta investigacion.

Finalmente, se sugiere que el Mercurius-Heel[R]S puede ser usado como adyuvante o complemento al tratamiento de enfermedad periodontal, por ser esta una patologia con alto componente infeccioso y del huesped principalmente asociado a respuesta inmunologica (Deschner & Nokhbehsaim 2013, Cekici et al. 2014), sugiriendo que este medicamento puede regular la respuesta inmune y no causa efecto letal o danino a las celulas del hospedero e incluso promueve proliferacion celular, lo que indica su potencial uso en regeneracion periodontal (Iwata et al. 2014).

Conclusion

El Mercurius-Heel[R]S mostro mayor efecto proliferativo en fibroblastos gingivales a los 15 minutos y en bajas concentraciones de tratamiento; sin embargo, no se observaron diferencias en la produccion de citocinas pro y anti-inflamatorias con respecto a las celulas sin tratamiento.

doi: 10.11144/Javeriana.SC19-3.mcpc

Agradecimientos

Agradecemos a la Vicerrectoria de investigacion de la Pontificia Universidad Javeriana por su apoyo financiero para la ejecucion de este trabajo ID 004485 y al Centro de Investigaciones odontologicas por sus instalaciones para la realizacion del presente estudio.

Conflicto de intereses

Los autores declaramos que no existe conflicto de intereses.

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Dabeiba Adriana Garcia ([correo]), Liliana Patino, Gabriela Rueda

Edited by Alberto Acosta ([correo])

Centro de Investigaciones Odontologicas. Pontificia Universidad Javeriana. Bogota-Colombia

Received: 28-03-2014 Accepted: 19-04-2014 Published on line: 27-05-2014

Funding: Vicerrectoria de investigacion de la Pontificia Universidad Javeriana.

Electronic supplementary material: N/A
Tabla 1. Viabilidad celular a los 15 minutos y 2 horas de tratamiento
con Mercurius-Heel[R]S en fibroblastos gingivales humanos.

Concentracion             15 minutos                  2 horas

Mercurius-Heel[R]S   Promedio   % viabilidad   Promedio   % viabilidad
(mg/ml)

300                   0.442          95         0.478         108
100                   0.536         115         0.455         103
33.3                  0.509         110         0.493         111
11.1                  0.572         123          0.55         124
3.7                   0.694         149         0.638         144
1.2                   0.653         140         0.619         140
0.4                   0.695         150         0.613         138
0.13                  0.724         156         0.533         120
0.04                  0.679         146         0.462         104
0.015                 0.673         145         0.637         144
0.005                  0.78         168         0.567         128
0.001                 0.712         153         0.608         137
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Title Annotation:ORIGINAL ARTICLE
Author:Adriana Garcia, Dabeiba; Patino, Liliana; Rueda, Gabriela
Publication:Revista Universitas Scientarum
Date:Sep 1, 2014
Words:4336
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