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Malondialdehyde and cardiac troponin I in Arabian horses subjected to exercise and vitamin E supplementation/Malondialdeido e troponina I cardiaca em equinos da raca Puro Sangue Arabe submetidos ao exercicio e a suplementacao com vitamina E.

INTRODUCAO

O exercicio fisico e capaz de promover estresse oxidativo induzido pelo desequilibrio entre a producao de Especies Reativas de Oxigenio (ERO) e a capacidade antioxidante das celulas e dos fluidos extracelulares, ocasionando lipoperoxidacao das membranas celulares e lesao tecidual (WILLIAMS & CARLUCCI et al., 2006). Considerando o papel potencialmente deleterio da producao excessiva de ERO e a evidencia de que o exercicio induz o estresse oxidativo em equinos, a suplementacao com antioxidantes objetiva restabelecer ou manter o equilibrio oxidante/antioxidante e parece ser uma perspectiva promissora para o bem-estar animal e desempenho atletico. Como a deficiencia de antioxidantes, o estresse oxidativo induzido e a consequente intolerancia ao exercicio fisico ja foram claramente estabelecidos, o oposto, ou seja, a suplementacao de antioxidantes para melhoria do desempenho atletico, ainda precisa ser comprovado (DE MOFFARTS et al., 2005).

McMENIMAN & HINTZ (1992), avaliando poneis submetidos a exercicio em esteira e suplementados com vitamina E, observaram uma correlacao negativa entre a vitamina E plasmatica e os indices de lipoperoxidacao, demonstrando a prevencao do estresse oxidativo ocasionado pelo exercicio fisico por esse composto. Entretanto, WILLIAMS et al. (2004) nao verificaram beneficios da suplementacao com vitamina E sobre o estresse oxidativo ocasionado pelo exercicio de enduro.

Apesar das evidencias diretas da ocorrencia de estresse oxidativo e de lipoperoxidacao, a vitamina E assume um papel determinante na protecao do coracao contra situacoes deleterias decorrentes do exercicio agudo (VENDITTI et al., 1999). O musculo cardiaco apresenta um alto metabolismo aerobico, exibindo uma elevada demanda de oxigenio em condicoes de repouso, que aumenta em grandes proporcoes durante um exercicio fisico exaustivo. Essa alta taxa de metabolismo oxidativo e geralmente associada com a producao acrescida de ERO (ATALAY & SEN, 1999). Contudo, no coracao, a capacidade antioxidante parece ser limitada, tornando-o susceptivel a lesao tecidual por estresse oxidativo apos um periodo de exercicio agudo (ASCENSAO et al., 2003).

A troponina cardiaca foi descrita como um marcador altamente especifico e sensivel para dano miocardico em muitas especies de mamiferos, e sua estrutura e muito similar entre elas (YONEZAWA et al., 2010). Apesar do mecanismo responsavel pelo aumento da troponina associado ao exercicio ainda ser desconhecido, um estudo em ratos revela evidencia histologica de lesao miocardica localizada e inflamacao no ventriculo esquerdo 24 a 48h apos serem submetidos ao exercicio intenso de natacao, e a concentracao de troponina T cardiaca foi proporcionalmente superior nos animais que executaram esforco mais acentuado. Mesmo que os autores nao souberam explicar os mecanismos envolvidos nessa lesao miocardica (CHEN et al., 2000), sabe-se que podem causar instabilidade eletrica e aumento do potencial arritmogenico do musculo cardiaco (LEROUX et al., 1995). NEUMAYR et al. (2002) sugerem que, em atletas humanos apos exercicio fisico, ha lesao na membrana celular do cardiomiocito, aumentando a concentracao de troponina I cardiaca (cTnI) na circulacao. Entretanto, essa lesao e transitoria e reversivel, provavelmente ocasionada por uma isquemia durante o exercicio e pelo aumento da permeabilidade decorrente do estresse oxidativo induzido pela sobrecarga de ERO (WHYTE et al., 2000; NEUMAYR et al., 2002), permitindo que somente a fracao citosolica de 2,8 a 8,3% da cTnI total presente no tecido cardiaco seja liberada. Entretanto, a significancia desse compartimento citosolico e desconhecida para a especie equina (HOLBROOK et al., 2006).

O presente estudo objetivou avaliar o efeito do exercicio fisico, do treinamento e da suplementacao com vitamina E em equinos da raca Puro Sangue Arabe sobre o estresse oxidativo, avaliado por meio da mensuracao do malondialdeido e vitamina E sericos, e sobre a lesao cardiaca, determinada pela troponina I cardiaca serica.

MATERIAL E METODOS

Foram utilizados 16 equinos adultos, da raca Puro Sangue Arabe, sendo tres machos castrados e 13 femeas, com idade variando de 4,5 a 12 anos, peso medio de 362,3 [+ or -] 25,6kg, sem treinamento fisico previo, clinicamente sadios e selecionados mediante exames fisico e complementares. Esses foram alojados em piquetes sob as mesmas condicoes de manejo alimentar e sanitario. A alimentacao consistiu de feno de capim coast-cross, racao comercial, suplemento mineral e agua ad libitum. Os equinos foram distribuidos em dois grupos de oito animais: Controle (GC) e Suplementado com Vitamina E (dl-alfa-tocoferol) (GE). A suplementacao com vitamina E via oral, por meio de capsula gelatinosa (E-Tabs[R], Sigma Pharma, Hortolandia, SP, Brasil) misturada a melaco de cana, no grupo GE, teve inicio 15 dias antes da primeira prova de exercicio (P1), na dose de 1.000 UI animal-1, diariamente, sem interrupcao ate o final do experimento.

Foram realizadas duas provas de exercicio progressivo, denominadas de P1 (antes do treinamento) e P2 (apos o treinamento), as quais foram realizadas em esteira de alta velocidade (Mustang 2200 AG--Kagra, Suica) inclinada a +7%. O exercicio iniciou-se a 5min no passo a 1,8m [s.sup.-1], seguido de 3min no trote a 4,0m [s.sup.-1], 2min no canter a 6,0m [s.sup.-1] e em seguida 1min no galope a 8,0m [s.sup.-1], 9,0m s'1, 10,0m s'1, 11,0m s'1 ou ate quando o animal pudesse manter-se em exercicio, mesmo sendo estimulado, dependendo da capacidade individual (MACHADO et al., 2007). Os animais foram treinados, entre P1 e P2, uma vez ao dia, seis vezes por semana, ate completarem 20 dias. O protocolo de treinamento adotado foi de 5min a 1,8m [s.sup.-1] (passo), 3min a 4,0m [s.sup.-1] (trote), 2min a 6,2m [s.sup.-1] (canter), 1min a 8,0m [s.sup.-1] e a 10,0m [s.sup.-1] (galope), seguidos de um periodo de desaquecimento a 3,0m [s.sup.-1] (trote) por 2min e a 1,6m [s.sup.-1] (passo) por 2min (MACHADO et al., 2007). Apos o ultimo dia de treinamento, os animais nao foram submetidos a atividade fisica por 48h antes de realizarem a segunda prova de exercicio (P2).

Antes e apos as provas, foi realizado o eletrocardiograma de repouso em oito animais, de acordo com a tecnica descrita por FREGIN (1982), durante um minuto. Amostras de sangue foram coletadas para obtencao de soro antes do inicio do exercicio (M0), imediatamente apos, e 15min, 30min, 2h, 6h, 12h e 24h apos o exercicio em ambas as provas, e armazenadas a -80[degrees]C ate as analises. As amostras destinadas a determinacao de vitamina E foram protegidas da luz. As concentracoes sericas de MDA e vitamina E foram mensuradas por meio da cromatografia liquida de alta eficiencia (HPLC), em fluoroscopia, de acordo com KARATAS et al. (2002) e ARNAUD et al. (1991), respectivamente. A concentracao de cTnI foi determinada pela tecnica "ELFA" (Ensaio fluorescente ligado a enzima) utilizando kit comercial (Vidas[R] Troponin I Ultra--bioMerieux Clinical Diagnostics, Franca).

De acordo com a distribuicao dos dados, analisados pelo Teste de Kolgomorov e Smirnov, as variaveis foram avaliadas segundo metodos estatisticos parametricos ou nao-parametricos. Na ocorrencia do primeiro caso, os dados foram inicialmente avaliados por meio de teste F de analise de variancia e, quando significativo, as medias foram confrontadas pelo teste de multipla amplitude de Tukey. Todas as analises foram consideradas significativas quando P<0,05.

RESULTADOS E DISCUSSAO

Estudos relacionados a suplementacao com antioxidantes e o estresse oxidativo no exercicio fisico sao cada vez mais frequentes em virtude do maior interesse no bem-estar animal, desempenho atletico e conhecimento da fisiologia do exercicio. Entretanto, os beneficios reais da utilizacao desses compostos e sua dose otima recomendada ainda nao foram totalmente elucidados, uma vez que ha uma ampla variacao dos resultados encontrados na literatura (AVELLINI et al., 1999; KIRSCHVINK et al., 2006; WILLIAMS & CARLUCCI et al., 2006; WILLIAMS, 2008).

Avaliando o efeito do exercicio progressivo, observou-se que o MDA apresenta um discreto aumento imediatamente apos o exercicio, exceto para o GC-P2, o qual foi acentuado em 15min, com pico maximo em 30min, exceto para GC-P1, que apresentou valor maximo em 15min. Porem, essa elevacao foi significativa apenas em 15 e 30min do GE na P2 (P<0,006). Os valores basais retornaram em 2h apos o exercicio, com excecao do GE-P2, que retornou em 6h. A analise do efeito da suplementacao entre GC e GE nao revelou diferenca estatistica entre os grupos avaliados, porem observouse que os valores de MDA do GC foram superiores ao do GE em todos os momentos, exceto nos momentos em P2 de 15 e 30min apos o exercicio (Tabela 1).

AVELLINI et al. (1999) demonstraram que a suplementacao com vitamina E, associada a um periodo de treinamento de 70 dias, foi suficiente para aumentar os sistemas detoxificadores e reduzir as ERO, demonstrados pela diminuicao dos niveis plasmaticos de MDA. Embora nao tenha havido diferenca significativa, no presente estudo, os animais do grupo suplementado com vitamina E apresentaram menores concentracoes sericas de MDA, no repouso, imediatamente apos e a partir de 2h apos o exercicio, sugerindo que a suplementacao foi benefica. Contudo, a suplementacao nao preveniu o estresse oxidativo provocado pelo exercicio, demonstrado pelo aumento de MDA em 15 e 30min, em ambos os grupos e provas, que foi significativo apenas no GE, na P2 (P<0,006), mas foi capaz de impedir a propagacao desse estresse, evidenciado pelo rapido retorno de MDA aos niveis basais em 2h. A maior producao de MDA no GE pode ser decorrente do efeito pro-oxidante da vitamina E. Uma das funcoes da vitamina E e transformar uma ERO potencialmente nociva em compostos menos reativos. Nesse tipo de reacao, a vitamina E e oxidada, podendo ser novamente reduzida para vitamina E ativa e originar mais ERO. Esses oxidantes atravessam livremente as membranas lipidicas e, apesar de menos deleterio que as demais ERO, em grande concentracao, pode ultrapassar a capacidade de depuracao, promovendo maior lesao (SETIADI et al., 2003; YEUM et al., 2004). WILLIAMS et al. (2004) e WILLIAMS & CARLUCCI (2006) nao encontraram diferencas significativas em indices de lipoperoxidacao entre equinos suplementados com altas doses de vitamina E e animais controle submetidos a exercicios de enduro e progressivo em esteira, respectivamente.

Ao confrontar as provas de exercicio progressivo, nao houve diferenca do MDA entre P1 e P2, com resultados semelhantes antes e apos o treinamento em ambos os grupos, indicando que esse protocolo nao foi capaz de amenizar a lipoperoxidacao ocasionada pelo exercicio. WILLIAMS et al. (2008) tambem nao observaram alteracoes significativas em indice de lipoperoxidacao com um protocolo de treinamento por oito semanas.

A concentracao serica da vitamina E sempre se manteve mais elevada no GE em relacao ao GC, embora nao tenha apresentado diferenca estatistica entre momentos, grupos e provas (Tabela 2). MCMENIMAN e HINTZ (1992) tambem verificaram concentracoes significativamente maiores em poneis suplementados e DE MOFFARTS et al. (2005) em equinos Puro Sangue Ingles com relacao ao grupo controle. WILLIAMS & CARLUCCI et al. (2006) observaram niveis superiores em cavalos de trote suplementados, mas estes apresentaram significancia apos 24h do exercicio em esteira, quando comparados aos animais controle. Esses autores tambem relatam que a vitamina E plasmatica aumentou com o exercicio e retornou ao nivel basal apos 1h do termino do teste em esteira. McMENIMAN & HINTZ (1992) e DEATON et al. (2002) nao encontraram diferenca na concentracao plasmatica de vitamina E em equinos suplementados e submetidos a exercicio. No presente estudo, tambem nao foram observadas grandes alteracoes nos niveis de vitamina E em consequencia do exercicio ou treinamento. A diminuicao da vitamina E em 15min coincide com o aumento da concentracao de MDA, sugerindo o consumo desse antioxidante para evitar a propagacao do estresse oxidativo.

Acredita-se que o estresse oxidativo ocasionado pelo exercicio fisico promove a lipoperoxidacao e lesao de membrana dos cardiomiocitos em razao do aumento de ERO, favorecendo a liberacao de cTnI do compartimento citosolico e seu aumento na circulacao (WHYTE et al., 2000; NEUMAYR et al., 2002). No entanto, neste estudo, nao foi possivel correlacionar as concentracoes sericas do indicador de lipoperoxidacao, o MDA, com as de cTnI. Muitos trabalhos descrevem que a cTnI do miocardio equino apresenta alta reacao cruzada com os kits de imunoensaios humanos de cTnI, podendo ser utilizada como biomarcador de lesao de cardiomiocitos (YONEZAWA et al., 2010). A concentracao serica de cTnI, na maioria dos animais e momentos, permaneceu abaixo do limite de deteccao do kit de <0,01 [micro]g [L.sup.-1]. Entretanto, tres animais do GE em P2 apresentaram niveis de cTnI superiores a esse valor de limite de deteccao, provavelmente em razao do efeito pro-oxidante da vitamina E, conforme descrito anteriormente. Observou-se aumento de cTnI no momento 6h apos o exercicio (animais 11, 15 e 16, respectivamente: 0,03; 0,18 e 0,05 [micro]g [L.sup.-1]), retornando aos niveis basais (<0,01 [micro]g [L.sup.-1]) nos animais 11 e 16 em 12h. No animal 15, a concentracao permaneceu aumentada (0,06gg L-1) em 12h, mas retornou ao valor de repouso em 24h. Dos equinos que se observou aumento de cTnI, os animais 15 e 16 apresentaram, respectivamente, tres e quatro contracoes ventriculares prematuras (VPC) monomorficas e isoladas imediatamente apos o exercicio da P2. A cinetica da cTnI serica observada nesses animais foi semelhantemente encontrada por DURANDO et al. (2006), que relataram uma elevacao discreta das concentracoes de cTnI em 3 a 6h, retornando aos niveis pre-exercicio em 24 horas apos exercicio de alta intensidade e curta duracao em esteira, em equinos de corrida de diversas racas.

Nao foram utilizados animais que apresentaram alteracoes eletrocardiograficas de repouso que pudessem interferir no desempenho. Mesmo assim, pode-se constatar a ocorrencia de VPC isolados em tres animais apos o exercicio, ocorrendo somente durante a recuperacao do exercicio, entre o final do exercicio e 30min apos o exercicio. SENTA et al. (1970) acreditam que os VPC desse tipo, apos atividade fisica, sao funcionais e induzidos pelo reajuste do tonus nervoso autonomico e, portanto, benignos. Entretanto, em dois animais, foi possivel a deteccao do aumento de cTnI serica, sugerindo a ocorrencia de uma lesao miocardica. Porem, pode-se considerar como uma lesao leve, uma vez que MICHIMA (2007) considera o limite normal de cTnI 0,3g [L.sup.-1], nao indicando uma lesao cardiaca expressiva.

Segundo HOLBROOK et al. (2006), em equinos, nao esta definido um limite de concentracao de cTnI que considere a gravidade da lesao cardiaca nem se os mecanismos ou doencas podem causar leve, moderada ou severa elevacao desses niveis. Embora existam poucos relatos sobre a concentracao de cTnI em equinos saudaveis, esses valores normais sao variaveis. Essas diferencas sao atribuidas aos diversos sistemas analisadores, que utilizam aminoacidos distintos para composicao dos anticorpos monoclonais (DURANDO et al., 2006). Para MICHIMA (2007), a tentativa de extrapolar os resultados com aqueles apresentados na literatura, em equinos, e dificultada, uma vez que ha divergencia de metodologias e tipos de amostragem.

CONCLUSAO

Os resultados do presente estudo permitem concluir que o exercicio progressivo em esteira de alta velocidade promove estresse oxidativo, mas nao e prevenido pela suplementacao com 1.000UI de vitamina E nem por treinamento de 20 dias, alem de nao ocasionar lesao miocardica expressiva. Entretanto, novas pesquisas devem ser realizadas a fim de esclarecer qual e a implicacao desse estresse oxidativo sobre a saude do animal e a cinetica de liberacao da troponina I cardiaca em decorrencia do exercicio. Alem disso, essas pesquisas podem identificar os reais beneficios que a suplementacao com vitamina E e o treinamento fisico podem proporcionar ao animal.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP), pelo subsidio financeiro.

COMITE DE ETICA E BIOSSEGURANCA

Projeto aprovado pela Camara de Etica em Experimentacao Animal (protocolo no. 116/2005-CEEA) da Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia, da Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu.

REFERENCIAS

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Leticia Andreza Yonezawa (I) Luciana Pereira Machado (II) Veridiana Fernandes da Silveira (III) Marcos Jun Watanabe (IV) Mere Erika Saito (V) Sandra Satiko Kitamura (VI) Aguemi Kohayagawa (VII)

(I) Programa de Pos-graduacao Medicina Veterinaria, Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia (FMVZ), Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus de Botucatu, Distrito de Rubiao Junior, s/n, 18618-000, Botucatu, SP, Brasil. E-mail: leticiay@gmail.com. Autor para correspondencia.

(II) Universidade Federal do Piaui (UFPI), Campus Bom Jesus, PI, Brasil.

(III) Universidade Federal do Reconcavo da Bahia (UFRB), Cruz das Almas, BA, Brasil.

(IV) Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinaria, FMVZ, Unesp, Botucatu, SP, Brasil.

(V) Departamento de Medicina Veterinaria, Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC), Lages, SC, Brasil.

(VI) Universidade Anhembi-Morumbi, Sao Paulo, SP, Brasil.

(VII) Departamento de Clinica Veterinaria, FMVZ, Unesp, Botucatu, SP, Brasil.

Recebido para publicacao 03.01.10 Aprovado em 15.05.10 Devolvido pelo autor 06.09.10 CR-2968
Tabela 1--Medias ([+ or -] desvios-padrao) da concentracao serica de
malondialdeido (MDA) (nmol/mL) de equinos da raca Puro Sangue Arabe
nas provas P1 (antes do treinamento) e P2 (apos o treinamento) de
exercicio progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e
suplementado com vitamina E (GE), antes (M0), imediatamente apos (PE)
e 15min, 30min, 2h, 6h, 12h e 24h apos o exercicio.

Momentos

                    MO                       PE

GC   P1     1,07 [+ or -] 0,67       1,15 [+ or -] 0,94
     P2     1,12 [+ or -] 0,96       1,11 [+ or -] 0,96

GE   P1     0,66 [+ or -] 0,51       0,68 [+ or -] 0,31
     P2   0,54 [+ or -] 0,31 (b)   0,65 [+ or -] 0,34 (b)

Signif            P>0,1                    P>0,2

                  15min                    30min

GC   P1     1,22 [+ or -] 0,88       1,18 [+ or -] 0,88
     P2     1,15 [+ or -] 0,94       1,25 [+ or -] 0,99

GE   P1     0,73 [+ or -] 0,38       1,16 [+ or -] 0,65
     P2   1,21 [+ or -] 0,67 (a)   1,35 [+ or -] 0,85 (a)

Signif            P>0,1                    P>0,6

                    2h                       6h

GC   P1     0,97 [+ or -] 0,88       0,90 [+ or -] 0,85
     P2     1,13 [+ or -] 0,91       0,98 [+ or -] 0,89

GE   P1     0,62 [+ or -] 0,30       0,54 [+ or -] 0,30
     P2   0,70 [+ or -] 0,42 (b)   0,56 [+ or -] 0,48 (b)

Signif            P>0,3                    P>0,3

                   12h                      24h             Signif

GC   P1     1,07 [+ or -] 0,85       0,90 [+ or -] 0,79     P>0,99
     P2     1,28 [+ or -] 1,10       0,89 [+ or -] 0,70     P>0,99

GE   P1     0,59 [+ or -] 0,30       0,57 [+ or -] 0,35     P>0,08
     P2   0,48 [+ or -] 0,34 (b)   0,50 [+ or -] 0,32 (b)   P<0,006

Signif            P>0,09                   P>0,09

Letras minusculas distintas na mesma linha indicam diferenca
estatistica entre momentos dentro do mesmo grupo. Signif: nivel de
significancia.

Tabela 2--Medias ([+ or -] desvios/padrao) da concentracao serica de
vitamina E (pmol/mL) de equinos da raca Puro Sangue Arabe nas provas
P1 (antes do treinamento) e P2 (apos o treinamento) de exercicio
progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com
vitamina E (GE), antes (M0), imediatamente apos (PE) e 15min, 30min,
2h, 6h, 12h e 24h apos o exercicio.

Momentos

                  MO                   PE

GC   P1   2,95 [+ or -] 0,98   3,10 [+ or -] 0,99
     P2   2,93 [+ or -] 0,75   3,12 [+ or -] 1,18

GE   P1   3,47 [+ or -] 0,89   3,68 [+ or -] 0,99
     P2   3,18 [+ or -] 0,98   3,67 [+ or -] 1,24

Signif          P>0,3                P>0,2

                15min                30min

GC   P1   2,78 [+ or -] 0,79   2,90 [+ or -] 0,79
     P2   2,96 [+ or -] 0,96   3,00 [+ or -] 1,73

GE   P1   3,25 [+ or -] 0,72   3,17 [+ or -] 0,77
     P2   3,21 [+ or -] 0,96   3,01 [+ or -] 0,84

Signif          P>0,2                P>0,5

                  2h                   6h

GC   P1   2,74 [+ or -] 0,76   2,76 [+ or -] 0,75
     P2   2,82 [+ or -] 0,77   2,81 [+ or -] 0,93

GE   P1   2,84 [+ or -] 0,76   2,84 [+ or -] 0,56
     P2   3,01 [+ or -] 0,87   3,12 [+ or -] 0,91

Signif          P>0,6                P>0,5

                 12h                  24h           Signif

GC   P1   3,07 [+ or -] 0,95   2,77 [+ or -] 0,91   P>0,9
     P2   3,04 [+ or -] 1,21   2,81 [+ or -] 1,02   P>1,0

GE   P1   3,46 [+ or -] 1,15   3,14 [+ or -] 0,73   P>0,4
     P2   3,33 [+ or -] 1,09   3,25 [+ or -] 1,09   P>0,9

Signif          P>0,5                P>0,4

Signif: nivel de significancia.
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Author:Yonezawa, Leticia Andreza; Machado, Luciana Pereira; da Silveira, Veridiana Fernandes; Watanabe, Mar
Publication:Ciencia Rural
Date:Jun 1, 2010
Words:4225
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