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Maduracion in vitro de ovocitos de gatas tratadas con hormona foliculo estimulante (FSH).

In Vitro Maturation of Cat Oocytes Obtained From Females Treated with Follicle Stimulating Hormone

RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del tratamiento con hormona foliculo estimulante (FSH) sobre la calidad y potencial de maduracion in vitro (MIV) de ovocitos de gata. Veintiun gatas adultas fueron asignadas aleatoriamente a grupos de estudio. Grupo FSH (n = 9) 5 mg NIH/dia de Foltropin-V por 4 dias via subcutanea y Grupo Control (n = 12) 1 mL de suero fisiologico por 4 dias via subcutanea. Los ovarios fueron obtenidos quirurgicamente y transportados al laboratorio dentro de las 4 horas subsiguientes a 37[grados]C. Los complejos cumulus-ovocito (CCOs) fueron obtenidos por rebanado ovarico, seleccionandose por criterios morfologicos aquellos considerados aptos para MIV. Se utilizo como medio de maduracion TCM-199, BSA (0,4%), FSH (1 [micron]L/mL), LH (1 [micron]L/mL), 17[beta] estradiol (1 [micron]g/mL), gentamicina (50 [micron]g/mL) y piruvato (0,2 mM). El cultivo se realizo durante 24 horas a 38,5[grados]C con 5% de C[O.sub.2]. Posteriormente los ovocitos fueron denudados, fijados y tenidos para evaluar la maduracion, considerandose maduros aquellos en metafase II. Se recuperaron en promedio por hembra 10,6 [+ o -] 3,6 y 7,1 [+ o -] 2,8 CCOs aptos para MIV en los grupos FSH y Control respectivamente (P [menor que o igual a] 0,05). Se recupero un 25,6% de CCOs aptos para MIV en el grupo FSH y 17% en el grupo Control (P [menor que o igual a] 0,05). La tasa de MIV para el grupo FSH fue de un 73,6% versus 49,4% en el grupo Control (P [menor que o igual a] 0,05). Se concluye que el tratamiento con FSH aumenta el numero de CCOs aptos para MIV y que estos presentarian un mayor potencial de maduracion.

Palabras clave: Ovocito, maduracion in vitro, gata, gonadotrofina, FSH.

ABSTRACT

The aim of this research was to evaluate the effect of Follicle Stimulating Hormone (FSH) treatment on quality and in vitro maturation potential of cumulus-oocyte complexes (COCs) recovered from domestic cats. Twenty-one matura cats were randomly assigned to two groups, FSH (n=9) and Control (n=12). Cats in FSH group were treated with 5 mg of Folltropin-V subcutaneously every 24 hours, for 4 consecutive days. Cats in Control group received 1 mL of sterile saline solution every 24 hours for 4 days. Ovaries were obtained surgically 24 hours after the end of the gonadotrophic treatment. Ovaries were then transported to the laboratory at 37[degrees]C within 4 hours after surgery. COCs were recovered by slicing, and classified according to morphological features. Maturation medium was based on TCM-199, and supplemented with 0.4% BSA, 1 [micro]L/mL FSH, 1 [micro]L/mL LH y 1 [micro]g/mL of 17[beta] oestradiol, 50 [micro]g/mL gentamicin, 0.20 mM sodium pyruvate. The maturation period was of 24 hours under 38.5[degrees]C, 5% C[O.sub.2] and saturated humidity. After this period oocytes were denuded, fixed and stained to asses their maturational status. Oocytes were considered mature when it was observed the presence of metaphase II plate and the expulsion of the first polar body. Ah average of 10.6 [+ or -] 3.6 and 7.1 [+ or -] 2.8 excellent and good quality COCs were recovered from cats in FSH and Control group respectively (P [less than or equal to] 0.05). Twenty five point six percent (25.6%) and 17% of recovered COCs from FSH and Control group respectively were classified as excellent or good (P [less than or equal to] 0.05). In vitro maturation rate was of 73.6% and 49.4% for the FSH group and the control group respectively (P [less than or equal to] 0.05). It can be concluded that FSH treatment increases the number of excellent and good quality oocytes obtained from cats and that these oocytes present a higher in vitro maturation potencial.

Key words: Oocyte, in vitro maturation, cats, gonadotrophin, FSH.

INTRODUCCION

Los estudios relacionados con las biotecnologias reproductivas en camivoros domesticos aun son limitados al comparados con los de otras especies domesticas. Sin embargo en anos recientes se ha podido observar un incremento de la investigacion en esta area. Al respecto es importante considerar que ademas de mascotas, los felinos domesticos tambien sirven de modelo comparativo para el estudio de felinos silvestres [2]. En estas ultimas especies las biotecnologias reproductivas como inseminacion artificial, fecundacion y produccion de embriones in vitro y transferencia de embriones, asi como la criopreservacion de gametos y embriones, resultan fundamentales, tanto para cooperar en la preservacion de la biodiversidad, asi como tambien para el desarrollo de investigacion basica [10].

En felinos, al igual que en el resto de las especies domesticas, la maduracion de ovocitos in vitro (MIV) ha constituido un paso fundamental para el avance de biotecnologias tales como la fecundacion y produccion de embriones in vitro [3], inyeccion intracitoplasmatica de espermatozoides [1] y transferencia nuclear [6]. No obstante los promisorios avances alcanzados en la MIV de ovocitos de gata, los resultados descritos en general son inferiores a los obtenidos en MIV de ovocitos de especies de granja [2], constituyendo un desafio el poder mejorar las condiciones que permitan elevar las tasas de MIV.

Dado que en la mayoria de los estudios sobre FIV en gatas, los ovocitos han sido obtenidos de ovarios no estimulados hormonalmente o bien madurados in vivo, existe escasa informacion sobre los resultados de MIV en ovocitos provenientes de hembras previamente tratadas con gonadotrofinas. Se ha demostrado que la estimulacion ovarica de gatas mediante la administracion de hormona foliculo estimulante (FSH) produce un aumento del numero de foliculos de tamano preovulatorio ([mayor que o igual a] 2 mm) [11, 14]; y consecuentemente del numero de complejos cumulus-ovocito (CCOs) de buena calidad (categorias I y II) potencialmente aptos para MIV [14]; esto resulta particularmente importante al considerar que en gatas no estimuladas con gonadotrofinas menos del 15% de todos los ovocitos intraovaricos recuperados pueden ser clasificados como excelentes (categoria I); lo que se deberia a que estos al momento de ser recuperados pueden presentar diferentes grados de alteraciones relacionadas con la atresia folicular. Por ello, ademas, variaria su funcionalidad in vitro, esto en terminos de la habilidad para alcanzar la madurez nuclear, ser fecundados y desarrollarse posteriormente [19].

El presente trabajo propone que ovocitos obtenidos de gatas tratadas con hormona foliculo estimulante presentarian un mayor potencial de maduracion in vitro respecto de hembras no estimuladas. Planteandose como objetivos evaluar la tasa de recuperacion y calidad de los CCOs en gatas estimuladas con FSH; asi como la tasa de maduracion in vitro de ovocitos de gatas estimuladas con FSH respecto de animales sin estimulacion gonadotrofica.

MATERIALES Y METODOS

Para el desarrollo del estudio se emplearon 21 gatas domesticas adultas no gestantes y sin informacion de la fase del ciclo, con pesos que fluctuaron entre 2 y 3,5 kg, las cuales fueron asignadas aleatoriamente a uno de los siguientes grupos:

a) Grupo FSH (n = 9), administracion cada 24 horas de 5 mg NIH de FSH (Folltropin-V, Vetrepharm; Canada), via subcutanea por 4 dias consecutivos.

b) Grupo Control (n = 12), administracion cada 24 horas de 1 mL de suero fisiologico (NaCl 0,9%), via subcutanea por 4 dias consecutivos.

Veinticuatro horas despues del termino del tratamiento se realizo la ovado-histerectomia (OH). Las gatas fueron anestesiadas utilizando una asociacion de ketamina 20 mg/kg (Ketostop[R], Drag-Pharma; Chile) y xilacina 2 mg/kg (Ronpum[R] Bayer; Alemania). Inmediatamente despues de la cirugia los ovados fueron recuperados y depositados en tubos con solucion fisiologica y antibioticos (penicilina sodica: 0,08 g/L y estreptomicina: 0,1 g/L) a aproximadamente 37[grados]C, y dentro de 4 horas post-cirugia fueron transportados al laboratorio. Con el proposito de liberar los CCOs los ovarios fueron lavados y posteriormente rebanados mediante finos cortes con bisturi (slicing) en una placa con PBS conteniendo 0,3% de albumina de suero bovino (BSA). El medio decantado, proveniente del rebanamiento de los ovarios, fue observado bajo lupa estereoscopica para la recuperacion y evaluacion de los CCOs. El criterio de clasificacion de los CCOs se fundamento en aspectos morfologicos de las celulas del cumulus oophorus y la corona radiada, asi como en la homogeneidad del citoplasma del ovocito segun criterios previamente definidos para esta especie [19]. En resumen:

* Categoria I: citoplasma oscuro uniforme, nucleo redondo, con 5 o mas capas compactas de celulas de la granulosa;

* Categoria II: citoplasma oscuro uniforme conjuntamente con una corona radiada completa pero rodeado por menos de 5 capas de celulas de la granulosa;

* Categoria III: perdida de la uniformidad del citoplasma, la corona radiada se presenta incompleta y las capas de celulas de la granulosa son menos compactas;

* Categoria IV: citoplasma no homogeneo o francamente fragmentado y las celulas de la corona y de la granulosa se encuentran disgregadas o ausentes en su totalidad.

De acuerdo a esta clasificacion los ovocitos han sido clasificados como aptos (categorias I y II) y no aptos (categorias III y IV) para la MIV. En base a este criterio se seleccionaron los CCOs aptos para MIV, siendo transferidos a una placa de cultivo conteniendo el siguiente medio de maduracion: TCM 199; 0,4% BSA; gentamicina 50 [micron]g/mL; piruvato 0,2 mM; 17-[beta]estradiol 1 [micron]g/mL (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA); LH 1 [micron]L/mL (Lutropin-V, BIONICHE, Canada); FSH 1 [micron]L/mL (Folltropin-V, Bioniche, Canada) (TABLA I).

Posteriormente los ovocitos seleccionados, de ambos grupos de tratamiento, fueron depositados en grupos de aproximadamente 5 en gotas de maduracion de 25 [micron]L cubiertas con aceite mineral y cultivados por un periodo de 24 horas a 38,5[grados]C en ambiente saturado de humedad con 5% de C[O.sub.2]. Completado el periodo de maduracion, los ovocitos fueron extraidos de las gotas de cultivo para la remocion mecanica de las celulas del cumulus oophorus y fijacion por 24 h en acido acetico-etanol (1:3), luego fueron tenidos con aceto-orceina (1% de orceina en acido acetico 45%) por 30 minutos y a continuacion se procedio a aclarar los ovocitos mediante solucion decolorante. Los ovocitos tenidos fueron examinados bajo microscopio de contraste de fase y el criterio para evaluar la maduracion ovocitaria fue la presencia de la placa II metafisica y el primer corpusculo polar. Los ovocitos que no presentaron las caracteristicas anteriores se consideraron como inmaduros y aquellos ovocitos fragmentados o de forma irregular se consideraron como degenerados.

Para el analisis estadistico de los datos de recuperacion y clasificacion de CCOs asi como de la tasa de MIV se empleo la prueba de Ji-cuadrado considerando como significativo un valor de P [menor que o igual a] 0,05.

RESULTADOS Y DISCUSION

Recuperacion de complejos cumulo-ovocito (CCOs)

Un total de 874 CCOs fueron obtenidos a partir de 44 ovarios, de estos 181 fueron clasificados como aptos para MIV (20,7%). No se observo diferencias en el promedio de CCOs totales recuperados por gata en los grupos FSH y Control, alcanzandose valores de 41,6 [+ o -] 6,2 y 41,6 [+ o -] 9,9 respectivamente. Cabe destacar que en felinos, al igual que en otras especies [4, 9], la calidad de los CCOs tiene una implicacion directa sobre el potencial de maduracion de los ovocitos, siendo por tanto sugerido el clasificar y seleccionar los CCOs destinados a MIV, utilizando preferentemente aquellos que presentan el ovoplasma homogeneo y varias capas compactas de celulas de la granulosa [8, 13, 19]. En relacion con la recuperacion de CCOs aptos para MIV se obtuvo un promedio por gata de 10,6 [+ o -] 3,6 y 7,1 [+ o -] 2,8 en los grupos FSH y control respectivamente, denotando un efecto positivo de la estimulacion gonadotrofica (P < 0,05).

Ademas de incrementar la tasa de recuperacion de CCOs aptos para MIV, el tratamiento con FSH permitio obtener un aumento significativo en la cantidad de CCOs de la categoria I respecto del grupo Control (P [menor que o igual a] 0,05) (TABLA II). Ambos efectos podrian ser atribuidos a un mayor desarrollo de foliculos preovulatorios en los ovarios de las gatas tratadas, estructuras en las que se ha descrito mayor presencia de CCOs aptos para MIV y particularmente mayores proporciones de CCOs de categoria I respecto de foliculos < 2,0 mm [14, 19]. Estos resultados adquieren particular relevancia si se considera que ovocitos de categoria I presentarian una alta probabilidad de desarrollo posterior a la MIV/FIV y alcanzar estados de morula y blastocisto en proporciones similares a las observadas en oviducto y cuernos uterinos de gatas 5 a 6 dias despues de la monta natural [16].

El promedio de CCOs aptos para MIV recuperados a partir de ovarios de gatas tratadas con FSH, resulto levemente supedor al descrito en un trabajo anterior (9,0 [+ o -] 3,0) donde se utilizo el mismo protocolo para la estimulacion ovarica [14], esta diferencia podria ser atribuida al metodo de coleccion de los CCOs, ya que en dicho estudio los ovocitos fueron obteni- dos por aspiracion folicular, metodo reconocidamente menos eficiente que el rebanamiento ovarico (slicing) usado en el presente trabajo.

Maduracion in vitro de ovocitos

De un total de 181 ovocitos seleccionados para MIV un 5,0% se perdio durante los procedimientos de lavado, eliminacion de celulas del cumulus y fijacion. La tasa de maduracion total fue de 62,2% (107/172), valor similar al descrito en varios estudios en felinos domesticos [5, 19, 20].

En el grupo de gatas estimuladas con FSH se evaluaron un total de 91 ovocitos de los cuales el 73,6% alcanzaron el estado de metafase II. Este valor resulto significativamente superior (P [menor que o igual a] 0,05) al obtenido en el grupo Control donde, de 81 ovocitos evaluados solo el 49,4% alcanzo igual estado. En la TABLA III se pueden observar las tasas de MIV de ovocitos provenientes de gatas tratadas con FSH y grupo Control.

Estos resultados sugieren que el estimulo gonadotrofico con FSH permitiria obtener ovocitos con una mayor capacidad de reiniciar la meiosis, lo cual incidiria en las mejores tasas de MIV en comparacion al grupo Control del presente estudio. Dado que no se ha descrito un efecto directo de la FSH sobre la competencia meiotica de los ovocitos felinos, es posible postular que al igual que en otras especies [7, 15, 17, 18], en la gata domestica existiria una relacion positiva entre el mayor tamano folicular alcanzado en hembras tratadas con FSH y la competencia meiotica de los ovocitos.

Si bien se han descrito mayores tasas de MIV en ovocitos provenientes de CCOs categoria I respecto de CCOs catagoria II, argumentandose que los ovocitos derivados de CCOs categoria I tendrian una mayor capacidad de reiniciar la meiosis [19], en el presente estudio no se observaron diferencias estadisticas en las tasa de MIV al comparar ambas categorias de CCOs, tanto en el grupo tratado con FSH como en el grupo Control. Sin embargo, se podria postular una posible relacion entre tratamiento con FSH y categoria de los CCOs al encontrarse que la mayor tasa de MIV fue registrada en ovocitos de CCOs categoria I en gatas tratadas con FSH (85,7%) y la menor en ovocitos de CCOs categoria II en gatas del grupo Control (48,5%).

Cabe destacar que la tasa de MIV superior al 70% obtenida en ovocitos provenientes de gatas tratadas con FSH resulta alentadora si se considera que el medio de maduracion empleado es simple o de baja complejidad respecto de los usados en estudios con tasas de MIV similares, donde se describe la suplementacion del medio de cultivo con BSA [12], BSA + cistamina [1] o suero fetal bovino + factor de crecimiento IGF-I [6].

CONCLUSIONES

En gatas domesticas, la administracion de 5 mg NIH/dia de FSH, via subcutanea, durante 4 dias, permite aumentar significativamente el numero de CCOs aptos para maduracion in vitro, donde ademas los ovocitos obtenidos muestran un mayor potencial de maduracion in vitro respecto de animales sin tratamiento.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Alfonso Sanchez Riquelme (1), Leonardo Lopez Zamorano (2), Mauricio Silva Jimenez (2) y Marco Berland Olea (2)

(1) Escuela de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Vina del Mar. Av. Agua Santa # 7255, Rodelillo, Vina del Mar, Chile.

(2) Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Catolica de Temuco. Av. Manuel Montt # 56, Temuco, Chile. E-mail: asanchez@uvm.cl
TABLA I
MEDIO DE MADURACION / MATURATION MEDIUM

Componente            Concentracion

TCM 199               --
BSA                   0.04
FSH                   1 [micro]L/mL
LH                    1 [micro]L/mL
Gentamicina           50 [micro]g/mL
Piruvato              0,2 mM
17-[beta] Estradiol   1 [micro]g/mL

TABLA II
RECUPERACION Y CLASIFICACION DE COMPLEJOS CUMULUS-OVOCITO APTOS PARA
MADURACION IN VITRO OBTENIDOS DE GATAS TRATADAS CON HORMONA FOLICULO
ESTIMULANTE (FSH) / RECOVERY RATE AND NUMBER OF EXCELLENT AND GOOD
QUALITY OOCYTES CUMULUS COMPLEXES RECOVERED FROM CATS TREATED WITH
FOLLICLE STIMULATING HORMONE (FSH)

                             CCOs aptos para MIV

Grupo     CCOs recuperados    Total       Categoria I   Categoria II

FSH       375                 25,6% (a)    30,2% (a)     69,8% (a)
(n=9)                        (96/375)     (29/96)       (67/96)
Control   499                 17,0% (b)    17,6% (b)     82,4% (b)
(n=12)                       (85/499)     (15/85)       (70/85)

(a,b): letras diferentes en la misma columna indican diferencia
significativa (P [less than  or equal to] 0,05).

TABLA III
TASA DE MADURACION IN VITRO DE OVOCITOS OBTENIDOS DE GATAS TRATADAS
CON HORMONA FOLICULO ESTIMULANTE / FSH IN VITRO MATURATION RATE OF
OOCYTES OBTAINED FROM CATS TREATED WITH FOLLICLE STIMULATING HORMONE

                              (FSH)

           Ovocitos       Ovocitos      Ovocitos    Ovocitos
          cultivados   perdidos en la    maduros    inmaduros y
Grupo        (n)        tincion (%)        (%)      degenerados (%)

FSH           96            5,2%        73,6% (a)      26,4% (a)
                           (5/96)        (67/91)        (24/91)
Control       85            4,7%        49,4% (b)      50,6% (b)
                           (4/85)        (40/81)        (41/81)

(a), (b): letras diferentes en la misma columna indican diferencia
significativa (P [menor que o igual a] 0,05).
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Author:Sanchez Riquelme, Alfonso; Lopez Zamorano, Leonardo; Silva Jimenez, Mauricio; Berland Olea, Marco
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Date:Mar 1, 2006
Words:3582
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