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MORPHOLOGICAL ALTERATIONS IN MICE SKINS INOCULATED WITH THE TOTAL SNAKE VENOM OF Philodryas nattereri/ALTERACOES MORFOLOGICAS DE PELE DE CAMUNDONGOS INOCULADOS COM O VENENO TOTAL DA SERPENTE Philodryas nattereri/LAS ALTERACIONES MORFOLOGICAS EN LA PIEL DE RATONES CAUSADAS POR EL VENENO DE LA SERPIENTE Philodryas nattereri.

INTRODUCAO

Os acidentes ofidicos constituem um dos maiores problemas de Saude Publica na America Latina (1), sendo atualmente classificados como doenca negligenciada pela OMS (World Health Organization, 2014). Apesar da incidencia mundial e de sua gravidade serem desconhecidas, estima-se que ocorra cerca de 2.500.000 casos de envenenamentos por serpentes peconhentas ao ano, o que resulta em, aproximadamente, 125.000 mortes e inumeros casos resultam em sequelas graves (2).

Dentre os paises latinos, o Brasil ocupa a 1a colocacao em numeros de casos, justificada pela sua grande extensao territorial (3). Foram registrados 103.422 acidentes ofidicos, com 464 obitos entre os anos de 2010 a 2013, sendo segundo o Sinan, no ano de 2012, 19.946 casos de acidentes ofidicos em humanos no pais (4).

O Brasil possui uma das mais ricas faunas de serpentes do Planeta, sendo conhecidas 366 especies, pertencentes atualmente a dez familias: Anomalepididae (6 especies), Leptotyphlopidae (14), Typhlopidae (6), Aniliidae (1), Tropidophiidae (1), Boidae (12), Colubridae (34), Colubridae (237), Elapidae (27), e Viperidae (28). Dessas, 15% (55 especies) sao consideradas peconhentas e sao responsaveis por cerca de 20 mil acidentes ofidicos anualmente no Pais (5). Apesar disto, levantamentos tem demonstrado que cerca de 20 a 40% dos acidentes ofidicos no Brasil sao causados por serpentes colubrideas (6,7).

As serpentes da familia Colubridae, genero Philodryas sao consideradas nao peconhentas (8). No entanto, alguns casos de envenenamento humano tem sido relatados na literatura (9). A baixa incidencia de acidentes causados por Philodryas e devido a anatomia dos dentes inoculadores (localizados na regiao posterior do maxilar), o que dificulta injetar o veneno, alem do seu comportamento nao agressivo (10).

O veneno produzido pelas serpentes e composto por toxinas. Existe uma grande variedade de estruturas toxicas decorrente da evolucao das especies. Assim, cada especie de serpente possui seu veneno com a sua composicao quimica caracteristica, levando a uma variacao dos efeitos do mesmo no organismo humano.

A pele e o primeiro orgao que entra em contato com o veneno, uma vez que todo e qualquer acidente ofidico ocorre pela inoculacao da peconha na mesma. Tem a funcao de protecao (nao so dos raios ultravioleta por meio da melanina, como protege contra a perda de agua e contra o atrito); colabora na termoregulacao do corpo; alem de participar do processo de excrecao de varias substancias (11).

A despeito da grande diversidade de serpentes opistoglifas brasileiras e escasso o conhecimento das propriedades bioquimicas e farmacologicas de seus venenos, e considerando a importancia dos acidentes ofidicos causados pelas serpentes do genero Philodryas. O objetivo deste trabalho foi de estudar os efeitos biologicos do veneno total da Philodryas natererri (P. nattereri) na pele de camundongos. Para este fim, foram observadas as alteracoes macroscopicas e histologicas provocadas por tal, inoculados via subcutanea em peles de camundongos nas concentracoes de 40pg/mL e 20pg/mL e, por via intradermica na concentracao de 40pg/mL.

MATERIAL E METODOS

Obtencao do Veneno

O veneno total foi extraido e gentilmente cedido pela professora doutora Diva Maria Borges Nojosa e pela medica veterinaria Roberta da Rocha Braga do Nucleo Regional de Ofiologia (NUROF) do departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceara--UFC, Fortaleza, Brasil. O veneno foi liofilizado e mantido a temperatura de--20[degrees]C ate o momento de sua utilizacao, onde foi diluido em solucao salina (0,9%, w/v solucao de NaCl).

Animais experimentais

Camundongos machos Swiss (20-30g), foram mantidos em alojamento com temperatura controlada, umidade relativa do ar 65,3 % e 12 h claro/escuro, receberam agua e comida ad libitum. Os animais e os protocolos experimentais utilizados neste estudo estao de acordo com as diretrizes da Comissao de Etica para uso de animais da Universidade Estadual do Ceara--UECE, numero de protocolo 2669326/2014.

Protocolo Experimental

Foram utilizados 34 camundongos, pesando aproximadamente 25g, provenientes do Bioterio Central da Universidade Estadual do Ceara. Os animais foram distribuidos em dois grupos: inoculados via subcutanea e via intradermica. O grupo que utilizou a via subcutanea foi dividido em tres subgrupos, onde 08 animais receberam a concentracao de 40 [micro]g/mL (Grupo A); 8 animais receberam 20 [micro]g/mL (Grupo B) e 6 animais formam o grupo controle (Grupo C), recebendo solucao salina. Aqueles que formam o grupo inoculado via intradermica foram divididos em dois subgrupos, onde 6 animais receberam a concentracao de 40 [micro]g/mL (Grupo D) e 6 animais formaram o grupo controle (Grupo E). As concentracoes estao de acordo com estudos encontrados na literatura (12).

Antes dos experimentos os animais foram submetidos a jejum alimentar e hidrico de 8 horas. Posteriormente foram anestesiados com xilazina e quetamina por via intraperitoneal (i.p) com a dose de 0,1mL/10g e a analgesia foi feita com 0,1mg/kg de tramadol. Em seguida ocorreu a tricotomia na regiao do dorso, onde ocorreu a inoculacao utilizando agulhas hipodermicas em seringas de insulina as diferentes concentracoes do veneno total.

Apos um intervalo de duas horas, 50% dos animais de cada grupo foram eutanasiados por deslocamento cervical, em seguida foram retirados fragmentos de pele de aproximadamente 1,5 [cm.sup.2] da regiao do dorso com auxilio de punch, para verificar a atividade hemorragica. Os outros animais do grupo foram mantidos vivos, com agua e racao a vontade por um periodo de 72h, quando foram eutanasiados e sua pele retirada para analise da atividade de necrose [adaptado (13)]. Desta forma, sendo os parametros avaliados: presenca de edema na derme, organizacao dos tecidos conjuntivos frouxo e denso, neoformacao vascular, integridade do epitelio e presenca de hemorragia e infiltrado inflamatorio. Para eutanasia os animais foram previamente anestesiados e procedeu-se o deslocamento cervical. As carcacas dos animais foram acondicionadas em sacos plasticos especificos para residuo biologico e congeladas para posterior coleta pela empresa responsavel pelo descarte de material biologico da Universidade Estadual do Ceara.

Analise Macroscopica e Microscopica

O local de aplicacao do veneno na pele foi fotografado por uma camera fotografica da marca Sony[R], modelo Cyber Shot 16.1 megapixels, para analise macroscopica. Para analise histologica, os fragmentos da pele foram acondicionados em frascos contendo solucao de formol tamponado a 10% por um periodo de 24 horas. Em seguida esses fragmentos foram lavados em agua corrente por uma hora para eliminacao de residuos de formol. Posteriormente os mesmos foram transferidos para o etanol a 70% permanecendo imerso nesta substancia por um periodo de 24 horas, sendo iniciado o processo de desidratacao em sucessivas diluicoes crescentes de etanol. Posteriormente passaram pelo processo de diafanizacao, parafinizacao e em seguida foram levados para corte no microtomo na espessura de 3 [micro]m. Procedeu-se a coloracao do material por Hematoxilina-Eosina (HE) e, posteriormente novas laminas receberam a coloracao Tricomio de Masson para observacao da distribuicao de fibras colagenas. As laminas foram analisadas em microscopia de luz (MOTIC BA310, Moticam 2000).

Analise Estatistica

Os resultados foram apresentados como media [+ or -] desvio padrao da media, onde n representa o numero de experimentos. Foi considerada diferenca estatistica significativa os resultados que apresentaram probabilidade de ocorrencia da hipotese nula menor que 5% (p < 0,05). Os dados histologicos sao considerados nao-parametricos e, para tanto, foi utilizado o Teste de Kruskal-Wallis, para analise de significancia da diferenca entre as medias.

RESULTADOS

Efeito macroscopico da exposicao ao veneno de P.nattereri

Duas horas apos a inoculacao do veneno, observou-se a formacao de uma crosta, bem como hemorragia nos tres grupos inoculados com veneno, sendo mais evidente no grupo que recebeu via subcutanea na concentracao de 40pg/mL (Figura 1C).

Imediatamente apos a eutanasia, a hemorragia foi considerada intensa, observando macroscopicamente a superficie interna da pele (Figura 1B e Figura 1D). Estes resultados se apresentaram em todos os grupos, exceto no controle (Figura 1A).

Analise histologica da pele corada por HE inoculada com veneno de P.nattereri

O grupo controle mostrou apenas pontos difusos de infiltrado inflamatorio linfoblastico e de polimorfonucleares, classificados como discreto (Figura 2A). As alteracoes histologicas se apresentaram em todos os grupos, em ambas as vias de administracao, de maneira crescente e dose dependente, quando comparada ao grupo controle.

Presenca de intenso infiltrado inflamatorio de linfocitos e plasmocitos, no grupo A que foi eutanasiado com 2 horas. Passou a ser moderada nos animais que foram eutanasiados nas 72 horas apos inoculacao. No grupo B, as celulas inflamatorias tiveram uma intensidade moderada nos animais eutanasiados em 72 horas. Aqueles que foram eutanasiados com 2 horas apos inoculacao apresentaram discreto infiltrado inflamatorio difuso. O mesmo ocorreu com o grupo D, com a presenca de plasmocitos e mastocitos. Desta forma, todos os grupos que receberam concentracoes de venenos apresentaram uma media moderada para infiltrado inflamatorio (Tabela 1).

Hemorragia foi observada macroscopicamente apos as 2 primeiras horas de inoculacao, sendo confirmada microscopicamente, visto que ela se mostrou intensa em todos os grupos, sendo a grupo A de maior intensidade (Figura 2A) proxima a camada muscular estriada esqueletica. Nos animais eutanasiados com 72 horas, a atividade hemorragica se manteve presente microscopicamente, porem sua intensidade passou a ser leve, e, em cada grupo, observou-se um animal com tal atividade ausente. A media apresentou-se moderada para a hemorragia em todos os grupos, exceto os controles (Tabela 1).

O halo necrotico foi de grau leve e apenas nos animais eutanasiados com 72 horas do grupo A. Nos demais grupos, esta atividade esteve ausente (Tabela 1).

Presenca de edema em todos os animais do grupo A, variando em todos os graus, dando uma media intensa. No grupo B, um animal nao apresentou edema, porem os outros se apresentaram de forma intensa. Assim como tal, o grupo D tambem apresentou um animal com ausencia de edema, porem nos demais animais do grupo a atividade foi moderada (Tabela 1).

Observou-se em todos os grupos, exceto controle, neovascularizacao na derme reticular e vasos congestos proximos a musculatura.

Analise histologica da pele corada por Tricomio de Masson inoculada com veneno de P.nattereri

A fibrose apresentou-se de forma intensa em todos os animais do grupo A (Figura 4B e 4D), exceto um animal que apresentou atividade leve. Os animais do grupo B (Figura 4C), que receberam a concentracao de 20 [micro]g/mL, apresentaram uma media de fibrose variando de leve a intensa, ficando uma media moderada. Para o grupo D, um animal nao apresentou tal atividade, porem nos demais animais a fibrose foi mais intensa, justificando, assim, uma media intensa para o grupo (Tabela 1).

DISCUSSAO

P.nattereri apresenta os dentes inoculadores localizados na regiao posterior do maxilar, dificultando desta forma, a inoculacao do veneno mais profundamente na vitima (10). Assim, a importancia de se estudar as alteracoes morfologicas na pele como o orgao que sofrera o maior dano quando um acidente ofidico ocasionado por esta especie ocorre.

A literatura e vasta no que se refere ao veneno de serpentes pertencentes principalmente as familias Elapidae, Crotalidae e Viperidae (12). Porem, os estudos acerca da peconha das Philodryas, ainda sao escassos, uma vez que a sua producao ocorre em pequena quantidade (14). Alem disto, poucos sao os estudos acerca do sistema tegumentar em envenenamentos por serpentes deste genero. Nao foram encontradas referencias cientificas sobre estudos de lesoes em pele apos inoculacao desse veneno em modelo animal.

Estudos realizados sobre a atividade citotoxica da peconha da Philodryas olfersii, demonstraram induzir varias alteracoes morfologicas no musculo de ratos (15). Sinais e sintomas locais provocados tanto por P. patagoniensis, como pela P. olfersii, podem ser confundidos com aqueles encontrados em acidentes botropico (12). Logo, um conhecimento das caracteristicas do envenenamento em pele por este tipo de veneno e necessario, para que a vitima receba o soro especifico, evitando assim, os efeitos nocivos sobre a sua saude no uso de um soro inapropriado (16).

Efeito intenso no local da picada, incluindo dor, edema, hemorragia e necrose sao caracteristicas comuns tanto em acidentes por serpentes do genero Bothrops como Colubridae (17). E sabido que, se a administracao do soro antiofidico for feita de forma rapida, a neutralizacao dos efeitos sistemicos e conseguida de forma eficaz (18). Porem, uma neutralizacao do dano tecidual local e uma tarefa mais dificil e a falta dela resulta em sequelas permanentes com perda e alteracoes de tecidos (19).

O edema e produzido como uma consequencia da lesao vascular e da descontinuidade endotelial, bem como por liberacao de substancias vasoativas, como histamina, prostaglandina, endotelina, oxido nitrico, etc (18,19). Estudos do efeito local de envenenamento com Bothrops demonstraram ser complexo, apresentando edema e hemorragia em poucos minutos (18), efeitos semelhantes foram observados no presente trabalho. Macroscopicamente, foi observada a formacao de uma crosta nos animais de todos os grupos experimentais.

Na literatura ha relatos de que o veneno de P. patagoniensis demonstrou ser mais ativo que o da P. olfersii, porem ambos apresentaram respostas hiperalgesicas importantes (20). A atividade hemorragica dos venenos de colubrideos e atribuida a atuacao de metaloproteinases, enzimas proteoliticas com atividade dependente do ion zinco (21,15). Assim como nos viperideos, as hemorraginas presentes no veneno podem ter um papel semelhante com relacao aos processos digestivos das serpentes e a presenca de atividade hemorragica tem sido largamente indicada em varias especies de colubrideos (22).

Estudos relatam que venenos de P. patagoniensis e P. olfersii apesentaram Dose Minima Hemorragica (DMH) e 26,9 [micro]g/rato e 24,1 [micro]g/rato, respectivamente, com a acao mais rapida nos tempos de 2 e 4 horas (20). Tambem ha descricao das alteracoes promovidas pela acao toxica do veneno da P. nattereri em musculos de camundongos inoculados com doses de 50 [micro]g nos tempos de 2h, 4h, 24h e 48h. Em tal trabalho, observou-se hemorragias nas duas primeiras horas. Apos 04 horas de inoculacao, a hemorragia permaneceu ate as 8 horas seguintes (23). Nossos estudos corroboraram com estes resultados anteriores, pois os grupos com concentracoes de 20 [micro]g/mL e 40 [micro]g/mL que foram eutanasiados com duas horas apos a inoculacao apresentaram atividade hemorragica moderada.

Apos inoculacao de 40 [micro]g/mL do veneno da P. patagoniensis no dorso de camundongos, observou-se macroscopicamente hemorragia ao redor do local da inoculacao (12). Em nossos resultados, tambem foi observada hemorragia de forma macroscopica em todos os grupos experimentais que receberam a peconha.

Para a atividade necrosante, a Dose Minima Necrosante DMN foi igual a 180 [micro]g/rato em determinado estudo com P. patagoniensis (12). Ha na literatura outro relato de lesao necrotica com veneno de P. patagoniensis e P. olfersii nas doses de 50, 60,70,80 e 90 [micro]g (20). No presente estudo, as concentracoes utilizadas foram de 20 e 40 [micro]g/mL e apenas a de maior dose apresentou necrose de intensidade leve.

Relatos acerca de efeitos biologicos de venenos em peles de animais, envolvendo outras especies de serpentes, tambem sao descritos, visto a importancia da reacao da peconha no tegumento. Em um estudo acerca do efeito necrotico de venenos em pele, observou-se que a crotoxina, uma toxina presente no veneno crotalico, em concentracoes de 40 [micro]g/mL, induziu a formacao de extensas areas de necrose, na camada muscular subcutanea. Bem como tal, nossos estudos apresentaram atividade necrotica em um grupo, tambem localizada nas regioes mais profundas da derme, caracterizando, assim uma acao de dermonecrose. Tal acao tambem foi observada em analises histopatologicas em caes envenenados por Crotalus (24). Entretanto, no presente estudo, nao foi possivel observar macroscopicamente, diferentemente de estudos anteriores.

Na literatura e descrito a evolucao de edema em pata de ratos inoculados com veneno de P. nattereri, onde sua acao se deu de forma rapida, sendo bem pronunciado, atingindo seu efeito maximo nas duas primeiras horas apos inoculacao nas concentracoes de 3 e 10 [micro]g/mL (24). A sua regressao foi de forma gradativa ate as 24horas seguintes (24). Este estudo confirma os nossos resultados, no que se refere a uma atividade edematogenica nas duas primeiras horas. Porem, diverge no que diz respeito as horas seguintes, uma vez que o edema foi observado em nossos resultados ate 72 horas apos inoculacao. Isto pode estar ligado a quantidade inoculada, uma vez que nossas concentracoes foram de 2 ate 4 vezes maior (20 e 40 [micro]g/mL).

Estudos preliminares demonstraram que a atividade edematogenica causada pelo veneno de Philodryaspatagoniensis foi de 0,26 mg (Dose Minima de Edema--DME) (12), sendo muito superior aquela causada pelo veneno de especies de Bothrops da Argentina, tais como: B. jararaca, B. jararacussu, B. neuwiedii e B. alternatu, que apresentam valores de DME de 0,85; 1,5; 2,05 e 4,00 mg, respectivamente (25).

O processo inflamatorio com infiltrado de celulas como plasmocitos e mastocitos descrito neste trabalho corrobora com estudos anteriores, que descreveram um processo inflamatorio moderado, composto por leucocitos polimorfonucleares em pele de ratos inoculados com veneno de P. patagoniensis (12). Tal inflamacao e sugestiva de ser uma agressao tecidual direta provocada pelo veneno da P. nattereri. Isso se deve pela perda da estrutura endotelial e por liberacao de substancias vasoativas (18,19). Em estudos utilizando o mesmo veneno (24), porem em concentracoes menores, confirmaram-se os achados no nosso trabalho, pois apresentaram moderado exsudato inflamatorio persistindo ate 8 horas apos inoculacao, que passou a ser discreta nas 24 e 48 horas seguintes (24).

Estudos com venenos de serpentes vem ganhando importancia na area morfofisiofarmocologica, uma vez que sao substancias ricas em proteinas e toxinas. Desta forma, elucidar o mecanismo de acao de uma peconha em orgaos e seus efeitos biologicos, e o passo inicial para um maior entendimento da composicao e fisiopatologia do mesmo. Os acidentes ofidicos ocorrem com a inoculacao do veneno na vitima atraves da pele, sendo este orgao, portanto, o primeiro contato do veneno com o organismo vitimado.

CONCLUSAO

O veneno de Philodryas nattereri provocou alteracoes histopatologicas significativas nos tecidos da pele, porem este estudo nao permitiu esclarecer seu mecanismo exato de acao. Estudos mais especificos sobre o veneno de Philodryas nattereri se fazem necessarios, a fim de se estabelecer quais os componentes do veneno provocam os efeitos biologicos locais, bem como, quais os fatores desencadeantes causadores de uma inflamacao local, ou se ha uma acao direta e/ou indireta dos fatores toxicos do veneno sobre a pele.

Projeto aprovado pelo Comite de Etica para o Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceara, sob numero 2669326/2014.

Recebido em: 06/06/2015

Aceito em: 20/12/2016

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Rebeca Horn Vasconcelos [1]

Joao Alison de Moraes Silveira [2]

Glayciane Bezerra de Morais [1]

Joselito de Oliveira Neto [1]

Francisco Antonio Felix Xavier Junior [1]

Karen Denise da Silva Macambira [1]

Natacha Teresa Queiroz Alves [2]

Roberta da Rocha Braga [3]

Diva Maria Borges-Nojosa [3]

Celia Maria de Souza Sampaio [4]

Helena Serra Azul Monteiro [2]

Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista [1]*

[1] Laboratorio de Histologia dos efeitos causados pelos venenos de serpentes e plantas--HISTOVESP. Faculdade de Veterinaria. Universidade Estadual do Ceara. Fortaleza. Brasil.

[2] Laboratorio de Farmacologia de Venenos, Toxinas e Lectinas--LAFAVET. Faculdade de Medicina. Universidade Federal do Ceara. Fortaleza. Brasil.

[3] Nucleo Regional de Ofiologia--NUROF. Universidade Federal do Ceara. Fortaleza. Brasil

[4] Coordenacao de Ciencias Biologicas. Centro de Ciencias da Saude. Universidade Estadual do Ceara. Fortaleza. Brasil.

* Contato para correspondencia: janainaserrazul@gmail.com

Caption: Figura 1. Aspectos macroscopicos de cortes representativos de pele exposta ao veneno total da Philodryas nattereri no local da inoculacao A--Grupo controle via SC. B--Hemorragia macroscopica no grupo B, concentracao de 20pg/mL, via SC. C--Grupo A, regiao do dorso 2h apos inoculacao de 40 [micro]g/mL via SC. D--Grupo D, hemorragia macroscopica onde foi inoculado via ID, 40 [micro]g/mL.

Caption: Figura 2. Fotomicrografias de cortes histologicos da regiao da pele (derme profunda) do dorso de camundongos exposta ao veneno total na concentracao de 40 [micro]g via SC da P. nattereri (H&E). Em A--Grupo controle, aumento de 100x. B--presenca de hemorragia, aumento de 400x. C--Formacao de edema, aumento de 200x. D--Presenca de edema, descontinuidade de epiderme, acumulo de fibras colagenas, aumento de 100x. (*) Camada muscular subcutanea ([right arrow]) Hemorragia ([right arrow]) edema. Microscopio Trinocular Motic[R] BA310 (Motic[R] 2000 2.0 MP Live Resolution) e software Motic Image Plus 2.0.

Caption: Figura 3. Fotomicrografias de cortes histologicos da regiao da pele (derme profunda) do dorso de camundongos exposta ao veneno total na concentracao de 20 [micro]g via SC da P. nattereri (H&E). Em A--Grupo controle (100x). B--presenca de hemorragia (200x). C--Acumulo de fibras colagenas e presenca de edema (200x). D--Formacao de edema, proximo a musculatura (400x) (*)--Camada muscular subcutanea; ([right arrow]) Hemorragia ([right arrow]) edema ([??]) acumulo de fibras colagenas. Microscopio Trinocular Motic[R] BA310 (Motic[R] 2000 2.0 MP Live Resolution) e software Motic Image Plus 2.0.

Caption: Figura 4. Fotomicrografias de cortes histologicos da regiao da pele (derme profunda) do dorso de camundongos exposta ao veneno total da P. nattereri (Tricomio de Masson). Em A--Grupo controle (100x). B--Acumulo de fibras colagenas e presenca de edema do grupo A, (100x). C--grupo B apresentando hemorragia e fibrose (100x). D-Grupo A com edema e fibrose (400x) (*)--Camada muscular subcutanea; ([right arrow]) Hemorragia ([right arrow]) edema ([??]) acumulo de fibras colagenas. Microscopio Trinocular Motic[R] BA310 (Motic[R] 2000 2.0 MP Live Resolution) e software Motic Image Plus 2.0.
Tabela 1. Efeitos citotoxicos do veneno de Philodryas nattereri em
diferentes concentracoes e vias de administracao sobre a pele do
dorso de camundongos

Grupos experimentais   Infiltrado     Hemorragia   Necrose
                       inflamatorio

GA-40 [micro]g/mL SC        2             2           1
GB-20 [micro]g/mL SC        2             2           0
GC-Controle SC              1             0           0
GD-40 [micro]g/mL ID        2             2           0
GE-Controle ID              1             0           0

Grupos experimentais   Edema   Fibrose

GA-40 [micro]g/mL SC     2        3
GB-20 [micro]g/mL SC     3        2
GC-Controle SC           0        0
GD-40 [micro]g/mL ID     2        3
GE-Controle ID           0        0

0-AUSENTE 1-LEVE OU DISCRETA 2-MODERADA 3-INTENSA
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Author:Vasconcelos, Rebeca Horn; de Moraes Silveira, Joao Alison; de Morais, Glayciane Bezerra; de Oliveira
Publication:Veterinaria e Zootecnia
Date:Jun 1, 2017
Words:4407
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