Printer Friendly

Leishmania tropica Uzerinde In vitro ve In vivo Ilac Etkinliginin Degerlendirilmesi: Pilot Calisma/Evaluation of In vitro and In vivo Drug Efficacy Over Leishmania tropica: A Pilot Study.

GIRIS

Leishmaniasis'in Dunya Saglik Orgutu'nun verilerine gore, bes kitada 98 ulkede yaklasik 12 milyon insani enfekte ettigi ve 350 milyon kisinin ise risk altinda oldugu bilinmektedir. Her yil bu rakamlara iki milyon yeni olgunun eklendigi, bu olgularin yaklasik bir bucuk milyonunun kutanoz leishmaniasis (KL), yarim milyonunun ise visseral leishmaniasis (VL) oldugu tahmin edilmektedir. Leishmaniasis'e bagli yillik olum sayisinin 50.000 oldugu belirtilmektedir. Kutanoz leishmaniasis olgularinin %90'i Afganistan, Cezayir, Brezilya, Iran, Peru, Suudi Arabistan ve Suriye'de bulunmaktadir. KL'nin son 10 yilda gorulme sikliginda artis gozlenmekte, yaklasik her 20 saniyede bir kisinin KL'ye yakalandigi hesaplanmaktadir (1).

Leishmaniasis olgularinin artma nedenleri arasinda kirsal bolgelerden kentlere goc, enfeksiyonun endemik oldugu bolgelerde is sahalarinin acilmasi, malnutrisyon, sosyoekonomik duzeyin dusuklugu ve HIV/Leishmania koenfeksiyonunda artis sayilabilir. Leishmaniasis'in yol actigi ekonomik kayip tibbi bakim ve tedaviler ile birlikte is gucu bakimindan degerlendirildiginde oldukca buyuktur; bu nedenle gelismekte olan ulkelerin ekonomileri icin leishmaniasis ciddi bir sorundur. Gelismis ulkelerde ise HIV/Leishmania koenfeksiyonunda gorulen artis nedeniyle leishmaniasis'e ilgi artmaktadir (2-4).

Ulkemizde resmi rakamlara gore 2005-2012 yillari arasinda 14.587 KL olgusu ve 207 VL olgusu bildirilmistir. Son yillarda, basta Akdeniz ve Ege Bolgesi illerimizde olmak uzere toplam 39 ilimizden sporadik olgular bildirilmis, ayrica enfeksiyon odagi olarak bilinen yorelerdeki leishmaniasis olgularinda onemli oranda artis gorulmustur. Kutanoz leishmaniasis basta Guney Dogu Anadolu Bolgesi olmak uzere Akdeniz, Orta Anadolu ve Ege bolgelerinden bildirilmektedir. Simdiye dek yapilan calismalarla hastaligin etkeninin Leishmania tropica'nin farkli zimodemleri oldugu ayni zamanda Leishmania infantum'un da KL'ye sebep olabildigi gosterilmistir (5).

Farkli turlere bagli olarak olusan KL'deki lezyonlar tedaviye yanit verme acisindan degiskenlik gosterebilmektedir. KL tedavisinde uzun yillardir daha yuksek dozlarin kullanimina ve daha kisa sureli tedavilere olanak sagladigindan dolayi 5 degerli antimon bilesiklerinin organik tuzlari tercih edilmektedir. Leishmania parazitinin glikoliz ve diger metabolik yollardaki enzimlerini inhibe ederek etki gosterdigi dusunulen antimoniyallerin ticari olarak iki farkli 5 degerli antimon bilesigi bulunmaktadir. Bunlar Sodyum stiboglukonat ve Meglumin antimonyattir. Turkiye'de sodyum stiboglukonatin "pentostam" markali ticari formu bulunurken meglumin antimonatin ticari urunu "glucantime" dir. Sodyum stiboglukonat %10 antimon icerirken meglumin antimonyat ise %8,5 antimon icermektedir. Esit dozlarda kullanildiginda iki ilacinda ayni etkiye sahip oldugu dusunulmektedir. KL hastalarinda bulunan lezyonun tek ve papulonoduler oldugu ve intralezyoner tadaviye uygun lokalizasyonda yer alan lezyonlarda intralezyoner (IL) tedavi uygun gorulmektedir. Tedavinin 1-2 ml pentavalan antimoniyollerin IL olarak haftada 3 kez uygulanarak 4 ya da 5 hafta devam edilerek uygulanmasi tavsiye edilmektedir. Bununla birlikte, lezyona uygulanan ilacin miktari lezyonun durumuna gore farklilik arz edebilmektedir. Hastada birden fazla lezyon bulundugu durumlarda, IL uygulamaya uygun olmayan lezyonlarda ve tedaviye cevap alinamayan kronik olgularda ise sistemik tedavi uygulanmaktadir. Bu durumda ise 20 mg [Sb.sup.v]/kg 20 gun sure ile IM olarak kur uygulanmasi tavsiye edilmektedir. Birinci kurden sonuc alinamayan olgularda ikinci hatta ucuncu kurun uygulanmasi onerilmektedir (6, 7).

Leishmaniasis kontrolu tedaviye direncli parazitlerin ortaya cikmasiyla cok daha karmasik bir hal almistir. Klinikte 5 degerli antimon bilesiklerine direnc onem kazanmakta olup Guney Amerika (8-10), Avrupa (11, 12), Orta Dogu (13, 14) ve ozellikle Hindistan'da (15-18) bu direnc gorulmeye baslanmistir. Hatta Hindistan'da endemik bir bolge olan Bihar'da 5 degerli antimon bilesikleri ile tedavinin %60 basarisiz oldugu gorulmekte ve direncli parazitler ile enfekte olgularin tedaviye yanit vermedigi bildirilmektedir. Alternatif olarak kullanilabilecek az sayida ilac vardir; bunlar arasinda amphotericin B, pentamidine ve oral kullanilan, Hindistan'da VL icin 4. faz, Iran'da ise KL icin 3. faz klinik calismalari yurutulmekte olan miltefosin yer almaktadir. Miltefosin'e karsi parazitlerin etkinliginde azalma goruldugu bildirilmistir (10, 19, 20). Bu nedenle Leishmaniasis konusunda yeni ilac arastirmalarina gereksinim vardir.

Yeni ilaclarin gelistirilmesi ve degerlendirilmesi sureci iki ana degerlendirme basamagindan olusmaktadir. Klinik oncesi degerlendirmede; sentez edilen veya dogal kaynaklardan izole edilen kimyasal maddelerin, once mutlaka in vitro ve in vivo olarak etkinliklerinin arastirilmasi gerekmektedir.

Mikroorganizmalara karsi gelistirilen yeni maddeler, genellikle toksisite deneylerine tabi tutulmadan once tarama testlerine tabi tutulurlar. In vitro ortamlarda tarama testleri yapilabilmekte ancak ongorulen etkinin ozelligi nedeniyle bazi tarama testlerinin sadece in vitro ortamda yapilmasi uygun olmamaktadir. Tarama testlerinde hastaligi temsil eden hayvan modelleri kullanilmaktadir. Cunku etken maddenin biyokinetik ozellikleri, metobolizma hizlari ve organlar arasi etkilesim ozellikleri sadece olusturulan bu modellerle saptanabilmektedir. Bu sayede gelistirilme amacini olusturan ve sahip olmasi ongorulen etki ya da etkileri gosteren maddeler belirlenmektedir. Bu ozelligi bulunmayan maddeler icin deneme artik bu kademede bitmis olarak kabul edilmektedir.

Deneyler sonrasi yalnizca tarama testlerini basari ile gecen bilesikler toksisite testlerine tabi tutulmaktadirlar. Bu asamada fonksiyonel, biyokimyasal ve histopatolojik toksik etkiler incelenmektedir. Klinik degerlendirme basamaginin ise Faz I, Faz II, Faz III ve Faz IV denemelerinden olustugu bildirilmektedir (21).

Bu calismada ulkemizde bir olgudan izole edilen ve sivi azot icinde sus bankasinda saklanan bir Leishmania tropica izolati uzerine yine Turkiye'de KL tedavisinde ilk secenek olarak kullanilan ilaclarin (meglumin antimonat (Glucantime[R], Fransa)'ve sodyum stiboglukonat (Pentostam[R], Ingiltere)' etkinlik ve direnc varligi in vitro ve in vivo model uzerinde calisilmis olup kullanilan yontemin bu konuda calisacak arastirmacilara yol gostermesi ve kaynak olusturmasi amaclanmistir.

YONTEMLER

NNN Besiyerinin Hazirlanmasi

Kat/ faz: Agar 5 gr, pepton 2 gr, NaCl 1 gr ve 200 mL distile su bir balona konularak 121 [degrees]C'de 20 dk. otoklavlanmistir. Aseptik kosullarda tavsan kalbinden 30 mL kan alinmis ve defibrinize edilerek kucuk steril bir balona aktarilmistir. 1,3 mL gentamisin ve 2,3 mL penisilin/streptomisin solusyonu eklenerek karistirilmistir. Agar yaklasik 50 [degrees]C'ye kadar sogutulup kan agarin uzerine eklenerek karismasi saglanmis ve hemen steril tuplere 3-4 mL dagitilmistir. Tuplere belli bir egim verilerek katilasincaya kadar oda isisinda tutulup ardindan +4 [degrees]C'de saklanmistir. Sivi faz: Kati faz uzerine 1 ml %10 FCS iceren RPMI besiyeri eklenmis ve besiyeri ekim yapmaya uygun hale getirilmistir.

Kutanoz Leishmaniasis'li Olgudan Ornek Alinmasi

Ornek alinirken lezyonun cevresindeki doku %70 alkol ile temizlenip kurumaya birakilmistir. Lezyon bas ve isaret parmagi arasinda tutularak yara ile saglam dokunun birlesme sinirindan 1 mL'lik insulin enjektoru ile 0,2-0,5 mL serum fizyolojik verilip tekrar geri cekilerek aspirasyon sivisi alinmistir. Lezyondan elde edilen aspirasyon sivisindan NNN besiyerlerine ekim yapilmistir. Besiyerleri 25 [degrees]C'de saklanmis ve promastigotlarin varligi acisindan bir ay sureyle gun asiri kontrol edilmistir. Ilk uremenin gerceklestigi besiyerlerinden ornekler alinmistir. Alinan ornekler fazla miktarda uretmek amaciyla RPMI-1640 besiyerinde (%10 FCS + %1 penisilin/streptomisin + %1 gen-tamisin) kulture alinmistir. RPMI 1640 besiyerinde logaritmik faza ulasan promastigotlara %15 oraninda DMSO eklenerek kryoprezer-vasyon islemi uygulanmis ve sivi azotta saklanmistir. Calismamizda sivi azotta saklanan bu izolatlar kullanilmistir.

Leishmania Izolatinin Kulturu

Sivi azotta kriyoprezervasyon uygulanarak saklanan promastigotlar sivi azottan cikarilip sicak su banyosunda hizli bir sekilde cozduruldukten sonra NNN besiyerine ekilmistir. Ilk ureme gerceklestikten sonra fazla miktarda uretmek amaciyla RPMI-1640 besiyerinde kulture alinmistir. Ticari olarak temin edilen besiyeri icerisine kullanmadan once %10 FCS, %1 penisilin/streptomisin ve %1 gentamisin eklenmistir. 25 mL'lik flasklere 5 mL olacak sekilde dagitilmis ve ureyen promastigot-lardan 50 [micro]L uzerine ilave edilerek ekim yapilmistir. Ekim yapilan flaskler 25[grados]C'lik etuvde inkube edilmistir. Parazitlerin cogalmasi takip edilerek 2-3 gunde bir besiyerinin eklenmesiyle [10.sup.8] promastigot/mL iceren besiyeri elde edilmistir. Daha sonra promastigot sayisi [10.sup.6] pro-mastigot/mL olacak sekilde Thoma lami ile sayilarak promastigot iceren suspansiyon hazirlanmistir.

Leishmania Promastigotlarinin PZR Yontemi Ile Genotiplendirilmesi

DNA izolasyonu: Leishmania izolatinin genotiplendirilmesi icin genetik materyalin elde edilmesinde uygulanmistir. DNA izolasyonu High Pure PCR Template Preparation Kit ile yapilmistir.

Genotiplendirme: Calismalarda, ITS1 problu gercek zamanli PZR testi uygulanmistir (22, 23). Leishmania parazitlerinin ssu rRNA ve 5.8S rRNA'yi kodlayan genleri ayiran ribozomal internal transcribed spacer 1 (ITS1) bolgesi, Forward primer; 5'-CTGGATCATTTTCCGATG-3', Reverse Primer; 5'-GAAGCCAAGTCATCCATCGC-3' primerleri QuantiTect Probe PCR Kit Master karisimi ile birlikte asagida yazili ozgun problar kullanilarak cogaltilmistir.

Probe 1: 5'- CCGTTTATACAAAAAATATACGGCGTTTCGGTTT-Fluo-3'

Probe 2: 5'-LCRed-640-GCGGGGTGGGTGCGTGTGTG-Pho-3' Gercek zamanli PZR analizi icin hazirlanan toplam 25 [micro]L'lik reaksiyon karisimi; 1,5 [micro]L [H.sub.2]0 (PCR grade water), 1 [micro]L Forward Primer, 1 [micro]L Reverse Primer, 0,5 [micro]L Probe1, 0,5 [micro]L Probe2, 12,5 [micro]L QuantiTect Probe PCR Kit Master karisimi (Qiagen) ve 5 [micro]L genomik DNA icermektedir. Rotor-Gene'de melting analizi yapilarak sonuclar elde edilmistir.

In vitro Ilac Direnc Testleri

Calismamizda mikroplak dilusyon yontemi kullanilarak ilaclarin Leishmania promastigotlari uzerindeki antiparaziter etkinlikleri in vitro olarak test edilmistir. Calismamizda sagaltimi tamamlanan hastalardan geriye kalan ilaclar kullanilmistir. Duz tabanli 96'lik hucre kulturu plagi yatay olarak kullanilmis ve 12 siranin 3'u blank (Kor kuyucuk), 3'u ilacsiz parazit kontrol, 3'u meglumin antimonat (Glucantime[R], Fransa) ve 3'u sodyum stiboglukonat (Pentostam[R], Ingiltere) icin olacak sekilde isaretlenmistir. Her bir kuyucuga RPMI 1640 besiyerinden (%10 FCS + %1 penisilin/streptomisin + %1 gentamisin) 100 [micro]L dagitilmistir. Meglumin antimonat (Glucantime ([R]), Fransa) ve sodyum stiboglukonat (Pentostam ([R]), Ingiltere) icin ayrilmis olan 3 bolmenin her birinin ilk kuyucuguna istenilen ilac konsantrasyonunun iki kati olacak sekilde standart besiyerine ilaclar eklenerek 100 [micro]L hazirlanmistir. (Bu calismamizda ilk doz 300 [micro]g/mL bu nedenle 600 [micro]g/mL olacak sekilde hazirlanmistir) Hazirlanan bu ilacli besiyeri ilk kuyucuklara eklenmistir. Coklu pipet ile ilk kuyucuktan digerlerine 100 [micro]L aktarim yapilarak ilac konsantrasyonlari hazirlanmistir (300, 200, 100, 50, 25 ve 12,5, 6,25 [micro]g/mL) (Resim 1). Son kalan 100 [micro]L atilmistir. Daha sonra hazirlanan promastigot suspansiyonundan 100 [micro]l olacak sekilde butun kuyucuklara eklenmistir. Blank bolmelerine parazit ilave edilmemistir. Hucre kulturu plaginin kapagi kapatilarak etrafi parafinle kaplanmistir. Etuvde 25 [degrees]C'de 48 saat inkube edilmistir (Resim 2). Bu islemlerin ardindan asagida tarif edilen iki yontem kullanilarak in vitro etkinlik duzeyleri belirlenmis ve calisma gruplari diskriminant analizi ile istatistiksel olarak degerlendirilmistir (24).

Hemositometre yontemi

Neubauer'in Thoma lami uzerinde iki yanda bulunan cikintilar hafifce islatilmistir. Lamel bunlarin arasini kapatacak sekilde yerlestirilmistir. Iki elin basparmaklari ile konsantrik Newton halkalari belirinceye kadar bastirilmistir. Daha sonra etuvden plak cikarilip her bir kuyucuktan ayri ayri ornek alinarak lam-lamel arasina sayim kamaralarinin oldugu kenardan damlatilmistir. Bu sivi kapillarite nedeni ile lam uzerinde bulunan sayim alanina yayilmis ve aktarilan sivinin hareketsizlesmesi icin 1-2 dakika beklenilmistir. Once mikroskobun diyaframi kapatilip kucuk buyutmesinde (10x) sayim yapilacak olan cizgili alan bulunmus ardindan karelere dusen Leishmania promastigotlarini saymak amaci ile buyuk buyutme (40x) ile bakilmistir. Thoma laminin her bir kosesinde bulunan toplam dort kare ve orta alandaki kare icerisinde bulunan promastigotlar sayilmistir. Toplam promastigot sayisi 10.000 ile carpilip sayilan kareye bolunerek mL'deki promastigot sayisi bulunmustur (Resim 3).

XTT (sodium 3,39-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis (4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonik asit hidrat) direnc testi Yeni bir 96'lik duztabanli hucre kulturu plagi alinip sure sonunda plak etuvden cikarilarak ve her bir kuyucukdan 100 [micro]L alinarak yeni plaga aktarilmistir. Ayri bir yerde 5 mL reagent ve 0,1 mL "electron coupling" karistirilmistir. Yeni plagimizin her bir bolmesine 50 [micro]L eklenerek 25 [degrees]C'de 4 saat inkube edilmistir. Inkubasyon sonunda plak spektrofotometrede 450 nm'de okuma yapilmistir (Resim 4). Okuma sonunda cikan absorbans degerleri not edilerek canlilik hesaplamasi icin asagida belirtilen formule gore hesaplama yapilmistir.

Canlilik yuzdesi (%)=[Calisma ornegi absorbansi--Blank absorbansi/Kontrol ornegi absorbansi--Blank absorbansi] = X 100

Calismalar uc kez tekrarlanmistir (25).

In vivo Ilac Direnc Testleri

Leishmaniasis modeli olusturmak icin kullanilan promastigotlar, 10 mL kultur sivisinin 1500 devirde 10 dakika santrifujlenip, dipte kalan cokeltinin steril serum fizyolojik ile 3 kez yikanmasi ile elde edilmistir. Promastigot suspansiyonunun son konsantrasyonu [10.sup.8] promastigot/mL olacak sekilde mikroskopta sayilarak ayarlanmistir. Hayvan modellerinin gelistirilmesinde Balb/C cinsi fareler kullanilmistir. Fareler disi, 7-8 haftalik ve 20-25 gr agirliginda olup, ad libitum olarak beslenmislerdir. Deney hayvanlarinin sag ayak tabanlarina, derialtina 100 [my]L promastigot solusyonu enjek-te edilmistir (Resim 5, 6). Enfeksiyonun olusturuldugu tarihi takip eden 5. haftadan itibaren sagaltimi tamamlanan hastalardan geriye kalan ilaclar kullanilarak asagidaki tedavi semasi uygulanmistir;

1.Deney Hayvani Grubu: Enfekte tedavi almayan grup.

2.Deney Hayvani Grubu: Meglumin antimonat tedavisi alan (Bes degerlikli antimon olan meglumin antimonat 20 mg/kg/gun, 21 gun sureyle her gun intra-muskuler olarak verilmistir).

3.Deney Hayvani Grubu: Sodyum stiboglukonat tedavisi alan (Bes degerlikli antimon olan sodyum stiboglukonat 20 mg/kg/gun, 21 gun sureyle her gun intra-muskuler olarak verilmistir).

Inokulasyonun 2. haftasindan sonra ayak tabaninda kizariklik ve sisme gorulebilir (Resim 7). Farelerin lezyonlarinin genisligi ve deriden yuksekligi milimetrik olcum aleti ile haftada bir olculmustur (Resim 8). Olcume 3 ay boyunca devam edilmistir. Inokulasyondan 3 ay sonra hayvanlar sakrifiye edilmis ve ayak tabanlarinda olusan lezyonlardan klinik ornek alinarak NNN besiyerlerine ekim yapilmis, yayma preparat hazirlanip Giemsa ile boyanarak incelenmis ve Leishmania amastigotlarinin varligi arastirilmistir. In vivo ilac etkinligi; ayak olcumleri, yayma preparatlar ve besiyeri ekimlerinin sonuclari ile birlikte degerlendirilmistir (26, 27).

Bu calisma, T.C. Manisa Celal Bayar Universitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu'nun 26.04.2017 tarih ve 18931 sayili karari ile alinan Etik Kurul Onayi ile gerceklestirilmistir.

BULGULAR

Uygulanan in vitro ilac direnc testlerinin 48 saatteki sonuclari asagidaki tablolarda verilmistir (Tablo 1, 2). Yapilan calismalarda ilacsiz kontrol grubundaki promastigotlarin saglikli ve uremelerine devam ettigi gorulurken, meglumin antimonat (Glucantime ([R]), Fransa)'ta 25 [micro]g/mL ve 12,5 [micro]g/mL dozda canli parazitlere rastlandigi ancak sodyum stiboglukonat (Pentostam ([R]), Ingiltere)'ta ise hic canli parazitin gorulmedigi saptanmistir (Tablo 1). Canlilik yuzdelerinin ise meglumin antimonat (Glucantime ([R]), Fransa)'ta 25 [micro]g/mL dozda 10,8 ve 12,5 [micro]g/mL dozda 15,9 oldugu gorulmustur (Tablo 2).

Olusturulan kutanoz leishmaniasis deney hayvani modellerinde yapilan in vivo calismalar sonucunda meglumin antimonat (Glucantime ([R]), Fransa) tedavisi alan ve sodyum stiboglukonat (Pentostam ([R]), Ingiltere) tedavisi alan deney hayvani gruplarinda enfeksiyonun verilmesinden sonraki 5. haftadan sonra ayak tabanindaki lezyonlarin kuculmeye basladigi ve 3 aylik surec sonunda basarili bir sekilde iyilestigi gorulmustur (Sekil 1). Meglumin antimonat (Glucantime ([R]), Fransa) tedavisi alan deney hayvani grubunda ayak tabani capi 3,68 mm'den 1,50 mm'ye, sodyum sti-boglukonat (Pentostam ([R]), Ingiltere) tedavisi alan deney hayvani grubunda ise ayak tabani capi 3,72 mm'den 1,59 mm'ye gerilemistir. Giemsa ile boyali preparatlarda amastigotlar gorulmemistir. Klinik orneklerin ekildigi NNN besiyerlerinde promastigotlara rastlanmamistir. Ilacsiz kontrol grubunda ise lezyon gelisimi devam etmis ve ayak tabani capi milimetrik olcumlere gore duzenli olarak daima artmistir (Tablo 3). Yayma preparatlarda amastigotlar gorulmus ve NNN besiyerinde promastigotlara rastlanmistir.

TARTISMA

Leishmaniasis tedavisinde bes degerlikli antimon bilesikleri olan sodyum stiboglukonat (Pentostam ([R]), Ingiltere) ve meglumin anti-monat (Glucantime ([R]), Fransa) 50 yili askin bir suredir ilk secenek olarak kullanilmaktadir. Son yillarda bu ilaclara karsi tum dunyada ve ozellikle de Hindistan'in kuzeyinde direncin arttigi bildirilmektedir (28).

Tedavide ikinci secenek olan Amfoterisin B de damar yoluyla verilmektedir ve bobrekler uzerine belirgin toksisite gostermektedir. Hindistan'daki visseral leishmaniasis'e etkili oldugu gosterilen yeni ajanlar arasinda yer alan lipozomal Amfoterisin B ise damar yoluyla kullanilmakta, ancak daha az sayida enjeksiyon gerektirmekte ve daha iyi tolere edilmektedir, ancak tedavisi oldukca pahalidir. Diger yeni ajan olan Miltefosin ise oral yolla kullanilmaktadir, ancak teratojen etki gosterebilmektedir (29). Daha etkili ve saglikli ilaclara ihtiyac duyuldugundan leishmaniasis konusunda yeni ilac arastirmalarina gereksinim vardir. Yukaridaki nedenlerden dolayi, bircok makalede leishmaniasis tedavisinde kullanilma potansiyeli olan dogal bitki ekstrelerinin ve bilesenlerinin anti-leishmanial biyolojik aktivite yonunden tarama programlarinin baslamasi gerektigi ve yeni tedavi urunlerinin bulunmasi gerektigi vurgulanmistir (30-32).

Yapilan bir calismada endemik bir bitki olan Haplophyllum myrtifolium' un in vitro ve in vivo antileishmanial etkinligi degerlendirilmistir. Bu calismada bulunan tum ekstraktlarin ve saf bilesiklerin L. tropica'nin promastigotlarina karsi in vitro inhibitor aktivite gosterdigi bulunmustur. Promastigotlara karsi [gamma]-fagarin, asitlendirilmis ekstrat, etanol ekstrat, skimmianin ve alkaloid ekstrak-tin in vitro %50 inhibisyon konsantrasyonlari sirasiyla 8,7, 9,4, 10,9, 25,7 ve 25,8 [my]g/mL olarak bulunmus ve Haplophyllum myrtifolium' un asitlestirilmis ekstratinin in vivo sonuclarinin ise bu bitkinin Leishmania tropica ile enfekte deney farelerinde bulunan lezyon boyutunu azaltmada sinirli bir etkiye sahip oldugunu gosterilmistir (33).

Yapilan baska bir calismada endemik bitkilerden Centaurea calolepis, Phlomis lycia, Eryngium thorifolium, Origanum sipyleum ve Galium incanum ssp. centrale'den elde edilen ekstraktlarin in vitro ve in vivo anti-leishmanial aktiviteleri uzerine bir arastirma yapilmis olup Galium incanum ssp. centrale'nin IC50 degeri 0,0316[+ o -]0,005 ug/mL ile en yuksek sitoksisiteyi gosterdigi, Eryngium thorifolium'un metanol ekstraktinin, 25 [my]g/mL'de %100 inhibisyon ile L. tropica promastigotlari uzerinde en yuksek aktiviteye sahip oldugu, C. calolepis'in su ve kloroform ekstraktlari ile E. thorifolium'un su ve metanol ekstraktlarinin 100 mg/kg'lik bir dozda L. tropica ile enfekte olan farelerdeki parazitemiyi azalttigi saptanmistir. Bu sonuclara bagli olarak parazit canliligi, sitotoksik olmadigi dusunulen Eryngium thorifolium'un metanol ekstraktinin L. tropica enfeksiyonunun tedavisinde umut verici bir aday ilac oldugu kanisina varilmistir (34).

Yapilan bir diger bir calismada ise Leishmania tropica uzerine moksifloksasin ve linezolid ile kaspofunginin, potansiyel antileishmanial etkileri in vitro olarak arastirilmis olup moksifloksasin, linezolid ve kaspofunginin 4096 [micro]g/mL-0,008 [micro]g/mL arasindaki konsantrasyonlarda seri dilusyonlari yapilarak ajanlarin %50 inhibitor konsantrasyonlari (IK50) kontrollerle karsilastirilarak belirlenmistir. Moksifloksasinin, L. tropica promastigotlarina karsi calisilan diger ajanlara gore daha dusuk konsantrasyonlarda etkili oldugu sonucuna ulasilmistir (35).

Son yillarda Leishmania turlerinin bilinen ilaclarin kullanildigi sagaltima direncli suslarinin ortaya cikmaya baslamasi yeni ilaclar ve yeni ilac kombinasyonlarinin arastirilmasina ihtiyac dogurmustur. Dunya Saglik Orgutu ve bircok arastirmaci, oncelikle halkin yoresel tedavide kullandigi bitkilerin arastirilmasi gerektigini vurgulamis, bu sayede dogal bazi bilesiklerin sentetiklerinin de hizla yapilip leishmaniasis'e karsi kullanilabilecegini belirtmislerdir (36-38).

Yapilan bircok calismada, degisik bitkilerden elde edilen yeni etken madde taramalarinda ve yeni ilac calismalarinda meglumin antimonat (Glucantime ([R]), Fransa) ve sodyum stiboglukonat (Pentostam[R], Ingiltere) kontrol ilaci (pozitif kontrol) olarak kullanilip etken maddenin veya ilacin etkinliginin karsilastirilmasinda altin standart olarak baz alinmistir.

In vitro bir calismada MTT testi uygulanarak kalsiyum kanal blokoru olan verapamil ve meglumine antimoniate kombinasyonunun meglumine antimonate'a gore promastigot ve amastigotlar uzerine daha etkili oldugu gosterilmistir (39).

Sodyum stiboglukonat (Pentostam ([R]), Ingiltere)'in in vitro ve in vivo ilac direnci ile ilgili yapilan bir calismada ikisi sodyum stiboglukonat (Pentostam ([R]), Ingiltere) tedavisine yanit vermeyen ve biri bu tedaviye yanit veren 3 olgudan elde edilen klinik izolatlarin enfektivitesi ve kemoterapotik yanitlari in vitro olarak makrofaj-amastigot sisteminde ve in vivo olarak hamsterlerde degerlendirilmistir. Sodyum stiboglukonat (Pentostam[R], Ingiltere) direncinin surekliligi de tekrarli pasajlarla in vivo ve in vitro olarak kontrol edilmistir. Sodyum stiboglukonat (Pentostam ([R]), Ingiltere) tedavisine yanit vermeyen izolatlarin Amfoterisin-B ve Miltefosin tedavisine makrofajlarda ve hamsterlerde yanit verdigi bildirilmistir (40).

Fare modellerinde yapilan bir calismada 100 mg/kg/gun intraperitoneal olarak Glucantime ([R]) ve susam yagi icerisinde hazirlanan thalidomine 30 mg/kg/gun oral olarak 12 gun sureyle tedavi amaciyla verilmis ve bu kombinasyonun hastalik surecinde onemli oranda (uc ay) azalmaya neden oldugu saptanmistir (41). Diger bir calismada enfeksiyonun verilmesinden bir ay sonra 3 fare grubu olusturulmus, birinci gruba sodyum selenit (0,35 mg/kg 30 gun), ikinci gruba cinko sulfat (2 mg/kg 30 gun), ucuncu gruba kontrol amacli distile su (0,01 mL/gr vucut agirligi 30 gun) ve ayni zamanda tum gruplara intra-peritoneal olarak (60 mg/kg) Glucantime ([R]) 14 gun boyunca tedavi amacli verilmistir. Sodyum selenit in vitro calismalarda kutanoz leishmaniasis uzerine etkili olsa da in vivo modelde etkisiz oldugu bulunmustur. Cinko sulfat ise dusuk dozlarda uzun sure kullanildiginda etkisiz oldugu saptanmistir (42). Bir baska calismada lipozomal antimon formulas-yonlarinin (gunde 2 kez 4 hafta sureyle 50 mg topikal olarak) deri icerisindeki makrofajlara ilacin nufus etmesinde basarili oldugu, lipozomlarin meglumin antimonat gibi suda cozunen maddelerin tutulmasini sagladigi, uygun boyutlardaki formulasyonlarin gelistirilmesi ile ilacin etkili bir sekilde dermis ve epidermise ulastigi ve lipozomlarin dusuk toksisiteli guvenli bilesikler oldugu gosterilmistir (43).

Yukaridaki literaturlerde goruldugu uzere tedavide altin standart olarak meglumin antimonat (Glucantime ([R]), Fransa) ve sodyum stiboglukonat (Pentostam ([R]), Ingiltere)'in baz alindigi gorulmustur. Bizim calismamizda da Turkiye'de KL hastasindan elde edilen L. tropica susu uzerine bu iki ilacin da in vitro olarak etkili oldugu gorulmustur. Meglumin antimonat (Glucantime ([R]), Fransa)'ta parazitlerin canlilik yuzdelerinin 25 [micro]g/mL dozda 10,8 ve 12,5 [micro]g/mL dozda 15,9 oldugu gorulurken, sodyum stiboglukonat (Pentostam ([R]), Ingiltere)'ta canli parazite rastlanmamistir. Bu nedenle in vitro calismada sodyum stiboglukonat (Pentostam ([R]), Ingiltere)'in daha etkili oldugu gorulmus fakat istatistiksel olarak anlamli bulunmamistir (p>0,05). In vivo calismada ise her iki ilacin da verilmesinden sonra deney hayvanlarinin ayak tabanindaki lezyonlarin kuculmeye basladigi, meglumin antimonat (Glucantime ([R]), Fransa) tedavisi alan deney hayvani grubunda ayak taban capinin 3,68 mm'den 1,50 mm'ye, sodyum stiboglukonat (Pentostam ([R]), Ingiltere) tedavisi alan deney hayvani grubunda ise 3,72 mm'den 1,59 mm'ye gerilemis oldugu ve 3 aylik surec sonunda basarili bir sekilde iyilestigi gorulmustur. Giemsa ile boyali preparatlarda amastigotlar gorulmemistir. Klinik orneklerin ekildigi NNN besiyerlerinde promastigotlara rastlanmamistir. Bu nedenle iki ilacin da Turkiye'de KL olgusundan izole edilen L. tropica promastigotlari ile olusturulan in vivo modellerde de etkili oldugu saptanmistir.

SONUC

Bu calisma, bu konularda arastirma yapmayi planlayan arastirmacilara rehber olacak sekilde kutanoz leishmaniasisin in vitro ve in vivo modelleri olusturularak ilac arastirmalarinda ve etken madde taramalarinda kullanimlari ayrintilariyla sunularak arastirmacilara yardimci olmasi icin planlanmistir. Aldigimiz sonuclar Turkiye'den elde edilecek izolatlarda bu iki ilacin hem in vitro hem de in vivo calismalarda altin standart olarak basari ile kullanilabilecegi gorulmustur.

Etik Komite Onayi: Bu calisma icin etik komite onayi Manisa Celal Bayar Universitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu'ndan (Tarih: 26.04.2017) alinmistir.

Hakem Degerlendirmesi: Dis bagimsiz.

Yazar Katkilari: Fikir - A.Y., T.K.; Tasarim - A.O., H.E., A.Y.; Denetleme --H.E., I.C.; Veri Toplanmasi ve/veya Islemesi - A.O.; Analiz ve/veya Yorum --A.O., H.E., I.C.; Literatur Taramasi--A.Y., I.C., T.K.; Yaziyi Yazan--A.Y., T.K., A.O.; Elestirel Inceleme--A.O., H.E.

Tesekkur: Manisa Celal Bayar Universitesi Tip Fakultesi Parazit Bankasi'na ve Air Liquide sirketine sagladiklari katkilarindan dolayi tesekkur ederiz.

Cikar Catismasi: Yazarlar cikar catismasi bildirmemislerdir.

Finansal Destek: Yazarlar bu calisma icin finansal destek almadiklarini beyan etmislerdir.

Ethics Committee Approval: Ethics committee approval was received for this study from the ethics committee of Manisa Celal Bayar University (Date: 26.04.2017).

Peer-review: Externally peer-reviewed.

Author Contributions: Concept--A.Y., T.K.; Design--A.O., H.E., A.Y.; Supervision--H.E., I.C.; Data Collection and/or Processing--A.O.; Analysis and/or Interpretation--A.O., H.E., I.C.; Literature Search--A.Y., I.C., T.K.; Writing Manuscript--A.Y., T.K., A.O.; Critical Review--A.O., H.E.

Acknowledgements: We would like to thank Parasite Bank of Medical School of Manisa Celal Bayar University and Air Liquide Company for all their support.

Conflict of Interest: No conflict of interest was declared by the authors.

Financial Disclosure: The authors declared that this study has received no financial support.

KAYNAKLAR

(1.) WHO Technical Report Series-949. Report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases, Geneva, 22-26 March 2010.

(2.) Desjeux P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comp Immunol Microb 2004; 27: 305-18. [CrossRef]

(3.) Alvar J, Canavate C, Gutierrez-Solar B, Jimenez M, Laguna F, Lopez-Velez R, et al. Leishmania and human immunodeficiency virus co-infection: the first 10 years. Clin Microbiol Rev 1997; 10: 298-319.

(4.) WHO Web Sayfasi. Available from: http://www.who.int/tdr/disea-ses /leish/default.

(5.) Ozbel Y, Ozensoy Toz S. Leishmaniosis. Ozcel MA, Ozbel Y, Ak M, editorler. Tibbi Parazit Hastaliklari. Izmir: Turkiye Parazitoloji Dernegi; 2007. s. 197-241.

(6.) Bayram Delibas S, Akisu C. Diger Kan ve Doku Protozoon Hastaliklarinin Tedavisi. Akisu C, Korkmaz M, editorler. Tibbi Parazitolojide Tedavi. Izmir: Turkiye Parazitoloji Dernegi Yayin No: 20; 2005. s. 87-110.

(7.) Ozensoy Toz S. Pentavalan antimoniyaller. Akisu C, Korkmaz M, editorler. Tibbi Parazitolojide Tedavi. Izmir: Turkiye Parazitoloji Dernegi Yayin No: 20; 2005. s. 209-18.

(8.) Jackson JE, Tally JD, Ellis WY, Mebrahtu YB, Lawyer PG, Were JB, et al. Quantitative in vitro drug potency and drug susceptibility evaluation of Leishmania ssp. From patients unresponsive to pentavalent antimony therapy. Am J Trop Med Hyg 1990, 43: 464-80.

(9.) Rojas R, Valderrama L, Valderrama M, Varona MX, Ouellette M, Saravia NG. Resistance to antimony and treatment failure in human Leishmania (viannia) infection. J Infect Dis 2006; 193: 1375-83. [CrossRef]

(10.) Yardley V, Ortuno N, Llanos-Cuentas A, Chappuis F, Doncker SD, Ramirez L, et al. American tegumentary leishmaniasis: is antimonial treatment outcome related to parasite drug susceptibility? J Infect Dis 2006; 194: 1168-75.

(11.) Carrio J, Riera C, Gallego M, Ribera E, Portus M. In vitro susceptibility of Leishmania infantum to meglumine antimoniate in isolates from repeated leishmaniasis episodes in HIVcoinfected patients. J Antimicrob Chemother 2001; 47: 120-1. [CrossRef]

(12.) Faraut-Gambarelli F, Piarroux R, Deniau M, Giusiano B, Marty P, Michael G, et al. In vitro and in vivo resistance of Leishmania infan-tum to meglumine antimoniate: a study of 37 strains collected from patients with visceral leishmaniasis. Antimicrob Agents Chemother 1997, 41: 827-30.

(13.) Hadighi R, Mohebali M, Boucher P, Hajjaran H, Khamesipour A, Ouellette M. Unresponsiveness to Glukantim treatment in Iranian cutaneous leishmaniasis due to drug-resistant Leishmania tropica parasites. PLoS Med 2006; 3: e162.

(14.) Hadighi R, Boucher P, Khamesipour A, Meamar AR, Roy G, Ouellette M, et al. Glukantim-resistant Leishmania tropica isolated from Iranian patients with cutaneous leishmaniasis are sensitive to alternative antileishmania drugs. Parasitol Res 2007; 101: 1319-22. [CrossRef]

(15.) Das VN, Ranjan A, Bimal S, Siddique NA, Pandey K, Kumar N, et al. Magnitude of unresponsiveness to sodium stibogluconate in the treatment of visceral leishmaniasis in Bihar. Natl Med J India 2005; 18: 131-3.

(16.) Lira R, Sundar S, Makharia A, Kenney R, Gam A, Saraiva E, et al. Evidence that the high incidence of treatment failures in Indian kala-azar is due to the emergence of antimony-resistant strains of Leishmania donovani. J Infect Dis 1999; 180: 564-7. [CrossRef]

(17.) Sundar S, More DK, Singh MK, Singh VP, Sharma S, Makharia A, et al. Failure of pentavalent antimonyvin visceral leishmaniasis in India: report from the Center of the Indian Epidemic. Clin Infect Dis 2000; 31: 1104-7. [CrossRef]

(18.) Thakur CP, Narayan S, Ranjan A. Epidemiological, clinical pharmacological study of antimony-resistant visceral leishmaniasis in Bihar, India. Indian J Med Res 2004; 120: 166-72.

(19.) Olliaro PL, Guerin PJ, Gerstl S, Haaskjold AA, Rottingen JA, Sundar S. Treatment options for visceral leishmaniasis: a systematic review of clinical studies done in India, 1980-2004. Lancet Infect Dis 2005; 5: 763-74. [CrossRef]

(20.) Croft SL, Sundar S, Fairlamb AH. Drug resistance in leishmaniasis. Clin Microbiol Rev 2006; 19: 111-26. [CrossRef]

(21.) Kayaalp OS. Klinik oncesi degerlendirmesi. Klinik Farmakolojinin Esaslari ve Temel Duzenlemeler. 4.Baski. Ankara: Faryal Matbaacilik; 2008. s. 29-46.

(22.) Ozbilgin A, Durmuskahya C, Kayalar H, Ertabaklar H, Gunduz C, Ostan Ural I, et al. Antileishmanial Activity of Selected Turkish Medicinal. Tropical Journal of Pharmaceutical Research 2014; 13: 1319-26.

(23.) El Tai NO, Osman OF, El Fari M, Presber W, Schonian G. Genetic heterogeneity of ribosomal internal transcribed spacer in clinical samples of L. donovani spotted on filter paper as revealed by single-strand conformation polymorphisms and sequencing. Trans R Soc Trop Med Hyg 2000; 94: 575-9. [CrossRef]

(24.) Toz SO, Culha G, Zeyrek FY, Ertabaklar H, Alkan MZ, Vardarli AT, et al. A real-time ITS1-PCR based method in the diagnosis and species identification of Leishmania parasite from human and dog clinical samples in Turkey. PLoS Negl Trop Dis 2013; 7: e2205.

(25.) Williams C, Espinosa O, Montenegro H, Cubilla L, Capson TL, Ortega-Barria E, et al. Hydrosoluble formazan XTT: its application to natural products drug discovery for Leishmania. J Microbiol Methods 2003; 55: 813-6. [CrossRef]

(26.) Yardley V, Croft SL. Animal Models of Cutaneous Leishmaniasis, Handbook of Animal Models of Infection. Zak O, Sande AM, editors. Newyork: Acedemic Pres; 1999. s. 775-81.

(27.) Girginkardesler N, Balcioglu C, Yereli K, Ozbilgin A, Ozbel Y. Cutaneous leishmaniasis infection in Balb/c mice using a Leishmania tropica strain isolated fromTurkey. J Parasitol 2001; 87: 1177-8. [CrossRef]

(28.) Croft SL, Yardley V. Chemotherapy of leishmaniasis. Curr Pharm Des 2002; 8: 319-42.[CrossRef]

(29.) Berman J. Current treatment approaches to leishmaniasis. Curr Opin Infect Dis 2003; 16: 397-401. [CrossRef]

(30.) Ostan I, Saglam H, Limoncu ME, Ertabaklar H, Ozensoy Toz S, Ozbel Y, et al. In vitro and in vivo activities of Haplophyllum myrtifolium against Leishmania tropica. New Microbiologica 2007; 30: 439-45.

(31.) Ozbilgin A, Durmuskahya C, Kayalar H, Ertabaklar H, Gunduz C, Ostan Ural I, et al. Antileishmanial Activity of Selected Turkish Medicinal Plants. Tropical Journal of Pharmaceutical Research 2014; 13: 1319-26.

(32.) Limoncu ME, Erac B, Gurpinar T, Ozbilgin A, Balcioglu IC, Hosgor-Limoncu M. Investigation of in vitro Antileishmanial Activity of Moxifloxacin, Linezolid and Caspofungin on Leishmania tropica Promastigotes. Turkiye Parazitol Derg 2013; 37: 1-3. [CrossRef]

(33.) Carvalho PB, Ferreira EI. Leishmaniasis phytotherapy. Nature's leadership against an ancient disease-review. Fitoterapia 2001; 72: 599-618. [CrossRef]

(34.) Kayser O, Kiderlen AF. In vitro leishmanicidal activity of naturally occurring chalcones. Phytother Res 2001; 15: 148-52. [CrossRef]

(35.) Rocha LG, Almeida JR, Macedo RO, Barbosa-Filho JM. A review of natural products with antileishmanial activity. Phytomedicine 2005; 12: 514-35.

(36.) Bhadra R. Antileishmanial agents. Drugs Future 1993; 18: 451-63.

(37.) Weniger B, Robledo S, Arango GJ, Deharo E, Aragon R, Munoz V, et al. Antiprotozoal activities of Colombian plants. J Ethnopharmacol 2001; 78: 193-200. [CrossRef]

(38.) Carvalho PB, Arribas MAG, Ferreira EI. Leishmaniasis. What do we know about its chemotherapy? Rev Bras Ci Farm 2000; 36: 69-96.

(39.) Shokri A, Sharifi I, Khamesipour A, Nakhaee N, Fasihi Harandi M, Nosratabadi J, et al. The effect of verapamil on in vitro susceptibility of promastigote and amastigote stages of Leishmania tropica to meglumine antimoniate. Parasitol Res 2012; 110: 1113-7. [CrossRef]

(40.) Dube A, Singh N, Sundar S, Singh N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitol Res 2005; 96: 216-23. [CrossRef]

(41.) Solgi G, Kariminia A, Abdi K, Darabi M, Ghareghozloo B. Effects of combined therapy with thalidomide and glucantime on leishmaniasis induced by Leishmania major in BALB/c mice. Korean J Parasitol 2006; 44: 55-61. [CrossRef]

(42.) Zamani Sorkhroodi F, Alavi Naeini AM, Zahraei Ramazani AR, Aghaye Ghazvini MR, Mohebali M, Keshavarz SA. Therapeutic Effect of Sodium Selenite and Zinc Sulphate as Supplementary with Meglumine Antimoniate (Glucantime ([R])) Against Cutaneous Leishmaniasis In BALB/C Mice. Iranian J Parasitol 2010; 5: 11-9.

(43.) Kalat SA, Khamesipour A, Bavarsad N, Fallah M, Khashayarmanesh Z, Feizi E, et al. Use of topical liposomes containing meglumine antimoniate (Glucantime) for the treatment of L. major lesion in BALB/c mice. Exp Parasitol 2014; 143: 5-10.

Ahmet Ozbilgin (1) [iD] Ibrahim Cavus (1) [iD] Ahmet Yildirim (1) [iD] Tugba Kaya (1) [iD] Hatice Ertabaklar (2) [iD]

(1) Celal Bayar Universitesi Tip Fakultesi, Parazitoloji Anabilim Dali, Manisa, Turkiye

(2) Adnan Menderes Universitesi Tip Fakultesi, Parazitoloji Anabilim Dali, Aydin, Turkiye

Cite this article as: Ozbilgin A, Cavus I, Yildirim A, Kaya T, Ertabaklar H. Evaluation of In vitro and In vivo Drug Efficacy Over Leishmania tropica: A Pilot Study. Turkiye Parazitol Derg 2018; 42:11-9.

Yazisma Adresi / Address for Correspondence: Ahmet Yildirim E.posta: ahmetyildirim.par@yahoo.com

Gelis Tarihi: 15.09.2017 Kabul Tarihi: 05.01.2018

Received: 15.09.2017 Accepted: 05.01.2018

DOI: 10.5152/tpd.2018.5554
Tablo 1. Isik mikroskobunda hemositometre yontemine gore 48 saatteki
parazit sayisi ([10.sup.6]/mL)

                             Doz ([micro]g/mL)
Izolatlar            300     200     100      50      25   12,5

Ilacsiz kontrol    81,00   81,00   79,00   81,00   80,00  82,00
Glucantime ([R])    0,00    0,00    0,00    0,00    8,00  10,00
Pentostam ([R])     0,00    0,00    0,00    0,00    0,00   0,00

Tablo 2. XTT yontemi ile 48 saatteki parazitlerin canlilik yuzdeleri
([10.sup.6]/mL)

                                 Doz ([micro]g/mL)
Izolatlar          300   200   100    50     25    12,5

Ilacsiz kontrol    100   100   100   100    100    100
Glucantime ([R])     0     0     0     0     10,8   15,9
Pentostam ([R])      0     0     0     0      0      0

Tablo 3. Deney hayvani gruplarinda haftalik milimetrik ayak tabani
olcumlerinin ortalamalari

                                            Haftalar
Kod                    1      2      3      4      5      6      7

Kontrol (Ilacsiz)      1,42   2,15   2,95   3,15   3,78   4,00   4,37
Meglumin antimonat     1,45   2,18   2,91   3,13   3,68   3,48   3,28
(Glucantime ([R]))
Sodyum stiboglukonat   1,43   2,13   2,90   3,10   3,72   3,55   3,35
(Pentostam ([R]))

                                Haftalar
Kod                    8      9      10     11     12

Kontrol (Ilacsiz)      4,53   4,85   5,15   5,85   6,33
Meglumin antimonat     3,00   2,85   2,25   1,68   1,50
(Glucantime ([R]))
Sodyum stiboglukonat   3,10   2,94   2,39   1,79   1,59
(Pentostam ([R]))
COPYRIGHT 2018 AVES
No portion of this article can be reproduced without the express written permission from the copyright holder.
Copyright 2018 Gale, Cengage Learning. All rights reserved.

Article Details
Printer friendly Cite/link Email Feedback
Title Annotation:Ozgun Arastirma / Original Investigation
Author:Ozbilgin, Ahmet; Cavus, Ibrahim; Yildirim, Ahmet; Kaya, Tugba; Ertabaklar, Hatice
Publication:Turkish Journal of Parasitology
Date:Mar 1, 2018
Words:5643
Previous Article:Use of Internal Transcribed Spacer Sequence Polymorphisms as a Method for Trichomonas vaginalis Genotyping/Internal Transcribed Spacer (ITS) Sekans...
Next Article:Mehmet Akif Inan Egitim ve Arastirma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarinda Ekim 2015-Ekim 2016 Tarihleri Arasinda Incelenen Diski Orneklerindeki...
Topics:

Terms of use | Privacy policy | Copyright © 2021 Farlex, Inc. | Feedback | For webmasters |