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Las proteinas del plasma seminal incrementan la viabilidad espermatica post-descongelacion del semen de toros Sanmartinero.

Seminal plasma proteins increase the post-thaw sperm viability of Sanmartinero bull's semen

INTRODUCCION

El plasma seminal (PS) es una mezcla de secreciones de diferentes partes del aparato reproductor masculino. Componentes del PS como carbohidratos, lipidos, proteinas y minerales, influyen en la capacidad fecundante de los espermatozoides (spz). El estudio de las funciones de las proteinas del PS, ha permitido su uso en el proceso de criopreservacion, con el fin de incrementar la viabilidad espermatica post-descongelacion (1,2).

Durante la criopreservacion, la distribucion de fosfolipidos y proteinas en la membrana plasmatica se altera y provoca una capacitacion prematura del spz, disminuyendo su viabilidad. Los estudios revelan que los cambios de temperatura afectan la integridad de las celulas en niveles estructurales por la rotura mecanica de la membrana y por la redistribucion de los fosfolipidos en la misma (3,4).

Estos danos se han intentado disminuir mediante el uso de diferentes crio-protectores. El mas empleado ha sido la yema de huevo por su contenido de lipoproteinas de baja densidad (LDL), la cual es la responsable del efecto crioprotector (5,6). Sin embargo, el uso de yema de huevo puede incrementar el riesgo de contaminacion microbiana y reducir la capacidad fecundante de los spz. En vista de lo anterior, se ha propuesto el uso de diluyentes que no contengan yema de huevo, como el caso de aquellos a base de lecitina de soya. El uso de estos diluyentes ha evidenciado incrementos importantes en la viabilidad post-descongelacion en semen bovino (7,8).

Se ha descrito un grupo de proteinas acidas del PS de bajo peso molecular (13-16 kDa), las cuales se adsorben a la membrana plasmatica del spz y desempenan un papel crucial en la regulacion de la capacitacion (9,10). Estas proteinas, son secretadas por las vesiculas seminales (11-13), y se han empleado para proteger al spz contra el estres termico y oxidativo (14,15). Igualmente, se ha demostrado que la incubacion de spz in vitro con proteinas de PS, puede contrarrestar los danos ocasionados a las celulas espermaticas sometidas a choques termicos (1,13).

Perez-pe et al en 2000 (14), y Colas et al en 2009 (15), demostraron que una fraccion de proteinas de bajo peso molecular del PS ovino, podia restaurar la estructura de la membrana de forma cercana a las celulas intactas en spz sometidos a choque termico por frio.

Segun lo anterior, es posible que el uso de aditivos basados en proteinas del PS, logre revertir parcialmente los danos causados por los procesos de criopreservacion en spz de toros. El objetivo del presente estudio fue estimar el efecto de la incubacion de spz de toros Sanmartinero, con proteinas de bajo peso molecular del PS, aisladas por cromatografia de exclusion, sobre el porcentaje de spz viables post-descongelacion.

MATERIALES Y METODOS

Sitio de estudio y unidades experimentales. Esta investigacion se realizo con semen congelado de 10 toros de la raza criolla Sanmartinero, usando 3 pajillas de cada toro. Los animales, de entre 3 y 4 anos de edad, permanecieron en el centro de investigacion La Libertad de CORPOICA en condiciones adecuadas de salud, bajo pastoreo en praderas de Brachiaria decumbens.

El semen se colecto por electroeyaculacion y se determinaron los parametros convencionales de calidad seminal: viabilidad (integridad de la membrana), motilidad y concentracion espermatica al momento de la eyaculacion. Esta ultima se determino con un Spermacue Minitube[R]. La viabilidad espermatica se determino mediante recuento de spz con tincion diferencial Carboxifluoresceina-ioduro de propidio (16), para lo cual la muestra de semen descongelado se diluyo en mHTF (1:35), posteriormente se le adiciono 5[micron]l de diacetato de carboxifluoresceina (10 [micron]M en agua destilada), 5[micron]l de ioduro de propidio (7.3 [micron]M en DMSO) y 5[micron]l de formaldehido 1.7 mM, para inmovilizar las celulas con objeto de lograr una mejor observacion. La muestra se incubo a 37 [grados]C durante 15 minutos, al cabo de los cuales se colocaron 8 [micron]l de la muestra sobre una lamina portaobjeto. Se contaron 200 celulas por alicuota con un objetivo 40x en un microscopio con iluminacion epifluorescente, la viabilidad se determino como se menciono anteriormente en la cual los spz con membrana integra toman un color verde y los que presentan dano, un color rojo. La motilidad individual se determino por analisis visual de una alicuota de 8 [micron]l bajo un microscopio optico con objetivo de 40x, teniendo en cuenta solo los spz con movimiento progresivo en varios campos opticos.

Criopreservacion del semen. La criopreservacion se realizo con dos diluyentes diferentes: Citrato-fructosa con yema de huevo (CFY) y un medio comercial para congelacion (Bioxcell[R], IMV Francia). El medio de criopreservacion CFY se preparo usando citrato de sodio 29 g/L, fructosa 12.5 g/L, penicilina 100 UI/ml, 1 mg de estreptomicina y yema de huevo 20% (fraccion A del diluyente), mientras la fraccion B se preparo con 86% de la fraccion A y 14% de glicerol.

La disminucion de la temperatura de la muestra seminal en el medio crioprotector se hizo de forma progresiva de 37 a 5[grados]C a razon de 0.5[grados]C por minuto aproximadamente. Alcanzada la temperatura de 5[grados]C, se adiciono la fraccion B (en la misma cantidad de la mezcla entre la fraccion A y semen), y se mantuvo el semen a esta temperatura durante 4-6 horas. La congelacion con el medio comercial Bioxcell[R] se realizo de la misma forma que con el medio citrato-fructosa, reemplazando las fracciones A y B por las 1 y 2 del Bioxcell[R]. El semen se llevo a una concentracion de 70 x [10.sup.6] spz por ml, se empaco en pajillas de 0.5 ml, las cuales se sellaron por ultrasonido y se llevaron a vapores de nitrogeno liquido durante 10 min hasta alcanzar -120[grados]C. Posteriormente el semen se introdujo en nitrogeno liquido para alcanzar una temperatura de -196[grados]C. Solo se usaron las pajillas con motilidad individual progresiva postdescongelacion [mayor que o igual a]40 %, despues de 48 horas.

Coleccion de PS y cuantificacion de proteinas. El PS se obtuvo por centrifugacion del semen a 10.500 x g durante 5 min a 4[grados]C dos veces sucesivas. El sobrenadante obtenido se filtro mediante una membrana Millipore 6 V de 0.22 urn. Al filtrado se le adiciono fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) 5 [micron]M (1.0 ul por cada ml de PS) disuelto en dimetilsulfoxido (DMSO), como agente inhibidor de serinoproteasas y se guardo a -20[grados]C hasta su uso. Posteriormente se realizo la cuantificacion de proteinas de las muestras de PS mediante espectrofotometria [A.sub.280]. Se uso el coeficiente de absortividad molar ([[epsilon].sup.1%]=6.67 [M.sup.-1][cm.sup.-1]) de la albumina serica bovina BSA.

Separacion de fracciones proteicas por cromatografia de exclusion por tamano. Las proteinas del PS fueron separadas por cromatografia de exclusion, en el Laboratorio del Grupo de Investigacion en Quimica de la Facultad de Ciencias Basicas, de la Universidad de Pamplona. Para esta separacion se utilizo el cromatografo BioLogic de Bio-rad y una columna de 1 x 120 cm, con 79 ml de Sephacryl S-200 HR (Amersham Biosciences) como fase estacionaria, que se lavo previamente con 100 ml de NaOH 0.1 M y 2 litros de agua destilada. La matriz se equilibro con tampon fosfato 0.05 M, pH 8.0 a una velocidad de 0.25 ml/min. Se aplico 1 ml de PS (170 mg de proteina), posteriormente se eluyo con 200 ml de la misma solucion tampon y a la misma velocidad que la de equilibrio, y se recogieron fracciones de 4 ml por tubo. En cada tubo se determino la concentracion de proteinas espectrofotometricamente a [A.sub.280] nm, empleando el coeficiente de absorcion molar de 0.667. Los picos obtenidos fueron colectados y concentrados a traves de una celda de ultrafiltracion Amicon (Millipore). Una vez concentrados, se filtraron de nuevo en microfiltros de 3 kDa para eliminar las sales y se sometieron a liofilizacion durante 24 horas, luego de las cuales se almacenaron a -20[grados]C hasta su uso.

Electroforesis unidimensional (SDS-PAGE).

Las fracciones de proteinas obtenidas por cromatografia, se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), de acuerdo con el metodo de Laemmli (17). Los geles se elaboraron a una concentracion de poliacrilamida del 15%; Se utilizaron 5 ug de proteina de las fracciones 21-25, y se diluyeron 1:1 (v/v) con la solucion tampon de muestra (20% Glicerol, 2% SDS, 0.5 M Tris-HCl pH 6.8, 10% [beta]-mercaptoetanol, y 0.05% de azul de bromofenol). Las muestras se desnaturalizaron incubando 5 minutos a 100[grados]C y la electroforesis se realizo a 250 V, 0.04 [OMEGA]. . Las bandas se visualizaron por tincion con Azul brillante de Comassie.

Electroforesis bidimensional (2D PAGE). Las fracciones (21-25) con proteinas del PS de bajo peso molecular, se sometieron a electroforesis bidimensional. La separacion electroforetica se llevo a cabo primero por puntos isoelectricos, en una camara de isoelectroenfoque IEF protean de Bio Rad, utilizando tiras de poliacrilamida en gradientes de pH inmovilizado (IPGs) de 8 cm de largo, y un rango de pH de 4 a 7. Las tiras se hidrataron de forma pasiva (toda la noche) para lo cual se adicionaron 100 ug de proteina total a una solucion tampon compuesta por Urea 8M, CHAPS 4% p/v, Ditiotreitol (DTT) 50 mM y anfolitos 2% v/v, al que se adiciono 2 [micron]l de tributilfosfina (TBP) y 0.75 [micron]l de anfolitos en el momento de colocar la tira.

Las tiras enfocadas se sometieron a equilibrio en dos pasos, cada uno de 15 min. En el primer paso se sumergieron en un tampon con urea 6 M, Tris 0.375 M, pH 8.8, SDS 2%, glicerol 20%, DTT 2% (w/v), y en el segundo paso se sumergieron en un tampon que difiere del primero en la sustitucion de DTT por Iodoacetamida 2.5% (w/v).

La segunda dimension se realizo en minigeles de poliacrilamida en gradiente de concentracion lineal de 10% a 20%. Las tiras se fijaron a los geles mediante agarosa al 1% y azul de bromofenol a 2%. La separacion por peso molecular se realizo en una camara de electroforesis Miniprotean cell de Bio Rad[R] a 85 voltios durante 180 min. La visualizacion de los puntos de proteina se efectuo de la misma manera que los geles en una dimension.

Documentacion de los geles y analisis de imagenes. Todos los geles se digitalizaron en un documentador Gel Doc XR (Bio Rad[R]). El analisis de las imagenes de los geles en una dimension se realizo con el programa Quantity One (Bio Rad[R]) y los geles en dos dimensiones con el programa PD Quest (Bio Rad[R]).

Adicion de las proteinas separadas por cromatografia al semen descongelado. Para evaluar el efecto de la adicion de proteinas de bajo peso molecular, en el porcentaje de spz viables post-descongelacion, de cada pajilla se separaron alicuotas de un millon de spz y se asignaron a uno de los siguientes tratamientos: T1 (control negativo sin adicion de proteinas), T2 (1.0 mg de proteinas totales del PS, control positivo) y las siguientes con distintas cantidades del concentrado de proteinas obtenido de las fracciones 21-25 resuspendidas en Human Tubular Fluid medium (mHTF): T3 (0.5 mg), T4 (1.0 mg), T5 (1.5 mg), T6 (2.0 mg). Todas las muestras se incubaron a 37 [grados]C durante 1 hora. Finalizada la incubacion, se determino la viabilidad espermatica mediante el metodo del ioduro de propidio-diacetato de carboxifluoresceina (16). El incremento porcentual en la viabilidad espermatica por efecto de la incubacion con proteinas, se determino con respecto al control negativo.

El efecto de la adicion de proteinas del PS en la reversion del dano de la membrana espermatica, se estimo por la formula desarrollada por Barrios et al (1):

% reversion = (Vp60 - Vc60)/ (Vw - Vc60) x 100

Donde:

[V.sub.w] = viabilidad de la muestra fresca antes de la congelacion

[V.sub.c60] = viabilidad de la muestra control al cabo de una hora

[Vp.sub.60] = viabilidad de la muestra con proteinas al cabo de una hora

Este porcentaje representa la relacion entre las celulas con viabilidad recuperada y las teoricamente recuperables.

Analisis estadistico. Se empleo un diseno completamente al azar con arreglo factorial (4x2) para el analisis de los datos, de acuerdo con el siguiente modelo:

[Y.sub.j] = [micron] + [[alfa].sub.i] + [[beta].sub.j] + ([[alfa].sub.i [beta]j)+ [E.sub.ij]

Donde:

[Y.sub.ij] = Porcentaje de recuperacion de la viabilidad en las pajillas descongeladas

[micron] = Media total

[[alfa].sub.i:] = Efecto de la dosis de fraccion 21-25 obtenida por exclusion

[[beta].sub.j] = Efecto del medio de criopreservacion

([alfa]i [[Beta].sub.j]) = Efecto de la interaccion

[E.sub.ij] = Error experimental

Adicionalmente se realizo un analisis de varianza para determinar el efecto de los tratamientos y una prueba de comparacion LS MEANS para evaluar las diferencias en el porcentaje de reversion del dano ocasionado por la criopreservacion en la membrana espermatica.

RESULTADOS

Separacion parcial de las proteinas del plasma seminal por cromatografia de exclusion y electroforesis Uni-Bidimensional En el cromatograma de exclusion (Figura 1), se visualizan 2 picos, el primero constituido por el contenido de los tubos 10 al 20 (que se denominaran fracciones) y el segundo de los tubos 21 al 25. Se valoraron midiendo la concentracion de proteinas a una longitud de onda de 280 nm, utilizando un coeficiente de absorcion de 6.67 [M.sup.-1]/[cm.sup.-1].

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

El contenido proteico de cada uno de los tubos que se encuentran en estos picos se analizo electroforeticamente por medio de SDS-PAGE al 15% (Figura 2), para identificar las bandas de proteinas contenidas en cada fraccion. Desde la fraccion F10 hasta la F25, se identificaron proteinas de pesos moleculares, entre 12 y 72 kDa. El concentrado de las fracciones 21-25 fue identificado como la fraccion donde se encuentran las proteinas de bajo peso molecular (entre 14 y 16 kDa) (Figura 2).

Este concentrado de proteinas se sometio a electroforesis bidimensional en rango de pH de 4 a 7. Se evidencio la presencia de 2 puntos en la banda de 14 y 5 puntos en la de 16 kDa (Figura 3) lo que podria indicar que ambas bandas comprenden proteinas con diferencias post-traduccionales, como ya se ha descrito en ovino (13,18)

[FIGURA 3 OMITIR]

Efecto de la incubacion de los espermatozoides con la fraccion 21 a 25 obtenida por cromatografia de exclusion. La adicion de la fraccion 21-25, evidencio efectos que difieren de acuerdo con la dosis y al medio de criopreservacion empleados. El porcentaje de spz viables postincubacion, en el tratamiento control sin proteinas adicionadas fue de 39.8[+ or -]8.2%, a partir del cual se calculo el incremento en viabilidad en los demas tratamientos. El mayor porcentaje de incremento en la viabilidad post-incubacion fue 22.0[+ or -]6.5% (p<0.05) y se consiguio con dosis de 1.0 y 1.5 mg mg/106 spz, de la fraccion proteica en estudio, cuando los espermatozoides se criopreservaron con medio CFY (Figura 4).

[FIGURA 4 OMITIR]

Por otra parte, el incremento en el porcentaje de spz viables post incubacion fue mayor (25.2[+ or -]5.3% p<0.05) a una dosis de 0.5 mg/106 spz., cuando los spz se criopreservaron en el medio comercial Bioxcell(r). Sin embargo, cuando se utilizaron dosis superiores a 0.5 mg/106 spz (entre 1.0 y 2.0 mg/106 spz) se evidencio una disminucion significativa (p<0.05) de la viabilidad espermatica postincubacion (Figura 4).

La viabilidad espermatica de las muestras frescas, medida a traves de la tincion carboxifluoresceinaioduro de propidio, fue en promedio de 70.7[+ or -]6.1%, superior a la viabilidad postdescongelacion promedio de todas las pajillas la cual fue de 28.0[+ or -]5.2% (Tabla 1).

Cuando los valores de incremento porcentual de la viabilidad espermatica, se incluyeron en la formula propuesta por Barrios et al (1) para estimar el % de recuperacion de la viabilidad de los espermatozoides, se evidencio que el unico tratamiento que tuvo un claro efecto de reversion del dano por criopreservacion es aquel que empleo una dosis de 0.5 mg/106 spz (15.23%, p<0.05), en espermatozoides congelados con el medio comercial Bioxcell(r) (Figura 5).

[FIGURA 5 OMITIR]

DISCUSION

El analisis electroforetico unidimensional evidencio dos bandas de 14 y 16 kDa, que se encuentran en las fracciones 21 a 25. La cantidad relativa de cada banda (entre 26 y 22%) y su aparicion en todas las fracciones, demostrada en la electroforesis unidimensional, indico que estas proteinas son las mas abundantes dentro del PS. En este sentido se ha evidenciado que las proteinas BSP, son las mas abundantes en el PS bovino (2,19,22,23). La concentracion de estas proteinas en el PS esta entre 20 y 40 mg/ml, lo que corresponde a una concentracion de entre el 30 y el 60% de las proteinas totales del PS.

La banda de 14 kDa coincide con el peso molecular de las proteinas PDC 109 y aunque dicha banda puede contener mas proteinas de peso molecular igual o cercano, es muy posible que el concentrado de fracciones 21 a 25 obtenido en la presente investigacion, contenga cierta cantidad de estas proteinas. El analisis electroforetico bidimensional evidencio la presencia de varios puntos, dentro de los cuales podrian estar las proteinas PDC-109; sin embargo es necesario llevar a cabo mas estudios encaminados a la identificacion de estos puntos.

Por otro lado, Barrios et al (1) lograron separar fracciones similares a partir de PS ovino. En las fracciones que separaron se encontraron dos bandas de proteina de 14 y 20 kDa en lo que denominaron fraccion 6. Estas dos bandas representaron cerca del 70% de las proteinas totales del PS ovino. La fraccion 6 se selecciono para ser usada en pruebas de reversion de dano en membrana de spz sometidos a choque termico por bajas temperaturas.

La adicion de la fraccion cromatografica 21-25 evidencio que existe un aumento en la viabilidad post incubacion de alrededor del 20% cuando se usa entre 1 y 1.5 mg de la fraccion proteica por cada millon de spz descongelados. Esta dosis es adecuada cuando se usa un crioprotector con yema de huevo. Ademas, se observo un aumento similar con una dosis menor de proteina de las fracciones 21-25 (0.5 mg/millon de spz) cuando se usa medio comercial Bioxcell(r) en la congelacion. Esto ultimo sugiere la posibilidad de que el medio comercial contenga algun componente que pueda tener interaccion con las proteinas contenidas en las fracciones 21-25.

Por otro lado, el tratamiento con el conjunto de proteinas del PS, evidencio un efecto contrario, disminuyendo la viabilidad del semen luego de ser incubado con ellas. Asimismo se ha demostrado que el PS completo en exceso tiene un efecto nocivo para la viabilidad espermatica (22). Por su parte, Barrios et al (1), describio, en ovinos, que la adicion del conjunto de proteinas de PS, aunque no disminuye la viabilidad despues de someter los spz a choque termico por frio, tiene un efecto de recuperacion de la viabilidad menor que el ejercido por la adicion de la fraccion 6 (con proteinas de 14 y 20 kDa), y que la adicion de fracciones de PS, que contienen proteinas con pesos moleculares superiores a 60 kDa, no tiene mayor efecto en la recuperacion de la viabilidad del semen ovino.

Los resultados de la presente investigacion sugieren la posibilidad de que sean las proteinas de bajo peso molecular presentes en la fraccion 21-25 del PS, las que intervienen en la recuperacion de la membrana del spz bovino sometido a criopreservacion.

Cuando en el analisis de los datos se tiene en cuenta el descenso de la viabilidad desde el momento de la recogida de la muestra, se logra apreciar una recuperacion de la viabilidad espermatica post incubacion de alrededor de 15%, con una dosis de 0.5 mg de la fraccion 21-25 por millon de spz, previamente congelados en medio Bioxcell[R]. Dosis mas altas parecen no tener mayor efecto, e incluso algunas son nocivas para la viabilidad post incubacion.

El trabajo reportado por Barrios et al (1) para semen ovino, indica que la dosis minima para obtener un efecto de reversion significativo (p<0.05), corresponde a 0.5 mg/106 spz de la denominada "Fraccion 6". Sin embargo, observaron un efecto reparador dosis dependiente hasta 2.5 mg/106 spz. Es posible que el efecto negativo evidenciado en la presente investigacion sea debido a una interferencia del medio comercial empleado para la congelacion del semen.

Se ha descrito que el proceso de congelacion --descongelacion tiene un efecto negativo en la integridad y la funcionalidad de la membrana espermatica. Esta membrana es fundamental para el metabolismo espermatico y para que el spz lleve a cabo varios procesos involucrados en la fecundacion (24). Se ha demostrado que el PS puede suprimir y revertir la capacitacion(decapacitar spz previamente capacitados) (12). Por tanto, los presentes resultados podrian deberse al efecto de adsorcion a la membrana espermatica que presentan proteinas especificas del PS. Proteinas como las BSP (posiblemente contenidas en la fraccion 21-25), poseen la capacidad de adsorcion a la membrana plasmatica por su interaccion con los fosfolipidos de la misma (9,19,22,23), lo que permite explicar en parte, el efecto de recuperacion de la viabilidad espermatica evidenciada por la fraccion. El efecto decapacitante de estas proteinas se encuentra asociado a su cantidad. Es posible que dosis mas altas de la fraccion, capaciten a los spz en lugar de inhibir su capacitacion, lo que podria explicar el efecto negativo observado cuando se adicionaron dosis de la fraccion, superiores a 0.5 mg/106 spz. De esta manera, aunque existe recuperacion de la viabilidad espermatica, al adicionar proteinas semi-purificadas contenidas en la fraccion 21-25, el efecto de recuperacion post incubacion, depende tambien de la cantidad adicionada y del medio de congelacion empleado.

El medio Bioxcell[R] es un crioprotector comercial fabricado a base de lecitina (fosfatidilcolina) de soya. La fosfatidilcolina se compone de acidos grasos poliinsaturados de 18 carbonos y colina; este compuesto esta presente en las bicapas lipidicas de las membranas celulares. Se ha determinado que las proteinas BSP A1/ A2 interactuan con la colina de los fosfolipidos presentes en la membrana espermatica durante la eyaculacion (9). Dado que las proteinas BSP estimulan la salida de fosfolipidos, es posible que la fraccion 21-25, anadida a spz descongelados (criopreservados con Bioxcell[R]), presente una fuerte interaccion con el medio de criopreservacion, razon por la cual la adicion de la fraccion en cantidades superiores a 0.5 mg/106 spz, posiblemente desencadene procesos de capacitacion espermatica, disminuyendo el porcentaje de spz viables.

Sin embargo, cuando se empleo el medio citrato-fructosa-yema de huevo, la cantidad de la fraccion que incremento los porcentajes de viabilidad espermatica fue mayor que cuando se empleo Bioxcell[C] en la congelacion. A diferencia del Bioxcell[C], la yema de huevo contiene lipoproteinas de baja densidad (LDL) ademas, de fosfatidilcolina. En este sentido, Manjunath et al (24) demostraron que el efecto protector de la yema de huevo se debe a la interaccion entre las proteinas BSP y las LDL de la yema. El hecho de que la cantidad de proteinas que resulto eficaz cuando los spz se congelaron con el medio que contenia yema de huevo sea mayor podria deberse a la interaccion de las LDL presentes en la yema de huevo con las proteinas adicionadas en la fraccion. Estos resultados abren camino a nuevas investigaciones que permitan ratificar el efecto de las proteinas del plasma seminal sobre espermatozoides descongelados.

Los datos obtenidos permiten concluir que la adicion de las fracciones 21-25, de PS que contienen proteinas de bajo peso molecular, revierte en parte el efecto deletereo ocasionado en la membrana espermatica, por la criopreservacion. La incubacion de spz, con las fracciones proteicas 21-25 incremento la viabilidad espermatica post descongelacion de eyaculados criopreservados en diferentes medios. Este incremento en el porcentaje de spz viables post incubacion, vario dependiendo de la cantidad de proteina de la fraccion 21-25 utilizada en la incubacion. Se evidencio una disminucion en la viabilidad post incubacion, cuando los spz congelados en medio comercial, se incubaron con dosis mayores a 0.5 mg/[10.sup.6] spz de la fraccion proteica 21-25.

Los resultados de este trabajo, sugieren la realizacion de nuevas investigaciones, que involucren el uso de proteinas extraidas y purificadas del PS en los protocolos de criopreservacion, con el fin de aumentar las tasas de fertilidad del semen criopreservado.

Agradecimientos

Este trabajo hizo parte del proyecto "Desarrollo de alternativas para mejorar la viabilidad del semen en los procesos de criopreservacion de toros Sanmartinero y Cebu" financiado por el Ministerio de Agricultura, IICA y FEDEGAN. Fue posible gracias a Eliana Neira, Gustavo Quijano, Samuel Correa, Guillermo Onofre y Yolmar Zorro.

Recibido: Mayo de 2011; Aceptado: Enero de 2012.

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Fabian Rueda A, [1] Lic Quim, Tatiana Garces P, [2] Biol, Rocio Herrera L, [1] Zootec, Luis Arbelaez R, [2] Ph.D, Miguel Pena J, [3] MVZ, Henry Velasquez P, [3] M.Sc, Aureliano Hernandez V, [4] Ph.D, Jaime Cardozo C, [1] * Ph.D.

[1] Corporacion Colombiana de Investigacion Agropecuaria CORPOICA. Centro de Biotecnologia y Bioindustria. Laboratorio de Microbiologia Molecular. Cundinamarca, Colombia. [2] Universidad de Pamplona. Laboratorio del Grupo de Investigacion en Quimica. Ciudad universitaria. Pamplona, Norte de Santander, Colombia. [3] CORPOICA. Centro de Reproduccion Integral Animal (CRIA). Centro de Investigacion La Libertad. Km 21 via Pto. Lopez, Villavicencio, Colombia. [4] Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Bogota, Colombia. * Correspondencia: jcardozo@corpoica.org.co
Tabla 1. Porcentaje de viabilidad espermatica en
semen fresco y post-descongelacion con
medio Bioxcell [R], e incubado con 1 mg de
proteinas totales (PT) y diferentes dosis de
la fraccion 21-25

                            Viabilidad (%)

Semen         (mHTF sin     1 mg          0.5
fresco        proteinas)    PT del        mg/[10.sup.6]
                            PS            spz

70.70         27.91 (b)     19.94 (e)     32.32 (a)
[+ o -]6.13   [+ o -]5.16   [+ o -]5.66   [+ o -]6.55

                            Viabilidad (%)

Semen         1               1.5             2
fresco        mg/[10.sup.6]   mg/[10.sup.6]   mg/[10.sup.6]
              spz             spz             spz

70.70         25.73 (bc)      23.51 (cd)      22.20d (e)
[+ o -]6.13   [+ o -]6.32     [+ o -]6.38     [+ o -]6.69

* Medias con diferente letra son estadisticamente
diferentes (p<0.05)
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Title Annotation:ORIGINAL
Author:Rueda A., Fabian; Quim, Lic; Garces P., Tatiana; Herrera L., Rocio; Arbelaez R., Luis; Pena J., Migu
Publication:Revista MVZ (Medicina Veterinaria y Zootecnia)
Date:Jan 1, 2013
Words:5555
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