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Las lipasas: enzimas con potencial para el desarrollo de biocatalizadores inmovilizados por adsorcion interfacial.

Lipases: enzymes having the potential for developing immobilised biocatalysts by interfacial adsorption

Introduccion

Las lipasas (glicerol-ester hidrolasas; EC 3.1.1.3) son enzimas que catalizan la hidrolisis de los enlaces ester presentes en los acilgliceroles in vivo. Ademas, pueden catalizar la hidrolisis o sintesis de un grupo amplio de esteres carboxilicos (Bornscheuer et al. 1994). Estas enzimas estan ampliamente distribuidas en la naturaleza, y se encuentran en microorganismos, plantas y animales (Berner y Hammond, 1970; Mukherjee, 1996; Ruiz et al., 2007). Una caracteristica peculiar de las lipasas es que son enzimas solubles en agua que actuan sobre sustratos insolubles y agregados, por lo que operan unidas a interfaces lipido-agua. Bajo estas condiciones, se produce un incremento de la actividad catalitica, respecto a las soluciones con concentraciones por debajo de la concentracion micelar critica, fenomeno conocido como activacion interfacial (Sarda y Desnuelle, 1958).

Entre las aplicaciones mas exitosas de las enzimas estan aquellas que se consiguen con sus formas inmovilizadas. Esto se debe a las ventajas que confiere la inmovilizacion, entre las que se encuentran: la posibilidad de recuperar la enzima del medio de reaccion, la obtencion de un producto no contaminado con la enzima, y el incremento de la estabilidad operacional del biocatalizador (Guisan et al., 1996a; Malcata, 1996; Knezevic et al., 2004). Uno de los protocolos de inmovilizacion mas difundidos para las lipasas es la adsorcion selectiva sobre soportes hidrofobicos que reproducen las interfaces formadas por los sustratos naturales de estas enzimas (Malcata et al., 1992; Fernandez-Lafuente et al., 1998). En este caso, la inmovilizacion se produce a traves de un mecanismo de adsorcion interfacial (Reis et al., 2009), basado en la activacion de estas enzimas en interfaces.

Las lipasas han suscitado un interes creciente para la industria debido a su versatilidad, estereoselectividad, estabilidad frente a solventes organicos y capacidad de sintetizar compuestos organicos en mezclas de reaccion con baja actividad de agua (Segura et al., 2004; Dandavate et al., 2009). Bajo determinadas condiciones, las lipasas pueden catalizar reacciones quimicas distintas de la hidrolisis, como esterificacion, interesterificacion, alcoholisis, acidolisis y aminolisis (Balcao et al., 1996; Pandey et al., 1999). Estas hidrolasas se han empleado ampliamente como aditivos para detergentes, en las industrias alimentaria, papelera, quimica y energetica; asi como para la produccion de cosmeticos, en tratamientos ambientales y en el diseno de biosensores (MacRae y Hammond, 1995). Es notable el impacto que han tenido las lipasas en la produccion de farmacos mas selectivos y efectivos, con efectos secundarios menores, y en la obtencion de pesticidas de menor toxicidad, todo ello mediante la sintesis de compuestos opticamente puros y la resolucion de mezclas racemicas (Kirchner et al., 1985; Yoshimura et al., 2002; Zarevucka y Wimmer, 2008). Es por ello que cobra vital importancia profundizar en el conocimiento sobre las caracteristicas funcionales de estas enzimas, a fin de determinar las condiciones mas ventajosas de aprovechamiento de sus propiedades, para lograr la optimizacion de los procesos en que son empleadas.

En este trabajo se presentan los resultados de una amplia revision en la literatura especializada sobre las lipasas. En primer lugar, se ofrecen las caracteristicas estructurales mas importantes de estas enzimas en relacion con las peculiares propiedades funcionales que estas determinan. A continuacion se presenta la inmovilizacion de lipasas como tecnologia dirigida a la obtencion de biocatalizadores mas eficientes, con enfasis en la inmovilizacion por adsorcion interfacial: uno de los procedimientos de inmovilizacion mas difundidos para estas proteinas. Por ultimo, se resumen las principales aplicaciones biotecnologicas de las lipasas.

Masa molecular y punto isoelectrico

La mayoria de las lipasas presenta masas moleculares entre 27 y 60 kDa. Sin embargo, se conocen algunos ejemplos de lipasas con masas moleculares ubicadas fuera de este intervalo. Los puntos isoelectricos que se han informado para la mayor parte de las enzimas e isoenzimas de diversos origenes se encuentran entre 3,8 y 7,3 (tabla 1).

Plegamiento y aminoacidos cataliticos

La lipasas presentan un dominio estructural canonico compuesto por ocho cadenas [beta] que forman una hoja [beta]. Estas cadenas estan conectadas por helices [alfa], que quedan empaquetadas a ambos lados de la hoja [beta]. Este nucleo central es el responsable directo de la actividad catalitica y define el plegamiento [alfa]/[beta]-hidrolasa, comun para muchas hidrolasas de origenes filogeneticos y funciones cataliticas diferentes (Ollis et al., 1992).

La actividad funcional de las lipasas se sustenta en la triada de aminoacidos clasica: nucleofilo-acido-histidina (Alam et al., 2002; Mead et al., 2002), dilucidada inicialmente para las proteasas serinicas (Carter y Wells, 1988). Los elementos de la triada se ubican en lazos muy bien conservados del dominio catalitico. El nucleofilo, generalmente una serina, se localiza en un giro que conecta una cadena P con una helice a (Petersen, 1996), en el contexto secuencial pequeno-x-nucleofilo-x-pequeno-pequeno; donde x es cualquier aminoacido y "pequeno" se refiere a un aminoacido poco voluminoso (Ransac et al., 1996). Solo la histidina esta completamente conservada en la triada de las lipasas (Derewenda et al., 1994a), cuyo arreglo topologico y secuencial es la imagen especular de la triada de las proteasas serinicas (Ollis et al., 1992) (figura 1).

Centro activo

El centro activo de las lipasas permanece protegido por una cubierta que impide la entrada del sustrato. Este solo tiene acceso cuando la enzima se encuentra en su conformacion activa y la cubierta se ha desplazado (Derewenda et al., 1994b; Miled et al., 2003). Esta cubierta puede ser una helice [alfa] anfifilica (Lotti y Alberghina, 1996) o un lazo (Hui y Howles, 2002). La estructura nativa de las lipasas es un sistema dinamico de interconversion entre la estructura cerrada, que predomina en ambientes homogeneos, y la estructura abierta, que se estabiliza en las interfaces lipido-agua (Grochulski et al., 1994a; Guisan et al., 1996a). Las estructuras tridimensionales de algunas lipasas en sus conformaciones activas se han determinado por cristalografia y difraccion de rayos X (Derewenda et al., 1994b; Kim et al., 1997; Tyndall et al., 2002; Ericsson et al., 2008).

[FIGURA 1 OMITIR]

Ademas del centro activo principal, las lipasas pancreaticas humana y porcina, y otras de origen microbiano, presentan en su region C-terminal lo que parece ser un sitio catalitico minimo. Este pudiera ser responsable de la actividad enzimatica frente a sustratos hidrosolubles como los esteres del p-nitrofenol (De Caro et al. 1986). Por otra parte, esta actividad tambien pudiera explicarse por las transiciones conformacionales que experimentan estas enzimas, aun en ambientes homogeneos, dadas por la interconversion estructura cerrada-estructura abierta (Kim et al., 1997).

En su conformacion activa, las lipasas presentan en su centro activo un grupo de residuos hidrofobicos dispuestos alrededor de la serina catalitica que constituyen una region electrofilica conocida como cavidad oxianionica (Grochulski et al., 1994b). Ademas, aparece una superficie significativamente apolar alrededor de la entrada al centro activo que se conoce como zona de contacto lipidico (Okkels et al., 1996). Tambien estan presentes algunas moleculas de agua que participan en interacciones importantes para mantener una conformacion del sitio activo cataliticamente competente (Triantafyllou et al., 1993).

Activacion interfacial

De manera general, las lipasas son enzimas que requieren de activacion interfacial para desplegar al maximo su actividad catalitica (Malcata, 1996; Ransac et al., 1996). Este fenomeno consiste en el incremento de la actividad enzimatica en presencia de interfaces lipidoagua (Sarda y Desnuelle, 1958; Chahinian et al, 2002). Se entiende por interface a la superficie imaginaria que separa dos porciones del espacio homogeneas y distintas fisicamente. A nivel molecular, una interface consiste en un conjunto de dos capas adyacentes de moleculas ordenadas con diferente caracter hidrofobico hidrofilico (Malcata, 1996).

Cuando la enzima entra en contacto con una interface, el ambiente dielectrico en la superficie proteica se modifica, en el sentido de potenciar las interacciones electrostaticas. Ello posibilita que la cubierta del centro activo se desplace (Grochulski et al., 1994a; Petersen, 1996; Foresti y Ferreira, 2004), y se produce una reestructuracion en la conformacion de la molecula (Jensen et al., 2002; Aloulou et al., 2006; Lin et al., 2007). Como resultado, los aminoacidos cataliticos quedan expuestos al solvente en una orientacion adecuada, y alrededor de estos se conforma la cavidad oxianionica, por exposicion de determinados residuos hidrofobicos e internalizacion de otros hidrofilicos (Ransac et al., 1996). Ademas, se estructura la zona de contacto lipidico en la vecindad del centro activo y de la cubierta movil (Grochulski et al., 1994a; Jensen et al., 2002). Todo esto incrementa la afinidad de la enzima por sus sustratos lipidicos y contribuye a la estabilizacion del estado de transicion durante el ciclo catalitico (Malcata, 1996; Ransac et al., 1996; Mead et al., 2002).

Las caracteristicas fisico-quimicas del sustrato tambien contribuyen de manera significativa a la activacion interfacial (Egmond, 1996). En el estado agregado, los triacilgliceridos exhiben un grado de ordenamiento elevado, que minimiza el numero de estados conformacionales que pueden presentar estas moleculas en solucion acuosa, debido a la gran flexibilidad de sus cadenas de acidos grasos. Este efecto tiene implicaciones favorables para el reconocimiento enzima-sustrato (Petersen, 1996) (figura 2).

[FIGURA 2 OMITIR]

Agregacion molecular

Dado el caracter hidrofobico de la zona de contacto lipidico cercana al centro activo, no es descartable su interaccion con otras sustancias de su misma naturaleza presentes en el medio, incluyendo las zonas hidrofobicas de otras moleculas de enzima. Estas interacciones conducirian a la formacion de agregados (Snellman et al., 2002) con baja o ninguna actividad catalitica, debido al bloqueo de los centros activos por las propias moleculas enzimaticas. El fenomeno de agregacion en soluciones acuosas ha sido demostrado experimentalmente por varios grupos de investigadores (Flaschel y Renken, 1991; Guisan et al., 1996b; Palomo et al., 2003), los que obtuvieron un rapido descenso de la actividad enzimatica al aumentar la concentracion de enzima (Pedersen et al., 2006).

Especificidad y selectividad

Si bien las lipasas han sido definidas como enzimas especificas para catalizar la separacion hidrolitica de los acidos grasos de cadena larga presentes en los acilgliceroles (Snellman et al., 2002), los cuales son sus sustratos naturales, muy pocas lipasas son especificas en sus reacciones. Por este motivo, el termino especificidad se ha ido reemplazando en la literatura por el de selectividad, el cual describe mucho mejor el comportamiento reactivo de estas hidrolasas. En ultima instancia, la determinacion de la especificidad de una lipasa depende de la sensibilidad del metodo empleado para ello (Jensen y Hamosh, 1996).

Las lipasas pueden ser selectivas por la clase de lipido (Bornscheuer et al., 1994; Li et al., 2009) y por la posicion (Berner y Hammond, 1970) y el tipo de acido graso (Snellman et al., 2002; Zouari et al., 2005). Estas enzimas pueden ser ademas estereoselectivas (Cygler et al., 1995), y alcanzan a distinguir entre enantiomeros, frente a sustratos racemicos, o entre grupos enantiotopicos, para triacilgliceridos proquirales (Bornscheuer 2002). Por ultimo, pueden establecerse ciertas combinaciones entre los tipos de selectividades anteriores (Jensen et al., 1994).

Efecto de la concentracion de sustrato sobre la actividad enzimatica

El efecto de la concentracion de sustrato sobre la actividad lipasa ha sido ensayado con diferentes sustratos para enzimas de diversas fuentes. En la tabla 2 se presentan algunos resultados que se han informado para lipasas en sus formas solubles.

El efecto de la concentracion de sustrato sobre la actividad enzimatica tambien se ha evaluado para lipasas inmovilizadas. En esos casos, se obtienen valores aparentes de los parametros cineticos, ya que estos se encuentran sesgados por las condiciones de la inmovilizacion (Tutar et al., 2009).

Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimatica

Las condiciones optimas de pH dependen, entre otros factores, del sustrato (Berner y Hammond, 1970) y del tampon empleados (Chavez et al., 1990). El pH optimo para las lipasas se encuentra generalmente en el intervalo entre 7,0 y 9,0 (tabla 3), cuando la actividad enzimatica se ensaya frente a sus sustratos especificos, como el aceite de oliva, la tributirina, otros triacilgliceridos pequenos y la trioleina (Rua et al., 1993; Prazeres et al., 1996). No obstante, para algunas lipasas, el pH optimo se encuentra en la region acidica. Asimismo, se han encontrado lipasas con la mayor actividad a valores de pH mas alcalinos (tabla 3).

Tambien puede suceder que se obtenga mas de un valor de pH optimo, manteniendo invariables las demas condiciones del ensayo (Kiyotani et al., 1983). Esto suele ocurrir para lipasas obtenidas a partir de extractos crudos o para mezclas heterogeneas con actividad lipolitica (Berner y Hammond, 1970). La inmovilizacion puede variar el valor de pH optimo de las lipasas con respecto a sus formas solubles (Wei y Wu, 2008), en dependencia del grado de exposicion resultante de sus centros activos (Balcao et al., 1996).

La temperatura optima para una enzima depende, entre otros factores, del sustrato con el que se trabaje, ya que los ligandos ejercen un efecto protector frente a la desnaturalizacion termica (Chavez et al., 1990). La temperatura optima para las lipasas puede encontrarse en el intervalo entre 35 y 50[grados]C, aunque existen lipasas termoestables que exhiben valores de temperatura optima superiores a 50[grados]C (tabla 3).

El medio en el que se encuentre la enzima tambien influye en el valor de temperatura optima. De este modo, las lipasas presentes en preparados crudos, con altas concentraciones de otras proteinas contaminantes distintas de las proteasas, seran mas estables y exhibiran valores aparentes de temperatura optima superiores (Chavez et al., 1990). La inmovilizacion puede producir incrementos en los valores de temperatura optima de las lipasas solubles (Palomo et al., 2004; Wei y Wu, 2008), debido a su efecto sobre la estabilidad enzimatica (Balcao et al., 1996).

Inhibidores, inhibicion y efecto de aditivos sobre la actividad enzimatica

Las lipasas son inhibidas por los organofosfatos (Kordel y Schmid, 1991; Cavalier et al., 2000), como el dietil-p-nitrofenilfosfato y el diisopropil-fluorofosfato (Bhardwaj et al., 2001), por las carbodiimidas en presencia de nucleofilos, como el glicin-etil ester, y por el iodo. Tambien son inhibidores de lipasas los acidos boronicos y el fenil-metil-sulfonilfluoruro (Dandavate et al., 2009), asi como los metales pesados, el EDTA (Snellman et al., 2002; Dandavate et al., 2009), algunos terpenos (Morikawa et al., 2009), los iones halogenos, los alcaloides, el cloroformo, el n-hexanol, el dietil-fenil carbonato, el bromoformo, varias lactonas (Colowick y Kaplan, 1955; Kordel y Schmid, 1991) y algunos 1,2-etilen-di-N-alquilcarbamatos en presencia de detergentes (Lin et al., 2007). Algunos cationes metalicos pueden producir inhibicion (Wu et al., 1996; Snellman et al., 2002; Park et al., 2008; Dandavate et al., 2009).

Los inhibidores de naturaleza proteica son mas especificos por su lipasa blanco, como es el caso del aislado a partir de la harina de trigo, que inhibio a la lipasa pancreatica, pero no fue capaz de inhibir completamente la actividad lipasa de Candida cylindracea y no ejercio ningun efecto sobre otras lipasas aisladas de micobacterias (Tani et al., 1994). Algunas proteinas hidrofobicas, como la albumina de suero bovino, inhiben a las lipasas mediante su union competitiva a las interfaces (Larsson y Erlanson-Albertsson, 1983). Para varias lipasas se han informado los fenomenos de inhibicion por exceso de sustrato, frente a trioleina (Biesiot y Capuzzo, 1990; Prazeres et al., 1996), e inhibicion por producto, causado por los acidos grasos (Larsson y Erlanson-Albertsson, 1983). Los detergentes (Tsai et al., 1996; Brockman, 2000) y las emulsiones de varios solventes organicos (Sugiura e Isobe, 1975) pueden actuar como inhibidores de las lipasas. Algunos autores han informado inhibicion competitiva causada por concentraciones elevadas de detergentes (Kimura et al., 1982).

La actividad lipasa puede ser afectada de diferentes maneras por la presencia de iones metalicos en la preparacion, los que pueden estabilizar o desestabilizar la estructura de estas enzimas en solucion (Tyndall et al., 2002). Muchas lipasas requieren del ion [Ca.sup.2+] para mantener una conformacion estable y/o cataliticamente competente (Amada et al., 2001; Snellman et al., 2002). Ademas del efecto inhibitorio ya mencionado, los cationes metalicos tambien pueden actuar como activadores de las lipasas (Kimura et al., 1982; Snellman et al., 2002; Dandavate et al., 2009). El efecto activador del [Ca.sup.2+] puede manifestarse como un incremento de la [V.sub.max] y/o un decremento de la [K.sub.M] (Kimura et al., 1982). Algunos iones provocan efectos opuestos en lipasas diferentes (Wu et al., 1996; Snellman et al., 2002). Tambien pueden influir sobre la actividad de estas enzimas el tampon (Alston y Freedman, 2001), el solvente (Sugiura e Isobe, 1975; Triantafyllou et al., 1993; Sharma et al., 2002; Dandavate et al., 2009) y la fuerza ionica del medio (Mead et al., 2002). El efecto inhibitorio del EDTA se basa en su capacidad de quelar el [Ca.sup.2+].

Los detergentes o surfactantes son aditivos de primera importancia para la actividad lipolitica (Dandavate et al., 2009), puesto que intervienen en la formacion de micelas a partir de la dispersion de los grandes agregados hidrofobicos en que se organizan espontaneamente los sustratos naturales de estas enzimas en solucion acuosa. Esto trae como consecuencia un incremento notable del area superficial disponible para la interaccion enzima-sustrato, con el consiguiente efecto sobre la velocidad de la reaccion (Egmond, 1996). Estas sustancias pueden ademas formar micelas invertidas en solventes organicos con un contenido de agua moderado, lo que puede traducirse en una mayor actividad y estabilizacion de las moleculas enzimaticas ubicadas en su interior (Shome et al., 2007). Los detergentes tambien pueden influir sobre las propiedades estereoselectivas de las lipasas (Tsai et al., 1996).

Sin embargo, el efecto de los detergentes no es homogeneo para todas las enzimas, ni estas son afectadas del mismo modo por todos los surfactantes (Aloulou et al., 2007). Ademas, la influencia de estos compuestos sobre la actividad lipasa es dependiente de la dosis (Sonesson et al., 2006). Las sales biliares son activadores fundamentales para las lipasas pancreaticas de mamiferos en presencia de colipasa (Kimura et al., 1982; Larsson y Erlanson-Albertsson, 1983), y resultan inhibitorias para otras lipasas (Barnescu et al., 1997). El SDS, conocido por su efecto desnaturalizante sobre las proteinas, activa a determinadas lipasas e inhibe a otras (Wu et al., 1996). Algunos detergentes no ionicos previenen la formacion de agregados enzimaticos (Palomo et al., 2003) y estabilizan estructuralmente a la molecula (Guisan et al., 1996b). El Triton-X100 es un detergente no ionico conocido por su capacidad de estimular la actividad de las lipasas (Sharma et al., 2002).

Metodos de determinacion de la actividad enzimatica

La actividad esterasa mas general puede determinarse empleando como sustratos los esteres de cadena acilica del p-nitrofenol o del [alfa]/[beta]-naftol, siguiendo la liberacion de la base alcoholica por metodos espectrofotometricos. Deben considerarse los distintos coeficientes de extincion del ^nitrofenol a diferentes valores de pH, la ausencia de absorbancia a pH acido, y la ocurrencia de hidrolisis espontanea a pH basico (De Caro et al., 1986; Gupta et al., 2003).

Se han desarrollado numerosos ensayos para cuantificar la actividad hidrolitica de las lipasas en distintas muestras biologicas. Estos permiten monitorear tanto el consumo de los sustratos como la liberacion de los productos en el tiempo (Beisson et al., 2000). La desaparicion de los sustratos puede seguirse por nefelometria o turbidimetria (von Tigerstrom y Stelmaschuk, 1989). Sin embargo, algunas variantes de estos metodos experimentan interferencias debidas a la complejidad de ciertas mezclas. El consumo de los sustratos tambien puede ser monitoreado por metodos espectro-fotometricos (Goujard et al., 2009), tensiometria interfacial (Aloulou et al., 2007), microscopia de fuerza atomica (Prim et al., 2006) y espectroscopia infrarroja. Los ultimos tres metodos requieren un equipamiento costoso.

El analisis de la velocidad de liberacion de los acidos grasos puede efectuarse indirectamente mediante el seguimiento de los protones liberados durante la hidrolisis enzimatica. El metodo de pH-stat, que se fundamenta en la valoracion de la disminucion del pH en el tiempo, es una de las tecnicas mas utilizadas bajo este principio (Bertolini et al., 1995). Los acidos grasos liberados por la actividad de la lipasa se ionizan en solucion acuosa mediante la perdida de protones y la mezcla de reaccion tiende a acidificarse. La velocidad de liberacion de los acidos grasos es proporcional a la velocidad de liberacion de los protones y, por tanto, a la velocidad de acidificacion del medio. Si se anade NaOH a la misma velocidad a la que se liberan los protones, el pH de la mezcla se mantiene constante en el tiempo. Este ensayo consiste en registrar la velocidad a la que es necesario anadir el NaOH titulante a la mezcla de reaccion, a fin de mantener el pH en un valor fijo. Esta velocidad es proporcional a la velocidad de hidrolisis enzimatica de los enlaces ester del sustrato y, por tanto, su medicion permite determinar la actividad de la enzima. La tecnica de pH-stat se ha empleado para cuantificar la actividad lipasa en plantas, suero, plasma y secrecion duodenal. El ensayo presenta un limite de deteccion en el orden de 0,1 [micron]mol/min y solo puede desarrollarse en un intervalo restringido de valores de pH, los que deben igualar o exceder el valor aparente de [pK.sub.a] de los acidos grasos liberados, ya que estos deben encontrarse parcialmente ionizados (Beisson et al., 2000).

Otra forma de medir la liberacion de protones durante el avance de la reaccion es mediante el empleo de indicadores coloreados, cuyos espectros de absorcion cambian con la variacion del pH. Estos metodos son poco especificos y pueden detectar cualquier enzima que acidifique el medio (Lobo de Araujo y Radvanyi, 1987). Tambien es posible medir directamente la disminucion en el pH, pero esta variante es muy poco sensible y los cambios de pH pueden quedar enmascarados por la accion del tampon (Tan y Tan, 1988).

La cuantificacion de los acidos grasos liberados durante el transcurso de la reaccion se ha abordado utilizando metodos colorimetricos que apelan a reactivos cromogenicos cuyas absorbancias varian al interactuar con estas moleculas. Para garantizar una senal de fondo lo mas baja posible, los triacilgliceridos empleados como sustratos no deben contener cantidades elevadas de acidos grasos libres acompanantes. Tambien se han desarrollado ensayos fluorimetricos (Knotz et al., 2006), basados en la interaccion entre los acidos grasos liberados y determinados fluoroforos. Estos metodos son muy sensibles y costosos. La cromatografia en placa fina permite cuantificar los acidos grasos liberados mediante tecnicas densitometricas o autorradiograficas. Este metodo es discontinuo y consume mucho tiempo. La separacion entre el sustrato y los productos radiactivos tambien puede realizarse mediante HPLC, centrifugacion o extraccion con solventes. El ensayo radioisotopico es muy especifico y sensible, y su limite de deteccion es del orden de los picomoles. Su inconveniente principal radica en el empleo de triacilgliceridos sinteticos marcados radiactivamente (Beisson et al., 2000).

Esta variedad de ensayos enzimaticos proporciona amplias posibilidades al investigador en este campo, pero al mismo tiempo dificulta la comparacion entre los resultados obtenidos en distintos laboratorios mediante el empleo de metodos diferentes. Esto se debe a que las condiciones del ensayo influyen sobre la velocidad de la reaccion catalizada enzimaticamente (Chavez et al., 1990).

Inmovilizacion

Las ventajas derivadas de la inmovilizacion de enzimas tambien son aplicables a las lipasas. Debido a la hidrofobicidad marcada que presentan los sustratos naturales de estas enzimas, las mezclas de reaccion en las que ellas operan deben contener un solvente organico o un agente emulsificante apropiados, que traen consigo la ruptura de la homogeneidad del medio. Bajo estas condiciones, es deseable que la lipasa constituya una fase independiente dentro del sistema de reaccion, a fin de prevenir la contaminacion de los productos con cierto nivel de actividad enzimatica residual. Esta aspiracion tecnologica puede alcanzarse con la inmovilizacion, la que ademas extiende el tiempo de vida util del reactor (Balcao et al., 1996; Knezevic et al., 2004). Se ha desarrollado una variedad amplia de protocolos de inmovilizacion para las lipasas (tabla 4).

Inmovilizacion por adsorcion interfacial

Uno de los protocolos de inmovilizacion mas difundidos para las lipasas es la adsorcion selectiva sobre soportes con cierto grado de hidrofobicidad (Fernandez-Lafuente et al., 1998). Segun la propuesta de Bastida et al. (1998), los soportes hidrofobicos mimetizan las interfaces formadas por los sustratos naturales de las lipasas, por lo que estas enzimas se adsorben fuertemente sobre ellos en una forma abierta e hiperactivada, involucrando la zona de contacto lipidico (Okkels et al., 1996). Esta interaccion no es un efecto de asociaciones hidrofobicas, ya que se produce a fuerzas ionicas bajas (Bastida et al., 1998; Fernandez-Lafuente et al., 1998; Sabuquillo et al., 1998; Snellman et al., 2002) y las lipasas son proteinas muy hidrofilicas (Fernandez-Lafuente et al., 1998). Por tanto, este es un mecanismo de adsorcion interfacial, basado en la activacion interfacial y propio solo de proteinas con actividad superficial como las lipasas.

Entre las bondades que presenta el metodo de inmovilizacion por adsorcion interfacial pueden citarse la sencillez de la tecnica, la ausencia de reactivos caros y toxicos, la capacidad para retener o incrementar la actividad especifica (Malcata et al., 1992; Palomo et al., 2004; Cunha et al., 2009), la potenciacion de la estereoselectividad de la lipasa (Bastida et al., 1998; Fernandez-Lafuente et al., 1998), y la posibilidad de recuperar el soporte, debido a la reversibilidad parcial de las interacciones (Balcao et al., 1996).

Entre los soportes mas utilizados para estos fines se encuentran aquellos basados en la activacion de la agarosa con grupos hidrofobicos como butilo, fenilo y octilo (Bastida et al., 1998; Sabuquillo et al., 1998; Fernandez-Lafuente et al., 1998; Cunha et al., 2009). La fortaleza de la adsorcion de las lipasas sobre octyl-agarosa es de tal magnitud, que se requieren altas concentraciones de detergente, urea o guanidina para romper las interacciones (Fernandez-Lafuente et al., 1998).

Aplicaciones biotecnologicas

Las enzimas son catalizadores biologicos extraordinariamente especificos y de gran poder catalitico. La aplicacion industrial de la tecnologia enzimatica es particularmente interesante en procesos que requieren condiciones de reaccion suaves, en terminos de pH, temperatura y presion, debido a la labilidad de la mezcla. Estas moleculas se requieren en cantidades pequenas, pueden distinguir entre grupos funcionales de reactividad similar y son capaces de modificar un sustrato dado dentro de una mezcla compleja, llegando a discriminar incluso entre dos isomeros opticos en el caso de compuestos quirales. En la literatura especializada puede encontrarse abundante documentacion sobre el empleo de enzimas en la obtencion de principios activos (Klibanov, 1990).

Las lipasas son enzimas con una aplicacion amplia en diferentes procesos industriales, particularmente en sus formas inmovilizadas. Ellas se emplean en la produccion de detergentes y de saborizantes naturales (Pandey et al., 1999), en la hidrolisis de aceites y grasas (Taylor, 1996), en la produccion de papel (Jaeger y Reetz, 1998) y en la elaboracion de cosmeticos (Benjamin y Pandey, 1998). Debido a su capacidad de catalizar la sintesis de determinados compuestos en medios organicos con actividad de agua controlada (Dandavate et al., 2009; Gupta y Khare, 2009), las lipasas se han empleado en la produccion de intermediarios para la sintesis organica (Vaidya, 1996), asi como de penicilinas (Savidge, 1984).

Las lipasas han sido utilizadas extensivamente en la obtencion de compuestos opticamente puros (Yoshimura et al., 2002) y en la resolucion de mezclas racemicas (Kirchner et al., 1985; Felluga et al., 2009), aprovechando sus propiedades estereoespecificas (Bornscheuer, 2002; Segura et al., 2004). Esta aplicacion tiene un impacto considerable en la produccion de farmacos mas selectivos y efectivos, con efectos secundarios menores, y en la obtencion de pesticidas con menor incidencia en el medio ambiente (Zarevucka y Wimmer, 2008). Esto se debe a que la actividad funcional de los compuestos quirales es debida generalmente a uno de los enantiomeros, mientras que el otro es inocuo o perjudicial, y puede reducir la actividad del primero, provocar reacciones colaterales indeseadas, o simplemente aportar una contribucion innecesaria a la dosis terapeutica con su presencia en la mezcla (Ariens, 1984).

Conclusiones

Las lipasas son enzimas extraordinariamente versatiles que han recibido considerable atencion en biotecnologia desde hace mas de tres decadas. Esto se debe a las peculiares propiedades funcionales que exhiben estas moleculas, dado su caracter de enzimas interfaciales. La activacion en interfaces, una especificidad de sustrato amplia y una selectividad basada en multiples determinantes estructurales, una sensibilidad de la actividad enzimatica muy rica frente a numerosos y variados efectores, la posibilidad de inmovilizacion con altas retenciones de la actividad funcional, la estabilidad operacional de los biocatalizadores inmovilizados, la estabilidad en solventes organicos, y la capacidad de desarrollar la catalisis en medios con baja actividad de agua, son algunos de los aspectos mas atractivos de las lipasas que han determinado su papel protagonico en numerosos procedimientos de la tecnologia enzimatica. Profundizar en las bondades y limitaciones de estas enzimas como biocatalizadores, contribuye a la optimizacion de los procesos biotecnologicos en los que ellas participan y, por tanto, a una mejor aplicacion de las lipasas para la obtencion de bioproductos de utilidad humana.

Recibido: septiembre 16 de 2009

Aprobado: junio 23 de 2010

Referencias bibliograficas

Alam, M., Vance, D. E., Lehner, R. 2002. Structure-function analysis of human triacylglycerol hydrolase by site-directed mutagenesis: identification of the catalytic triad and a glycosylation site. Biochem 41 (21): 6679-87.

Aloulou, A., Puccinelli, D., De Caro, A. M., Leblond, Y., Carriere, F. 2007. A comparative study on two fungal lipases from Thermomyces lanuginosus and Yarrowia lipolytica shows the combined effects of detergents and pH on lipase adsorption and activity. Biochim Biophys Acta 1771 (12): 1446-56.

Aloulou, A., Rodriguez, J. A., Fernandez, S., van Oosterhout, D., Puccinelli, D., Carriere, F. 2006. Exploring the specific features of interfacial enzymology based on lipase studies. Biochim Biophys Acta 1761 (9): 995-1013.

Alston, M. J., Freedman, R. B. 2001. A comparison of lipase-catalyzed ester and lactone synthesis in low-water systems: Analysis of optimum water activity. J Basic Microbiol 41 (6): 363-6.

Amada, K., Kwon, H. J., Haruki, M., Morikawa, M., Kanaya, S. 2001. [Ca.sup.2+]-induced folding of a family I.3 lipase with repetitive [Ca.sup.2+] binding motifs at the C-terminus. FEBS Lett 509 (1): 17-21.

Ariens, E. J. 1984. Stereochemistry, a basis for sophisticated nonsense in pharmacokinetics and clinical pharmacology. Eur J Clin Pharmacol 26 (6): 663-8.

Balcao, V. M., Paiva, A. L., Malcata, F. X. 1996. Bioreactors with immobilized lipases: State of the art. Enzyme Microb Technol 18: 392-416.

Barnescu, R., Serban, M., Rugina, A., Crisan, I., Cepisca, C., Caloianu, M. 1997. Biochemical characteristics in heterogeneous catalysis correlated with bioactive effect of the extracted components. Romanian J Biol Sci 1-2: 84-9.

Bastida, A., Sabuquillo, P., Armisen, P., Fernandez-Lafuente, R., Huguet, J., Guisan, J. M. 1998. A single step purification, immobilization and hyperactivation of lipases via interfacial adsorption on strongly hydrophobic supports. Biotechnol Bioeng 58 (5): 486-93.

Beisson, F., Tiss, A., Riviere, C., Verger, R. 2000. Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur J Lipid Sci Technol 133-53.

Benjamin, S., Pandey, A. 1998. Candida rugosa lipases: molecular biology and versatility in biotechnology. Yeast 14 (12): 1069-87.

Berner, D. L., Hammond, E. G. 1970. Phylogeny of lipase specificity. Lipids. 5 (6): 558-62.

Bertolini, M. C., Schrag, J. D., Cygler, M., Ziomek, E., Thomas, D. Y., Vernet, T. 1995. Expression and characterization of Geotrichum candidum lipase I gene. Comparison of specificity profile with lipase II. Eur J Biochem 228 (3): 863-9.

Bhardwaj, K., Raju, A., Rajasekharan, R. 2001. Identification, purification and characterization of a thermally stable lipase from rice bran. A new member of the (phospho) lipase family. Plant Physiol 127 (4): 1728-38.

Biesiot, P. M., Capuzzo, J. M. 1990. Digestive protease, lipase, and amylase activities in stage I larvae of the american lobster, Homarus americanus. Comp Biochem Physiol 95A (1): 47-54.

Bornscheuer, U., Reif, O. W., Lausch, R., Freitag, R., Scheper, T., Kolisis, F. N., Menge, U. 1994. Lipase of Pseudomonas cepacia for biotechnological purposes: purification, crystallization and characterization. Biochim Biophys Acta 1201: 55-60.

Bornscheuer, U. T. 2002. Methods to increase enantioselectivity of lipases and esterases. Curr Opin Biotech 13: 543-7.

Brockman, H. L. 2000. Kinetic behavior of the pancreatic lipase-colipase-lipid system. Biochimie 82 (11): 987-95.

Carter, P., Wells, J. A. 1988. Dissecting the catalytic triad of a serine protease. Nature 332: 564-8.

Cavalier, J. F., Buono, G., Verger, R. 2000. Covalent inhibition of digestive lipases by chiral phosphonates. Acc Chem Res 33 (9): 579-89.

Chahinian, H., Nini, L., Boitard, E., Dubes, J. P., Comeau, L. C., Sarda, L. 2002. Distinction between esterases and lipases: a kinetic study with vinyl esters and TAG. Lipids 37 (7): 653-62.

Chavez, M. A., Diaz, J., Perez, U., Delfin, J. 1990. Temas de enzimologia. La Habana, Cuba: Ed. Min. Educacion Superior. 567 p.

Claon, P. A., Akoh, C. C. 1994. Enzyme Microb. Technol 16: 835-8. En: Balcao, V. M., Paiva, A. L., Malcata, F. X. 1996. Bioreactors with immobilized lipases: State of the art. Enzyme Microb Technol 18: 392-416.

Colowick, S. P., Kaplan, N. O. 1955. Preparation and assay of enzymes. Methods in Enzymology. New York: Academic Press INC., Publishers. Vol. I. 835 p..

Cunha, A. G., Fernandez-Lorente, G., Gutarra, M. L. E., Bevilaqua, J. V., Almeida, R. V., Paiva, L. M. C., Fernandez-Lafuente, R., Guisan, J. M., Freire, D. M. G. 2009. Separation and immobilization of lipase from Penicillium simplicissimum by selective adsorption on hydrophobic supports. Appl Biochem Biotechnol 156: 563-575.

Cygler, M., Grochulski, P., Schrag, J. D. 1995. Structural determinants defining common stereoselectivity of lipases toward secondary alcohols. Can J Microb 41 (1): 289-96.

Dandavate, V., Jinjala, J., Keharia, H., Madamwar, D. 2009. Production, partial purification and characterization of organic solvent tolerant lipase from Burkholderia multivorans V2 and its application for ester synthesis. Bioresour Technol 100 (13): 3374-81.

De Caro, J. D., Rouimi, P., Rovery, M. 1986. Hydrolysis of p-nitrophenyl acetate by the peptide chain fragment (336-449) of porcine pancreatic lipase. Eur J Biochem 158: 601-7.

Derewenda, U., Swenson, L., Wei, Y., Green, R., Kobos, P. M., Joerger, R., Haas, M. J., Derewenda, Z. S. 1994b. Conformational lability of lipases observed in the absence of an oil-water interface: crystallographic studies of enzymes from the fungi Humicola lanuginosa and Rhizopus delemar. J Lipid Res 35: 524-34.

Derewenda, Z. S., Derewenda, U., Kobos, P. M. 1994a (His) C epsilon-H...O=C< hydrogen bond in the active sites of serine hydrolases. J Mol Biol 241 (1): 83-93.

Dosanjh, N. S., Kaur, J. 2002. Biochemical analysis of a native and proteolytic fragment of a high-molecular-weight thermostable lipase from a mesophilic Bacillus sp.Prot. Express. Purif 24 (1): 71-5.

Egmond, M. R. 1996. Action of lipases. En: Malcata F. X. Engineering of / with lipases. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. p. 183-91.

Ericsson, D. J., Kasrayan, A., Johansson, P., Bergfors, T., Sandstrom, A. G., Backvall, J. E., Mowbray, S. L. 2008. X-ray structure of Candida antarctica lipase A shows a novel lid structure and a likely mode of interfacial activation. J Mol Biol 376 (1): 109-19.

Felluga, F., Baratta, W., Fanfoni, L., Pitacco, G., Rigo, P., Benedetti, F. 2009. Efficient chemoenzymatic synthesis of chiral pincer ligands. J Org Chem 74 (9): 3547-50.

Fernandez-Lafuente, R., Armisen, P., Sabuquillo, P., Fernadez-Lorente, G., Guisan, J. M. 1998. Immobilization of lipases by selective adsorption on hydrophobic supports. Chem Phys Lipids 93: 185-97.

Flaschel, E., Renken, A. 1991. The behaviour of the Candida rugosa lipase in the presence of soluble substrates. En: Alberghina, L., Schmid, R. D. Verger, R. 1991. Li pases: Structure, Mechanism and Genetic Engineering. Weinheim: GBF Monographs, VCH. 16: 349-52.

Foresti, M. L., Ferreira, M. L. 2004. Computational approach to solvent-free synthesis of ethyl oleate using Candida rugosa and Candida antarctica B Lipases. I. Interfacial activation and substrate (ethanol, oleic acid) adsorption. Biomacromolecules 5 (6): 2366-75.

Fuentes, M., Pessela, P. C. C., Maquiese, J. V., Ortiz, C., Segura, R. L., Palomo, J. M. et al. 2004. Reversible and strong immobilization of proteins by ionic exchange on supports coated with sulfate-dextrans. Biotechnol Prog 20: 1134-9.

Goujard, L., Villeneuve, P., Barea, B., Lecomte, J., Pina, M., Claude, S., Le Petit, J., Ferre, E. 2009. A spectrophotometric transesterification-based assay for lipases in organic solvent. Anal Biochem 385 (1): 161-7.

Grochulski, P., Bouthillier, F., Kazlauskas, R. J., Serrequi, A. N., Schrag, J. D., Ziomek, E., Cygler, M. 1994b. Analogs of reaction intermediates identify a unique substrate binding site in Candida rugosa lipase. Biochem 33 (12): 3493-3500.

Grochulski, P., Li, Y., Schrag, J. D., Cygler, M. 1994a. Two conformational states of Candida rugosa lipase. Protein Sci 3 (1): 82-91.

Guisan, J. M., Fernandez-Lafuente, R., Bastida, A., Blanco, R. M., Soler, G., Garcia-Junceda, E. 1996a. Utilization of unfolding/refolding strategies for reactivation of immobilized derivatives of lipases after inactivation by organic solvents. En Malcata F. X. 1996. Engineering of / with lipases. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. p. 257-71.

Guisan, J. M., Fernandez-Lafuente, R., Bastida, A., Blanco, R. M., Soler, G., Garcia-Junceda, E. 1996b. Modulation of activity/stability properties of lipase from Pseudomonasflourescens by multipoint covalent immobilization on glyoxyl-supports. En: Malcata F.X. 1996. Engineering of / with lipases. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. p. 243-56.

Gupta, A., Khare, S. K. 2009. Enzymes from solvent-tolerant microbes: useful biocatalysts for non-aqueous enzymology. Crit Rev Biotechnol 29 (1): 44-54.

Gupta, R., Rathi, P., Gupta, N., Bradoo, S. 2003. Lipase assays for conventional and molecular screening: an overview. Biotech Appl Biochem 37: 63-71.

Hertzberg, S., Kvittingen, L., Anthonsen, T., Skjak-Braek, G. 1992. Enzyme Microb. Technol. 14: 42-7. En: Balcao, V. M., Paiva, A. L., Malcata, F. X. 1996. Bioreactors with immobilized lipases: State of the art. Enzyme Microb Technol 18: 392-416.

Hui, D. Y., Howles, P. N. 2002. Carboxyl ester lipase: structure-function relationship and physiological role in lipoprotein metabolism and atherosclerosis. J Lipid Res 43 (12): 2017-30.

Jaeger, K. E., Reetz, M. T. 1998. Microbial lipases form versatile tools for biotechnology. Trends Biotechnol 16 (9): 396-403.

Jensen, M. 0., Jensen, T. R., Kjaer, K., Bj0rnholm, T., Mouritsen, O. G., Gunther, H. P. 2002. Orientation and conformation of a lipase at an interface studied by molecular dynamics simulations. Biophys J 83: 98-111.

Jensen, R. G., De Jong, F. A., Lambert-Davis, L. G., Hamosh, M. 1994. Fatty acid and positional selectivities of gastric lipase from premature human infants, in vitro studies. Lipids 29: 433-5.

Jensen, R. G., Hamosh, M. 1996. Selectivity of lipases: types and determination. En Malcata, F. X. Engineering of / with lipases. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. p.17-30.

Kim, K. K., Song, H. K., Shin, D. H., Hwang, K. Y., Suh, S. W 1997. The crystal structure of a triacylglycerol lipase from Pseudomonas cepacia reveals a highly open conformation in the absence of a bound inhibitor. Structure 5: 173-85.

Kimura, H., Futami Y., Tarui, S., Shinomiya, T. 1982. Activation of human pancreatic lipase activity by calcium and bile salts. J Biochem 92: 243-51.

Kirchner, G., Scollar, M. P., Klibanov, A. M. 1985. Resolution of racemic mixtures via lipase catalysis in organic solvents. J Am Chem Soc 107: 7072-6.

Kiyotani, K., Tasaka, H., Tsukiyama, F., Matsuo, Y. 1983. Lipase activity of guinea pig peritoneal macrophages and mycobacterial lipase inhibitor. Hiroshima J Med Sci 32 (3): 267-71.

Klibanov, A. M. 1990. Asymmetric transformations catalyzed by enzymes in organic solvents. Acc Chem Res 23: 114-20.

Knezevic, Z. D., Siler-Marinkovic, S. S., Mojovic, L. V. 2004. Immobilized lipases as practical catalysts. APTEFF 35: 151-64.

Knotz, S., Boersma, M., Saborowski, R. 2006. Microassays for a set of enzymes in individual small marine copepods. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 145 (3): 406-11.

Kordel, M., Schmid, R. D. 1991. Inhibition of the lipase from Pseudomonas spec. ATCC 21808 by diethyl pnitrophenylphosphate. Hints for one buried active site for lipolytic and esterolytic activity. En Alberghina, L., Schmid, R. D., Verger, R. 1991. Lipases: Structure, Mechanism and Genetic Engineering. Weinheim: GBF Monographs, VCH 16: 385-7.

Larsson, A., Erlanson-Albertsson, C. 1983. The importance of bile salt for the reactivation of pancreatic lipase by colipase. Biochim Biophys Acta 750: 171-7.

Li, N., Zeng, Q. M., Zong, M. H. 2009. Substrate specificity of lipase from Burkholderia cepacia in the synthesis of 3'-arylaliphatic acid esters of floxuridine. J Biotechnol 142 (3-4): 267-70.

Lin, M. C., Lu, C. P., Cheng, Y. R., Lin, Y. F., Lin, C. S., Lin, G. 2007. Inhibition or activation of Pseudomonas species lipase by 1,2-ethylene-di-N-alkylcarbamates. Chem Phys Lipids 146 (2): 85-93.

Lobo de Araujo, A., Radvanyi, F. 1987. Determination of phospholipase A2 activity by a colorimetric assay using a pH indicator. Toxicon 25 (11): 1181-8.

Lopez, N., Perez, R., Vazquez, F., Valro, F., Sanchez, A. 2001. Immobilization of different Candida rugosa lipases by adsorption onto polypropylen powder; application to quiral synthesis of ibuprofen and 2-phenyl-1-cyclohexanol esters. J Chem Technol Biothech 77: 175-8.

Lotti, M., Alberghina, L. 1996. Candida rugosa lipase isozymes. Cloning, sequencing, analysis of the substrate binding pocket. En Malcata, F. X. 1996. Engineering of / with lipases. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. p. 115-24.

MacRae, A. R., Hammond, R. C. 1995. Biotechnol Genet Eng Rev 3: 193-217.

Malcata, F. X. 1996. Engineering of / with lipases: scope and strategies. En Malcata, F. X. Engineering of/ with lipases. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. p. 1-16.

Malcata, F. X., Garcia, H. S., Hill, Jr. C. G., Amundson, C. H. 1992. Hydrolysis of butteroil by immobilized lipase using a hollow-fiber reactor: Part I. lipase adsorption studies. Biotechnol Bioeng 39: 647-57.

Markvicheva, E. A., Lozinsky, V. I., Plieva, F. M., Kochetkov, K. A., Rumsh, L. D., Zubov, V. P. et al. 2005. Gel-immobilized enzymes as promising biocatalysts: Results from Indo-Russian collaborative studies. Pure Appl Chem 77 (1): 227-36.

Martins, J. F., Carvalho, I. B., Sampaio, T. C., Barreiros, S. 1994. Enzyme Microb Technol 16: 785-90. En Balcao, V. M., Paiva, A. L., Malcata, F. X. 1996. Bioreactors with immobilized lipases: State of the art. Enzyme Microb Technol 18: 392-416.

Mead, J. R., Irvine, S. A., Ramji, D. P. 2002. Lipoprotein lipase: structure, function, regulation, and role in disease. J Mol Med 80: 753-69.

Miled, N., Bussetta, C., De Caro, A., Riviere, M., Berti, L., Canaan, S. 2003. Importance of the lid and cap domains for the catalytic activity of gastric lipases. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 136 (1): 131-8.

Morikawa, T., Xie, Y., Asao, Y., Okamoto, M., Yamashita, C., Muraoka, O. et al. 2009. Oleanane-type triterpene oligoglycosides with pancreatic lipase inhibitory activity from the pericarps of Sapindus rarak. Phytochemistry 70 (9): 1166-72.

Mukherjee, K. D. 1996. Plant lipases in lipid biotransformations. En Malcata, F. X. Engineering of / with lipases. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. p. 391-401.

Okkels, J. S., Svendsen, A., Patkar, S. A., Borch, K. 1996. Protein engineering of microbial lipases with industrial interest. En Malcata, F. X. 1996. Engineering of / with lipases. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. p. 203-17.

Ollis, D. L., Cheah, E., Cygler, M., Dijkstra B., Frolow, F., Franken, S. M. et al. 1992. The a/p hydrolase fold. Prot Eng 5 (3): 197-211.

Palomo, J. M., Fuentes, M., Fernandez-Lorente, G., Mateo, C., Guisan, J. M., Fernandez-Lafuente, R. 2003. General trend of lipase to self-assemble giving bimolecular aggregates greatly modifies the enzyme functionality. Biomacromolecules 4 (1): 1-6.

Palomo, J. M., Segura, R. L., Fernandez-Lorente, G., Pernas, M., Rua, M. L., Guisan, J. M., Fernandez-Lafuente, R. 2004. Purification, immobilization, and stabilization of a lipase from Bacillus thermocatenulatus by interfacial adsorption on hydrophobic supports. Biotechnol Prog 20: 630-5.

Pandey, A., Benjamin, S., Soccol, C. R., Nigman, P., Krieger N., Soccol, V. T. 1999. The realm of microbial lipases in biotechnology. Biotechnol. Appl Biochem 29: 119-31.

Park, J., Cho, S. Y., Choi, S. J. 2008. Purification and characterization of hepatic lipase from Todarodes pacificus. BMB Rep 41 (3): 254-8.

Pedersen, S., Nesgaard, L., Baptista, R. P., Melo, E. P., Kristensen, S. R., Otzen, D. E. 2006. pH-dependent aggregation of cutinase is efficiently suppressed by 1,8-ANS. Biopolymers 83 (6): 619-29.

Petersen, S. B. 1996. Lipases and esterases: some evolutionary and protein engineering aspects. En Malcata, F. X. 1996. Engineering of / with lipases. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. p. 125-42.

Prazeres, D. M. F., Lemos, F., Garcia, F. A. P., Cabral, J. M. S. 1996. Reversed micellar membrane bioreactor. En Malcata, F. X. Engineering of / with lipases. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. p. 483-513.

Prim, N., Iversen, L., Diaz, P., Bj0rnholm, T. 2006. Atomic force microscope studies on the interactions of Candida rugosa lipase and supported lipidic bilayers. Colloids Surf B. Biointerfaces 52 (2): 138-42.

Ransac, S., Carriere, F., Rogalska, E., Verger, R., Marguet, F., Buono, G. et al. 1996. The kinetics, specificities and structural features of lipases. En Malcata, F. X. 1996. Engineering of / with lipases. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. p. 143-82.

Reis, P., Holmberg, K., Watzke, H., Leser, M. E., Miller, R. 2009. Lipases at interfaces: a review. Adv Colloid Interface Sci 147-148: 237-50.

Rua, M. L., Diaz-Maurino, T., Fernadez, V. M., Otero, C., Ballesteros, A. 1993. Purification and characterization of two distinct lipases from Candida cylindracea. Biochim. Biophys. Acta. 1156: 181-9.

Ruiz, C., Falcocchio, S., Pastor, F. I., Saso, L., Diaz, P. 2007. Helicobacter pylori EstV: identification, cloning, and characterization of the first lipase isolated. Appl Environ Microbiol 73 (8): 2423-31.

Sabuquillo, P., Reina, J., Fernandez-Lorente, G., Guisan, J. M., Fernandez-Lafuente, R. 1998. Interfacial affinity chromatography of lipases: separation of different fractions by selective adsorption on supports activated with hydrophobic groups. Biochim Biophys Acta 1388: 337-48.

Sarda, L., Desnuelle, P. 1958. Action de la lipase pancreatique sur les esters en emulsion. Biocem Biophys Acta 30 (3): 513-21.

Savidge, T. A. 1984. Enzymatic conversions used in the production of penicillins and cephalosporins. En Vandamme, E. J. 1984. Biotechnology of Industrial Antibiotics. Drugs and Pharmaceuticals Sciences. New York: Marcel Dekker Inc. 22: 205-9.

Segura, R. L., Palomo, J. M., Mateo, C., Cortes, A., Terreni, M., Fernandez-Lafuente, R., Guisan, J. M. 2004. Different properties of the lipases contained in porcine pancreatic lipase extracts as enantioselective biocatalysts. Biotechnol Prog 20 (3): 825-9.

Sharma, A. K., Tiwari, R. P., Hoondal, G. S. 2002. Properties of a thermostable and solvent stable extracellular lipase from a Pseudomonas sp. AG-8. Biotechnol Bioeng 77 (6): 693-703.

Shome, A., Roy, S., Das, P. K. 2007. Nonionic surfactants: a key to enhance the enzyme activity at cationic reverse micellar interface. Langmuir. 23 (8): 4130-6.

Shuen-Fuh, L., Chien-Ming, C., Chuan-Mei, Y., Ying-Chieh, T. 1996. Purification and partial characterization of an alkaline lipase from Pseudomonas pseudoalcaligenes F-111. Appl Environm Microbiol 62 (3): 1093-5.

Silva, A. M., Cabral, J. M., Costa, M. S., Garcia, F. A. P. 1991. Characteristics of a new lipase from a Thermus sp. bacterium. En Alberghina, L., Schmid, R. D., Verger, R. 1991. Structure, Mechanism and Genetic Engineering. Weinheim: GBF Monographs, VCH. 16: 417-20.

Snellman, E. A., Sullivan, E. R., Colwell, R. R. 2002. Purification and properties of the extracellular lipase, LipA, of Acinetobacter sp. RAG-1. Eur J Biochem 269: 5771-9.

Sonesson, A. W., Elofsson, U. M., Brismar, H., Callisen, T. H. 2006. Adsorption and mobility of a lipase at a hydrophobic surface in the presence of surfactants. Langmuir 22 (13): 5810-7.

Sugiura, M., Isobe, M. 1975. Studies on the mechanism of lipase reaction. I. Inhibition of lipase activity by emulsion of organic solvents. Chem Pharm Bull 23 (6): 1221-25.

Taipa, M. A., Liebeton, K., Costa, J. V., Cabral, J. M., Jaeger, K. E. 1995. Lipase from Chromobacterium viscosum: biochemical characterization indicating homology to the lipase from Pseudomonas glumae. Biochim. Bio phys Acta 1256 (3): 396-402.

Tan, N. H., Tan, C. S. 1988. Acidimetric assay for phospholipase A using egg yolk suspension as substrate. Anal Biochem 170: 282-8.

Tani, H., Ohishi, H., Watanabe, K. 1994. Purification and characterization of proteinous inhibitor of lipase from wheat flour. J Agric Food Chem 42 (11): 2382-5.

Taylor, F. 1996. Lipase membrane reactor for continuous hydrolysis of tallow. En Malcata, F. X. 1996. Engineering of / with lipases. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. p. 455-71.

Triantafyllou, A. O., Adlercreutz, P., Mattiasson, B. 1993. Influence of the reaction medium on enzyme activity in bio-organic synthesis: behavior of lipase from Candida rugosa in the presence of polar additives. Biotechnol Appl Biochem 17: 167-79.

Tsai, S-W., Lu, C-C., Chang, C-S. 1996. Surfactant enhancement of (S)-naproxen ester productivity from racemic naproxen by lipase in isooctane. Biotech Bioeng 51: 148-56.

Tutar, Havva, Yilmaz, Elif, Pehlivan, Erol et al. 2009. Immobilization of Candida rugosa lipase on sporopollenin from Lycopodium clavatum. Int J Biol Macromol 45 (3): 315-20.

Tyndall, J. D., Sinchaikul, S., Fothergill-Gilmore, L. A., Taylor, P., Walkinshaw, M. D. 2002. Crystal structure of a thermostable lipase from Bacillus stearothermophilus P1. J Mol Biol 323 (5): 859-69.

Vaidya, A. M. 1996. Bioreactors for continuous enzymatic esterification with insitu water activity control -- I. En Malcata, F. X. Engineering of / with lipases. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. p. 515-24.

von Tigerstrom, R. G., Stelmaschuk, S. 1989. The use of Tween 20 in a sensitive turbidimetric assay of lipolytic enzymes. Can J Microb 35: 511-4.

Wei, H-N., Wu, B. 2008. Screening and immobilization Burkholderia sp. GXU56 lipase for enantioselective resolution of (i?,S)-methyl mandelate. Appl Biochem Biotechnol 149: 79-88.

Wu, X. Y., Jaaskelainen, S., Linko, Y. Y. 1996. Purification and partial characterization of Rhizomucor miehei lipase for ester synthesis. Appl Biochem Biotech 59: 145-58.

Yang, K. S., Sohn, J., Kim, H. K. 2009. Catalytic properties of a lipase from Photobacterium lipolyticum for biodiesel production containing a high methanol concentration. J Biosci Bioeng 107 (6): 599-604.

Yoshimura, Y., Moon, H. R., Choi, Y., Marquez, V. E. 2002. Enantioselective synthesis of bicyclo[3.1.0] hexane carbocyclic nucleosides via a lipase-catalyzed asymmetric acetylation. Characterization of an unusual acetal byproduct. J Org Chem 67 (17): 5938-45.

Zarevucka, M., Wimmer, Z. 2008. Plant products for pharmacology: application of enzymes in their transformations. Int J Mol Sci 9 (12): 2447-73.

Zouari, N., Miled, N., Cherif, S., Mejdoub, H., Gargouri, Y. 2005. Purification and characterization of a novel lipase from the digestive glands of a primitive animal: the scorpion. Biochim Biophys Acta 1726 (1): 67-74.

Jorge Gonzalez-Bacerio (1), Jairo Rodriguez Hernandez (2), Alberto del Monte Martinez (3) *

(1) Bioquimico, profesor, Centro de Estudio de Proteinas, Facultad de Biologia, Universidad de La Habana, Cuba. jogoba@fbio. uh.cu

(2) Microbiologo, Centro de Estudio de Proteinas, Facultad de Biologia, Universidad de La Habana.

(3) Autor de correspondencia, bioquimico, profesor e investigador, Centro de Estudio de Proteinas, Facultad de Biologia, Universidad de La Habana. adelmonte@fbio.uh.cu
Tabla 1. Masas moleculares y puntos isoelectricos de lipasas
procedentes de diversas fuentes

                             Masa
                           molecular      Punto
Fuente                       (kDa)     isoelectrico     Referencia

Chromobacterium viscosum      33           7,1        Taipa et al.,
                                                      1995

Candida rugosa                60        4,80-5,04     Lotti y
                                       (isoenzimas)   Alberghina,
                                                      1996

Pseudomonas                   32           7,3        Shuen-Fuh
pseudoalcaligenes                                     et al., 1996

Rhizomucor miehei            31.6          3,8        Wu et al., 1996

Salvado de arroz              9.4           ND        Bhardwaj
                                                      et al., 2001

Acinetobacter sp.             33            ND        Snellman
                                                      et al., 2002

Escorpion                     50            ND        Zouari
(glandulas digestivas)                                et al., 2005

Calamar Todarodes             27            ND        Park et al.,
pacificus (higado)                                    2008

ND: No determinado.

Tabla 2. Parametros cineticos de diferentes lipasas en sus formas
solubles

Fuente        Sustrato      [K.sub.M]           [V.sub.max]  Referencia

Pancreas      p-nitrofenil  0,20 mmol/L         ND           de Caro et
porcino       acetato                                        al. 1986

Thermus sp.   Trioleina     7,1%                55,5 mol/    Silva et
                            ([V.sub.Trioleina]  (mL * h *    al., 1991
                            /                   mg prot.)
                            [V.sub.isooctano])

Candida       p-nitrofenil  0,0392 mmol/L       ND           Rua et
rugosa A      butirato                                       al., 1993

C. rugosa B   p-nitrofenil  > 0,4 mmol/L        ND           Rua et
              butirato                                       al., 1993

C. rugosa     Aceite de     703 mmol/L          6032 mmol/   Prazeres
              oliva                             (min * mg)   et al.,
                                                             1996

Salvado de    Trioleina     6,71 mmol/L         ND           Bhardwaj
arroz                                                        et al.,
                                                             2001

Bacillus sp.  p-nitrofenil  3,63 mmol/L         0,26         Dosanjh y
              laurato                           [micron]      Kaur, 2002
                                                mol/(min
                                                * mL)

Burkholderia  p-nitrofenil  1,56 mmol/L         5,62         Dandavate
multivorans   palmitato                         [micro]mol/  et al.,
V2                                              (mg * min)   2009

ND: No determinado. [K.sub.M]: Constante de Michaelis-Menten
para el par enzima-sustrato. [V.sub.max]: Velocidad maxima
de la reaccion catalizada por la lipasa.

Tabla 3. Valores optimos de pH y temperatura de diferentes lipasas
en sus formas solubles.

                                  Temperatura
                         pH         optima
Fuente                 optimo     ([grados]C)         Referencia

Conejillo de indias    4,5/7,0        ND         Kiyotani et al. 1983
(macrofagos del
peritoneo)

Chromobacterium          7,0          42         Prazeres et al., 1996
viscosum

Rhizomucor miehei        8,0          50         Wu et al., 1996

Salvado de arroz        11,0          80         Bhardwaj et al., 2001

Acinetobacter sp.        9,0          55         Snellman et al., 2002

Helicobacter pylori     10,0          50         Ruiz et al., 2007

Calamar Todarodes        8,0         35-40       Park et al., 2008
pacificus (lipasa
hepatica)

Burkholderia sp.         8,0          40         Wei y Wu, 2008

Tabla 4. Algunos metodos de inmovilizacion empleados para las lipasas

Fuente             Soporte           Metodo             Referencia

Candida            Alginato de       Atrapamiento       Hertzberg et
cylindracea        sodio                                al. 1992

Pancreas           Celite, esferas   Adsorcion          Martins et al.,
porcino            de vidrio-        fisica             1994
                   aminopropil,
                   silanizado y
                   con lavado
                   acido.

C. antarctica      Resina acrilica   Enlazamiento       Claon y Akoh,
                                     ionico             1994

C. rugosa          Polipropileno     Adsorcion          Lopez et al.,
                                     fisica             2001

C. antarctica      Sulfato-          Enlazamiento       Fuentes et al.,
A y B, C.          dextrana-MANAE-   ionico             2004
rugosa,            agarosa CL 4B
Rhizomucor
miehei,
Rhyzopus oryzae

Pancreas porcino   Esferas de        Enlazamiento       Markvicheva et
                   criogel           covalente          al., 2005
                   polivinil-
                   alcohol

Arthrobacter sp.   Materiales        Encapsulacion      Yang et al.,
                   hidrofobicos                         2009
                   sol-gel

Thermomyces        Glutaraldehido    Entrecruzamiento   Gupta y Khare,
lanuginosa                                              2009
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Author:Gonzalez-Bacerio, Jorge; Rodriguez Hernandez, Jairo; del Monte Martinez, Alberto
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2010
Words:9381
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