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Larvicidal activity of natural products and assessment of susceptibility to the insecticide temefos in controlling the Aedes aegypti (diptera, culicidae)/Atividade larvicida de produtos naturais e avaliacao da susceptibilidade ao inseticida temefos no controle do Aedes aegypti (diptera: culicidae).

Atividad larvicida de productos naturales en el control de Aedes aegypti (diptera: culicidae) y evaluacion de resistencia al insecticida temefos

Introducao

O mosquito Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) e vetor de virus causadores das enfermidades conhecidas como dengue, chikungunya e zika (Vasconcelos, 2015). A dengue e a chikungunya tem sintomas e sinais semelhantes, enquanto a dengue se destaca pelas dores nos corpo, a chikungunya e caracterizada por dores e inchaco nas articulacoes. Ja a zika, apresenta febre mais baixa (ou ausencia de febre), manchas na pele e coceira no corpo (Sesab, 2016).

O Aedes aegypti se desenvolve por meio de metamorfose completa (holometabolia) passando pelas fases de ovo, larva (4 estagios), pupa e adulto (Simas et al., 2004; Neves, 2011; MS, 2016). As acoes para o seu controle populacional sao realizadas principalmente nas fases larvais, quando se encontra mais vulneravel. O inseticida organofosforado temefos tem sido o produto recomendado e utilizado pelo Programa Nacional de Prevencao a Dengue no Brasil e pela Organizacao Mundial da Saude (Carvalho et al., 2004; Crivelenti et al., 2011; DIVE, 2014). No entanto, ja foram identificadas populacoes de mosquitos resistentes ao inseticida na Colombia (Maestres et al., 2009) e em diversos estados do Brasil, como Ceara, Distrito Federal, Minas Gerais e Paraiba (Carvalho et al., 2004; Lima et al., 2006; Beserra et al., 2007; Horta et al., 2011). Alem disso, a aplicacao de inseticidas e de alto custo e normalmente tem duracao residual de ~60 dias, o que faz com que seja necessario repetir com frequencia a sua aplicacao para poder manter o controle do vetor (Rey et al., 2010).

Em resposta aos ataques patogenicos, as plantas produzem metabolitos secundarios como os flavonoides, alcaloides e terpenoides que coevoluem com os insetos e micro-organismos, tornando-se fontes naturais de substancias inseticidas (Marangoni et al., 2012; Simoes et al., 2010). A utilizacao dessas materias-primas na producao de extratos para o controle de vetores apresenta vantagens em relacao aos inseticidas sinteticos. Seus principios ativos apresentam uma taxa de biodegradabilidade maior e sao geralmente menos prejudiciais para a saude humana e para o meio ambiente (Viegas Junior, 2003; Barreto, 2005). E nessa perspectiva que tem sido desenvolvidas pesquisas para obtencao de inseticidas naturais menos poluentes e mais seletivos para o controle populacional de vetores (Silva et al., 2004; Bobadilla et al., 2005; Santiago et al., 2005; Guissoni et al., 2013).

A infestacao pelo mosquito A. aegypti em Chapeco, municipio do Estado de Santa Catarina, sul do Brasil, conta com um historico de duas decadas (Lutinski et al., 2013). Nos ultimos nove anos o municipio vem apresentando elevada infestacao, alcancando indices de infestacao predial (IIP) de 8% (DIVE, 2014). Segundo o Ministerio da Saude (Funasa, 2001), cidades com IIP >1% apresentam riscos reais de transmissao viral da dengue. Neste contexto, este estudo visou: 1) avaliar a atividade larvicida dos extratos aquosos de plantas medicinais abundantes no oeste catarinense como a Eugenia uniflora O. Berg. (Myrtaceae)--pitangueira, Solidago chilensis Meyen (Asteraceae)--erva-lanceta, Casearia sylvestris Sw. (Flacourtiaceae)--guacatonga, a fracao acetato de etila de Heteropterys aphrodisiaca O. Mach. (Malpighiaceae)--no-de-cachorro, e do flavonoide rutina, presentes nestas especies, frente ao A. aegypti; e 2) avaliar a susceptibilidade de uma populacao de A. aegypti frente ao inseticida temefos.

Material e Metodos

As amostras dos materiais vegetais (folhas) de Casearia sylvestris (26[degrees]58'36,06"S e 52[degrees]44'27,18"O), Solidago chilensis (27[degrees]06'38,83"S e 52[degrees] 34'26,52"O) e Eugenia uniflora (27[degrees]05'41,43"S e 52[degrees]39' 39,19"O) foram obtidas no interior do municipio de Chapeco, Santa Catarina, e identificadas no Museu Botanico Municipal de Curitiba, Parana, pelo curador Osmar dos Santos Ribas. Amostras de H. aphrodisiaca foram coletadas em diferentes estacoes do ano em Santo Antonio do Levenger, Mato Grosso (30[degrees]28'31"S e 51[degrees]35' 35"O). As amostras foram identificadas e depositadas no Instituto de Botanica da Universidade Federal do Mato Grosso. Todos os materiais vegetais foram desidratados a temperatura ambiente (25 [+ or -] 3[degrees]C), protegidas de luz solar direta e de umidade.

As amostras desidratadas de C. sylvestris, S. chilensis e E. uniflora foram selecionados em tamis de 425 [micro]m (35 Tyler/ Mesh) e submetidos a um processo de extracao por decoccao (FB 5, 2010) com agua destilada (1:20; p/v). Posteriormente, os extratos aquosos obtidos foram filtrados, liofilizados e estocados em freezer a -20[degrees]C ate a realizacao dos ensaios. O extrato de H. aphrodisiaca foi obtido por turbolizacao (acetona 70% v/v; 500ml) utilizando 50g de material vegetal dessecado (FB 5, 2010). O extrato obtido foi concentrado em rotavapor sob pressao reduzida e liofilizado. O extrato liofilizado (50g) foi diluido com agua (500ml) e a solucao foi submetida a particao em funil de separacao com 500ml de acetato de etila. A fracao acetato de etila foi concentrada em rotavapor sob pressao reduzida e liofilizada, pesada, identificada e estocada em freezer a -20[degrees]C para posteriores ensaios. O flavonoide rutina (Rutin hydrat; lote BCBB6174, Sigma-Aldrich, EEUU) foi estocado em freezer a -20[degrees]C ate a realizacao dos ensaios. O inseticida temefos (Abate[R]; lote 23512) foi cedido pelo Programa de Prevencao a Dengue da Secretaria de Saude do municipio de Chapeco.

As larvas de A. aegypti foram obtidas a partir dos ovos coletados com armadilhas do tipo ovitrampas (DIVE, 2015) no perimetro urbano do municipio de Chapeco. A eclosao dos ovos ocorreu no laboratorio de ecologia da Universidade Comunitaria da Regiao de Chapeco. Os ovos contidos nas palhetas foram colocados em bandejas com 1 litro de agua destilada. Apos a eclosao, as larvas foram mantidas sob temperatura ambiente controlada (29 [+ or -] 3[degrees]C), fotoperiodo de 12h e alimentadas com racao de peixe ate atingirem o 2[degrees] e 3[degrees] estagio de desenvolvimento (Forattini, 2002).

As concentracoes dos extratos foram definidas a partir de Coelho et al. (2009). Amostras dos extratos vegetais e rutina foram diluidas em agua destilada para a producao das concentracoes de 500, 750 e 1000 [micro]g x [ml.sup.-1] e submetidas a banho de ultrassom para completa dissolucao. O extrato de H. aphrodisiaca foi avaliado tambem nas concentracoes de 125 e 250 [micro]g [ml.sup.-1]. O inseticida temefos (formulacao comercial impregnada em graos de areia) foi avaliado na concentracao de 0,1 g x [l.sup.-1] (Funasa, 2001) e em cinco concentracoes menores (0,09; 0,08; 0,07; 0,06 e 0,05 g x [l.sup.-1]).

Os ensaios foram desenvolvidos em triplicatas, sendo inseridas nove larvas dos 2 e 3 estagios (Busato et al., 2015) em frascos de 200ml contendo 60ml de cada tratamento e racao de peixe como alimento. Para o tratamento controle foi utilizado somente agua destilada e alimento. Os resultados foram analisados apos 24 e 48h da aplicacao, considerando-se mortas as larvas que nao apresentaram movimentos quando tocadas com estilete. Foram atendidos todos os cuidados relacionados a biosseguranca durante os ensaios e as larvas foram eliminadas antes de alcancarem a fase de pupa.

Foi realizada uma analise de variancia para comparar as medias de larvas vivas entre os tratamentos tendo como variavel do estudo a taxa de sobrevivencia (ANOVA). Os valores foram transformados previamente para log (x+1). As medias foram comparadas pelo teste de Duncan em nivel de 5% de significancia (p<0,05). A eficiencia dos tratamentos foi calculada pela formula de Abbott (1925).

Resultados

Durante o periodo experimental todas as larvas permaneceram vivas no grupo controle. Foi registrada diferenca no numero de larvas vivas entre os todos os tratamentos e tempos apos a aplicacao dos tratamentos (24h e 48h) em comparacao (p<0,05) com o grupo controle (Tabela I). Nao houve diferencas no numero de larvas vivas nos tratamentos realizados com E. uniflora, S. chilensis e C. sylvestris (500, 750 e 1000 [micro]g [ml.sup.-1]) em comparacao (p > 0,05) com o grupo controle. A fracao acetato de etila de H. aphrodisiaca apresentou eficiente atividade larvicida nas concentracoes de 250 e 500 [micro]g [ml.sup.-1] (21 e 100%, respectivamente) no primeiro periodo de avaliacao (24h) em comparacao com o grupo controle (p<0,05). A rutina revelou atividade larvicida nas concentracoes 500, 750 e 1000 [micro]g x [ml.sup.-1] (62, 97 e 25%, respectivamente comparadas com o grupo controle (p<0,05) em 48h. O inseticida temefos apresentou forte atividade larvicida (100%) nas concentracoes de 0,07; 0,08; 0,09 e 0,1 g x [l.sup.-1], no periodo de 48h (Tabela II).

Discussao

Uma variedade de mosquitos atua como vetores de diversas doencas causando serios problemas a saude da populacao e uso continuado de inseticidas quimicos no combate a estes vetores tem provocado danos a saude do homem e ao meio ambiente, alem de promover a selecao de resistencia. A observacao destes efeitos indesejaveis tem estimulado pesquisas com produtos naturais (Chariandy et al., 1999). As plantas sao fontes importantes de substancias bioativas com componentes quimicos diferentes e com diversas atividades contra insetos (Hollingworth, 1976).

Os flavonoides presentes nas plantas avaliadas neste trabalho sao reconhecidos por apresentarem atividade larvicida (Ioset et al., 1998). No entanto, e importante destacar que nos extratos brutos os constituintes ativos estao normalmente em pequenas concentracoes (Bell e Charlwood, 1980). Isto pode explicar em parte a reduzida atividade dos extratos aquosos de Eugenia uniflora, Solidago chilensis e Casearia sylvestris comparados com a fracao acetato de etila de Heteropterys aphrodisiaca (rica em flavonoides) e rutina.

De acordo com Garcia (2002) um produto e considerado eficiente para o controle populacional de uma especie quando alcanca uma reducao [greater than or equal to] 80% dos individuos. Para a H. aphrodisiaca, na concentracao de 500 [micro] x g [ml.sup.-1], observou-se maxima eficiencia larvicida (100%) frente ao A. aegypti em um curto periodo experimental (24 h). A caracterizacao quimica de H. aphrodisiaca realizada por Marques et al. (2007) mostrou a presenca de altos teores em polifenois totais nos extratos, identificados compostos como flavonoides, substancias antracenicas, esteroidais e taninos nas amostras de raizes. De acordo com Saito (2004) e Simoes et al. (2010), essas substancias sao produzidas como metabolitos secundarios e possuem reconhecidas atividades toxicas sobre insetos. O potencial dos subprodutos desta planta pode ser ainda maior diante da possibilidade da realizacao sistematica de testes combinando diferentes metodos de extracao e partes da planta (Coelho et al., 2009). Dessa forma, a atividade larvicida observada neste trabalho para a fracao acetato de etila da planta, possivelmente esta relacionada com a elevada concentracao de flavonoides.

Carvalho et al. (2010) avaliaram a composicao quimica em diferentes tecidos de C. sylvestris e identificaram a presenca de diterpenos, alguns com reconhecida acao inseticida (Viegas Junior, 2003). Para os generos Solidago e Eugenia, Lorenzi e Matos (2008) descreveram a presenca de substancias quimicas como terpenos, saponinas, acidos fenolicos e altas concentracoes de flavonoides, principalmente rutina e quercetina. Estes compostos sao tambem reconhecidos por apresentarem atividade frente a insetos (Viegas Junior, 2003; Santiago et al., 2005; Simoes et al., 2010). E reconhecido que a extracao aquosa realizada neste trabalho retira preferencialmente compostos de elevada polaridade, reduzindo a concentracao de varias moleculas. Dessa maneira, a ausencia de eficacia dos extratos destas plantas possibilita inferir que os compostos ativos possivelmente nao tenham sido extraidos nos extratos produzidos.

A rutina e um flavonoide extraido industrialmente de plantas como Ruta graveolens (Linnaeus, 1753)--arruda comum--e Fagopyrum sculentum (Moench, 1794)--trigo sarraceno--(Araujo, 2003). Neste estudo, seu potencial inseticida apresentando foi alto (97%), igualando-se estatisticamente com H. aphrodisiaca 500 [micro]g x [ml.sup.-1] e ao temefos 0,1 g x [l.sup.-1]. De acordo com Saito (2004) e Simoes et al. (2010) os flavonoides constituem uma importante classe de polifenois, que sao encontrados em grande abundancia entre os metabolitos secundarios das plantas, nas quais sao responsaveis por desempenhar diversas funcoes como inseticidas, repelentes e antimicrobianos. Ainda, o processo de desenvolvimento de resistencia nos insetos a estas substancias e muito lento. Podem agir sobre os insetos de diferentes maneiras: causando repelencia, inibicao da oviposicao e da alimentacao, disturbios no desenvolvimento, deformacoes infertilidade e mortalidade (Roel, 2001). Observou-se, ainda, que a maior concentracao (1000 [micro]g x [ml.sup.-1]) apresentou menor eficiencia (25%). Possivelmente o aumento da concentracao causou reducao na dissolucao, influenciando o resultado, visto que a rutina possui menor solubilidade em agua (Simoes et al., 2010).

Nao foi verificada resistencia da populacao de mosquitos de A. aegypti ao inseticida temefos. Foi observada susceptibilidade da populacao desses vetores a concentracao do larvicida recomendada pelo Ministerio da Saude do Brasil. O mesmo foi constatado tambem para tres concentracoes menores (0,09; 0,08 e 0,07 gx [l.sup.-1]). O principio ativo do temefos (formulacao comercial) encontra-se adsorvido em graos de areia e a aplicacao e feita diretamente nos depositos (tratamento focal) onde podem ser encontradas as formas imaturas do mosquito Aedes (Lima et al., 2006). O uso de inseticidas sinteticos pode representar riscos a saude humana, dependendo da quantidade e das condicoes em que os individuos sao expostos (Barreto, 2005). Podem gerar desequilibrio ambiental, pois sua acao nao se restringe a especie alvo e ainda causar contaminacao do solo e agua (D'Amato et al., 2002). Crivelenti et al. (2011) identificou efeito toxico e residual do temefos em alevinos de Poecilia reticulata (Peters, 1859). Neste sentido, a avaliacao constante da concentracao minima necessaria se torna um imperativo, assim como, a busca por produtos alternativos.

O efeito larvicida de H. aphrodisiaca e um resultado promissor e abre caminhos para novos estudos focados no isolamento e teste de compostos bioativos do vegetal. A eficiencia da rutina a qualifica como uma opcao para uso em programas de controle vetorial de A. aegypti. Os resultados de susceptibilidade do mosquito A. aegypti ao temefos nao sao conclusivos, pois o estudo nao considerou as condicoes de campo; contudo, os resultados indicam que o produto pode estar sendo aplicado pelo Programa de Prevencao a Dengue em uma concentracao maior do que a necessaria.

Recebido: 28/10/2014. Modificado: 18/02/2016. Aceito: 22/02/2016.

Carin Guarda. Biologa e Mestranda em Ciencias da Saude, Universidade Comunitaria da Regiao de Chapeco (Unochapeco), Brasil.

Junir Antonio Lutinski. Biologo, Universidade do Oeste de Santa Catarina (Unoesc), Brasil. Mestre em Ciencias Ambientais, Unochapeco), Brasil. Doutor em Biodiversidade Animal, Universidade Federal de Santa Maria, Brasil. Professor, Unochapeco, Brasil.

Walter Antonio Roman-Junior. Graduado em Farmacia, Univer sidade Federal de Santa Catarina, Brasil. Mestre em Ciencias Farmaceuticas, Universidade Julio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. Doutor em Ciencias Farmaceuticas, Universidade Federal do Parana, Brasil. Professor, Unochapeco, Brasil.

Maria Assunta Busato. Biologa, Universidade de Passo Fundo, Brasil. Doutora em Biologia, Universidad de Barcelona, Espanha. Professora, Unochapeco, Brasil. e-mail: assunta@ unochapeco.edu.br

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Unochapeco pela disponibilidade de uso dos laboratorios, a Vigilancia Ambiental em Saude do Municipio de Chapeco pela parceria na realizacao da pesquisa, e a bolsa do Programa Institucional de Iniciacao Cientifica do CNPq, Edital No. 278/Reitoria/2013.

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TABELA I
ANALISE DE VARIANCIA DO NUMERO
DE LARVAS DE A. aegypti VIVOS

Causas da variacao                Graus de    Quadrados   Valor
                                  liberdade    medios      de p

Tratamentos                          23        6,17 *     < 0,01
Horas apos a aplicacao                1        0,74 *     < 0,01
Interacao fatorial                   23         0,2 *     < 0,01
Coeficiente de variacao 14,46%

* Significancia ao nivel de 5% de probabilidade.

TABELA II
TRATAMENTOS NAS DIFERENTES CONCENTRACOES
(N=3), NUMERO DE LARVAS DE Aedes aegypti
VIVAS E EFICIENCIA DE 21 TRATAMENTOS
REALIZADOS EM LABORATORIO

Tratamentos        Concentracao                    Larvas de A.
                                                   Aegypti vivas
                                                  (medias [+ or -]
                                                       DP) *

Testemunha         --                              9 [+ or -] 0 a
Eugenia uniflora   500[micro]g x [ml.sup.-1]       9 [+ or -] 0 a
Eugenia uniflora   750[micro]g x [ml.sup.-1]       9 [+ or -] 0 a
Eugenia uniflora   1000[micro]g x [ml.sup.-1]      9 [+ or -] 0 a
Solidago           500[micro]g x [ml.sup.-1]       9 [+ or -] 0 a
  chilensis
Solidago           750[micro]g x [ml.sup.-1]       9 [+ or -] 0 a
  chilensis
Solidago           1000[micro]g x [ml.sup.-1]      9 [+ or -] 0 a
  chilensis
Heteropterys       125[micro]g x [ml.sup.-1]       9 [+ or -] 0 a
  aphrodisiaca
Casearia           1000[micro]g x [ml.sup.-1]    8,6 [+ or -] 0,1 a
  sylvestris
Casearia           500[micro]g x [ml.sup.-1]    7,3 [+ or -] 0,4 ab
  sylvestris
Casearia           750[micro]g x [ml.sup.-1]    7,3 [+ or -] 0,31 ab
  sylvestris
Heteropterys       250[micro]g x [ml.sup.-1]    6,9 [+ or -] 0,50 ab
  aphrodisiaca
Rutina             1000[micro]g x [ml.sup.-1]   5,9 [+ or -] 0,45 b
Temefos            0,05g x [l.sup.-1]           2,9 [+ or -] 0,40 c
Rutina             500[micro]g x [ml.sup.-1]    1,3 [+ or -] 0,81 d
Temefos            0,06g x [l.sup.-1]           1,3 [+ or -] 0,82 d
Rutina             750[micro]g x [ml.sup.-1]    0,2 [+ or -] 1,01 e
Temefos            0,07g x [l.sup.-1]              0 [+ or -] 0 e
Temefos            0,08g x [l.sup.-1]              0 [+ or -] 0 e
Temefos            0,09g x [l.sup.-1]              0 [+ or -] 0 e
Heteropterys       500[micro]g x [ml.sup.-1]       0 [+ or -] 0 e
  aphrodisiaca
Temefos            0,10g[l.sup.-1]                 0 [+ or -] 0 e

Tratamentos        Eficiencia
                   (% - 48h)

Testemunha             0
Eugenia uniflora       0
Eugenia uniflora       0
Eugenia uniflora       0
Solidago               0
  chilensis
Solidago               0
  chilensis
Solidago               0
  chilensis
Heteropterys           0
  aphrodisiaca
Casearia               2
  sylvestris
Casearia               10
  sylvestris
Casearia               12
  sylvestris
Heteropterys           21
  aphrodisiaca
Rutina                 25
Temefos                60
Rutina                 62
Temefos                78
Rutina                 97
Temefos               100
Temefos               100
Temefos               100
Heteropterys          100
  aphrodisiaca
Temefos               100

* As letras que seguem as medias indicam a diferenca pelo teste de
Duncan (p<0,05). Eficiencia (%) calculada pela formula Abbott (1925).
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Title Annotation:texto en portugues
Author:Guarda, Carin; Lutinski, Junir Antonio; Roman-Junior, Walter Antonio; Busato, Maria Assunta
Publication:Interciencia
Date:Apr 1, 2016
Words:4022
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