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La ketamina mejora la supervivencia en lesion por quemadura severa en ratas, a traves de la expresion de la proteina de choque 70.

Ketamine improves survival in severe burn injury in rats via the expression of heat shock protein 70

Introduccion

La respuesta al choque termico (HSR) es un sistema de defensa celular altamente conservado a lo largo de la evolucion (1,2). Se puede encontrar en un amplio espectro de organismos, desde los procariontes hasta los seres humanos. El mecanismo molecular subyacente se basa en la capacidad que tiene el factor de transcripcion del factor de choque termico (HSF)-1 de mostrar una actividad inducible de enlace al ADN al elemento de consenso del choque termico (HSE) e implica multiples pasos, incluyendo la translocacion nuclear, la oligomerizacion y la fosforilacion del HSF1 inducible por serina, siendo esta ultima un determinante importante de la potencia transac-tivadora del HSF-13. La HSR se caracteriza por la expresion de proteinas de choque termico (hsp), que son sintetizadas por las celulas en respuesta al calor (de ahi su nombre), al igual que a otros varios estimulos productores de estres (4,5). Se ha demostrado que la expresion de las proteinas de choque termico, clasificadas segun su funcion y tamano, protege las celulas de una amplia gama de factores causantes de estres celular, como la hipoxia, los radicales de oxigeno, las endoto-xinas, las infecciones y la fiebre (6). La capacidad citoprotectora de la proteina de choque termico se puede atribuir parcialmente a su capacidad para estabilizar las estructuras de las proteinas intracelulares, lo que permite que las celulas y organismos que soportan agresiones y ponen su vida en peligro recuperen sus actividades celulares y fisiologicas normales (7).

Se ha demostrado que la ketamina, un anestesico general, en algunos animales experimentales produce la respuesta al choque termico (HSR) aumentando la concentracion de proteina de choque termico 70 (HSP70) en la mucosa olfatoria (8) y la corteza cerebral de las ratas (9). De acuerdo con otros autores (10), los cerdos anestesiados con ketamina y pentobarbital han mostrado mayores expresiones de HSP70 en el higado. El potencial de proteccion de la HSR en quemaduras ha sido demostrado previamente; las ratas preacondicionadas por calor tuvieron una menor mortalidad tras sufrir quemaduras severas, en comparacion con los animales sin quemaduras (11). Por tanto, la hipotesis del presente estudio fue determinar si la ketamina tambien podria mejorar la supervivencia en ratas con quemaduras severas, al inducir la expresion de la proteina de choque termico 70 en tejido miocardico y cerebral.

Metodos

Preparacion de los animales

El protocolo experimental utilizado para el presente estudio fue aprobado por el Centro para Experimentacion Animal del Hospital de la Provincia de Shandong y se desarrollo conforme a las Normativas para la Administracion de Asuntos Relativos a Animales Experimentales (el Concejo de Estado, China, 1988). Antes del estudio, las ratas se alojaron en jaulas individuales en una sala a temperatura controlada, con ciclos alternantes de 12 h de luz y oscuridad; todos los animales tuvieron acceso libre al agua.

Protocolo de lesion por quemadura

Las ratas se anestesiaron con halotano inhalado al 4%. Se afeito el dorso de las ratas y se sumergieron en agua a 92[grados]C durante 20 s, lo cual les produjo una quemadura de espesor completo que comprometia el 30% de la superficie corporal total. El efecto hemodinamico de la formacion de edema y la exudacion serica en el sitio de la quemadura se minimizo mediante la administracion de 5 ml de solucion salina normal IP, inmediatamente despues de la lesion por quemadura. En estudios preliminares, el examen histopato-logico del area quemada indico que este modelo de lesion produce una quemadura reproducible de espesor completo de piel, generalmente sin producir lesion directa a los organos subyacentes.

Procedimiento para la toma de muestras

Ratas Wistar machos (n = 124) con un peso de 250-350g se asignaron aleatoriamente a 3 grupos: grupo control (grupo C) (n = 20); grupo quemado (grupo B) (n = 52) y el grupo que-mado+ketamina (grupo K) (n = 52). Las ratas del grupo K recibieron una inyeccion intramuscular de ketamina (40 mg/kg) despues de 15 min de producirse la lesion por quemadura, mientras que a las del grupo B se les inyecto igual volumen de solucion salina. Se sacrificaron 8 de cada uno de los grupos K y B, a las 3, 6 y 24 h despues de la inyeccion. Se cosecharon muestras de todos los grupos para detectar HSP70 mediante analisis de Western Blot. Se evaluo la condicion de supervivencia de las ratas restantes de cada grupo a las 3, 6, 12, 24, 48, 96, 192 y 240 h.

Deteccion de proteina de choque termico 70 (analisis Western blot)

El tejido miocardico y cerebral se descongelo, se desmenuzo finamente, se peso y lavo con solucion salina fria con tapon fosfato y se homogenizo sobre hielo. El producto homogeni-zado se centrifugo a 20.000rpm a 4[grados]C durante 30min. Las muestras de proteina se hirvieron durante 10 min a 100[grados]C; luego se separaron con electroforesis en gel de dodecil sulfato-policrilamida sodica (SDS_PAGE) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Luego de bloquear con leche desgrasada en polvo al 5% en solucion salina tamponada con Tris con 0,1% Tween 20 (TBS/T) durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron las membranas 3 veces durante 10 min en TBS/T y luego se incubaron de un dia para otro a 4[grados]C, con anticuerpo monoclonal anti-HSP70 conjugado a fosfato alcalino (SPA-810AP, StressGen) a una concentracion de 1:1000. Las membranas se lavaron 3 veces durante 10 min en TBS/T y luego se incubaron con los anticuerpos secundarios conjugados de peroxidasa apropiados. Luego de 3 lavados adicionales con TBS/T durante 10 min, las membranas se sometieron a reaccion con el sistema de quimioluminiscencia mejorado y luego se expusieron sobre laminillas. Se cuantificaron los niveles de proteina por densimetria utilizando Quantity One V4.62 (Bio-Rad).

Analisis estadistico

Todos los valores se expresan como [+ o -] error estandar de la media (SEM). La significacion estadistica de las diferencias entre grupos se evaluo mediante analisis de varianza unidireccional y las diferencias dentro de grupos mediante la prueba t de Student no apareada, utilizando el software SPSS 11.0. Se aplico la prueba exacta de Fisher a los datos de supervivencia. p < 0,05 se considero estadisticamente significativo.

[FIGURA 1 OMITIR]

Resultados

Estado de supervivencia

En el grupo C no murio ningun animal en las primeras 240 h. La tasa de supervivencia de las ratas con quemaduras severas en el grupo B fue del 95% (19 de 20 ratas) a las 3 h, 90% (18/20) a las 6h, 80% (16/20) a las 12 h, 75% (15/20) a las 24 h, 70% (14/20) a las 48 h, 55% (11/20) a las 96 h, 40% (8/20) a las 192 h y 30% (6/20) a las 240 h. La supervivencia en el grupo K fue del 100% (20/20) a las 3h, 100% (20/20 animales) a las 6h, 95% (19/20) a las 12 h, 85% (17/20) a las 24 h, 80% (16/20) a las 48 h, 80% (16/20) a las 96 h, 75% (15/20) a las 192 h y 70% (14/20) a las 240 h. Las diferencias en las tasas de supervivencia entre el grupo K y el grupo B fueron estadisticamente significativas a las 240 h(p< 0,05) (fig. 1).

Deteccion de respuesta al choque termico

Los analisis de Western blot revelaron que la expresion de la proteina HSP70 en el miocardio en respuesta a la administracion de ketamina es mas fuerte que en respuesta a la administracion de solucion salina a las 3 h (158% versus 65%, p = 0,008) y 6 h (165% versus 68%, p = 0,005). Ademas, la expresion de proteina HSP70 en el miocardio alcanzo su pico a las 24h (fig. 2). En comparacion con el grupo B, la ketamina aumento de manera marcada el nivel de expresion de la proteina HSP70 en tejido cerebral a las 3 y a las 6 h (79% versus 51%, p = 0,023 a las 3h; versus 98%, p = 0,015 a las 6h). Mas aun, los analisis Western blot revelaron que la expresion de proteina HSP70 en el miocardio alanzo su pico a las 12 h (fig. 3).

Discusion

En el presente trabajo no murio ningun animal debido a la inmovilizacion ni a los procedimientos de inyeccion. El modelo de quemadura, utilizado comunmente (12), permitio una graduacion mas exacta de la extension de la quemadura, de acuerdo con la superficie corporal, como se obtuvo con la formula de Meeh. Este proceso produjo quemaduras estandar de tercer grado. Se ha encontrado que las ratas Wistar son mas susceptibles a las lesiones termicas que las Sprague-Dawley (13). La ketamina, un anestesico general, ha demostrado que produce la respuesta a choque termico (HSR) en algunos animales experimentales: ha aumentado la concentracion celular de la proteina de choque termico (HSP70) en la mucosa olfatoria (8) y en la corteza cerebral de las ratas (9). Sin embargo, poco se sabe acerca de si la administracion de ketamina mejora la supervivencia en lesion por quemadura severa. Los datos aqui presentados brindan evidencia de que el tratamiento con ketamina mejora la supervivencia en lesion por quemadura severa. Esto esta ademas respaldado por los informes de Neder Meyer y Lazaro da Silva (14), los cuales afirman que los animales anestesiados con ketamina acusaron una tasa de mortalidad significativamente menor a la de los animales anestesiados con la combinacion de midazolam y fentanilo.

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

Nuestro hallazgo de que la ketamina administrada 15 min despues de la lesion por quemadura mejoro la supervivencia fue inesperado, considerando un reporte de que la ketamina administrada 1 h despues de la lesion por quemadura no mejoro la supervivencia (15). La aparente inconsistencia entre nuestros resultados y los del estudio anterior pueden relacionarse con las diferencias en la severidad de la lesion por quemadura y la dosis de ketamina. En el estudio anterior, la quemadura produjo una mortalidad de 15-20% sin tratamiento con ketamina, mientras que en nuestro estudio la quemadura produjo un 70% de mortalidad. En el estudio anterior, la dosis de ketamina fue de 10 mg/kg, considerablemente inferior a la dosis utilizada en nuestro estudio, de 40 mg/kg. Los resultados combinados de nuestro estudio y el anterior sugieren que puede demostrarse una reduccion en la mortalidad inducida por quemaduras cuando se administra una alta dosis de ketamina en un modelo de lesion por quemadura severa, mas no cuando se administra una dosis menor de ketamina tras una lesion por quemadura menos severa.

Los datos aqui presentados respaldan la hipotesis de que la ketamina induce una respuesta a choque termico y que media la citoproteccion contra lesion severa por quemadura a concentraciones tisulares clinicamente relevantes segun la doble evidencia: a) los analisis Western blot revelaron que la administracion de ketamina indujo la expresion de proteina HSP70 en el tejido cerebral y miocardico; b) despues de 10 dias, la tasa de supervivencia de las ratas del grupo K fue superior a la de las del grupo B.

Durante la respuesta al estres causado por quemadura, el corazon es particularmente susceptible a la hipoxia porque tiene solamente una reserva limitada de fosfatos de alta energia. Tanto la severidad como la duracion de la hipoxia determinan la respuesta cardiaca a un aporte de oxigeno disminuido. La hipoxia y el estres oxidativo inducen cambios bioquimicos y funcionales, a pesar de lo cual el corazon trata de mantener sus funciones para contrarrestar los cambios en la tension de oxigeno (16). Enanos recientes varios estudios han sugerido que la expresion de HSP70 puede jugar un papel importante en la proteccion del miocardio contra isquemia, hipoxia, endotoxina, lesion por reperfusion y dano oxidativo. Currie et al. (17) mostraron que un aumento en los niveles de una determinada HSP70, inducida por estres calorico, se asocia con proteccion contra lesion por isquemia-reperfusion. Wischmeyer encontro que la administracion de glutamina podia reducir significativamente los cambios perjudiciales en el metabolismo miocardico y preservar el gasto cardiaco despues de la reoxigenacion, gracias al aumento de la expresion de HSP70 inducida por la glutamina. El trauma por quemadura produjo un incremento en la presion ventricular izquierda y puede mejorar el desempeno ventricular (19).

La isquemia y la hipoxia constituyen las causas primordiales de lesion cerebral luego de una quemadura severa. Varios estudios han demostrado que HSP70 juega un papel neuroprotector en modelos animales de lesion cerebral isquemica y traumatica (20,21).

Ademas del papel bien estudiado de la HSP70 como chaperona molecular que ayuda al correcto plegado de proteinas, se han descrito otros nuevos mecanismos mediante los cuales la HSP70 puede prevenir la muerte celular (22,23). Ahora sabemos que la HSP70 regula la muerte celular por apoptosis, tanto en forma directa al interferir con la funcion de varias proteinas que inducen la muerte celular por apoptosis, como en forma indirecta al aumentar los niveles de la proteina anti apoptosis bel-2. Lee et al. (23) encontraron que los ratones knockout de HSP70 presentaban significativamente mas infartos de miocardio que los ratones silvestres. Otra investigacion sobre mecanismos de esta proteccion in vitro ha demostrado que la ketamina ejerce efectos neuroprotectores al inhibir la fosforilacion del factor de transcripcion c-Jun, el cual juega un papel significativo en la inhibicion de la apoptosis celular y la supervivencia de las celulas (24). Segun las observaciones en el presente estudio, sugerimos que la ketamina juega un papel importante en la proteccion miocardica y neuronal, al aumentar la expresion de la HSP70 en ratas, luego de quemaduras severas, y por ende, aumentando la supervivencia de estas. Yu el al. (25) reportaron que la ketamina puede suprimir la produccion y la actividad de las citoquinas pro-inflamatorias TNF-alfa, interleucina-6, factor nuclear kappaB y receptor tipo Toll 2 o 4 en los pulmones. Estos efectos se correlacionaron con una mayor supervivencia en sepsis relacionada con lesiones.

Conclusiones

La terapia con ketamina mejora la supervivencia en lesion por quemadura severa. Este efecto beneficioso posiblemente se logra a traves de la produccion de la respuesta al choque termico (HSR), como lo evidencia la expresion de la proteina de choque termico 70 en tejido miocardico y cerebral. Se necesitan experimentos mas extensos y especificos para descubrir los mecanismos moleculares exactos mediante los cuales la ketamina ejerce sus efectos. Tal conocimiento pudiera conllevar a enfoques terapeuticos que finalmente pudieran utilizarse en la practica clinica.

Financiacion

Ninguna

Conflicto de intereses

No hay conflictos de intereses que deban reportarse.

http://dx.doi.org/10.1016/j.rca.2013.01.003

REFERENCIAS

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Zhang Meng-yuan (a), * Wang Gong-ming (a), Li Fang-linh (b), Dong Ling (c), Xu Yanbing (a), Chiang Joseph-S (d)

(a) Departamento de Anestesiologia, Hospital de la Provincia de ShanDong, afiliado a la Universidad de ShanDong, Jinan, China

(b) Departamento de Hematologia, Hospital Qilu, afiliado a la Universidad de Shandong, Jinan, China

(c) Departamento de Anestesiologia, Qianfo Mountain Hospital, Jinan, China

(d) Departamento de Anestesiologia y Medicina Perioperatoria, Universidad de Texas M. D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas, Estados Unidos

INFORMACION DEL ARTICULO

Historia del articulo:

Recibido el 3 de junio

de 2012 Aceptado el 23 de enero de 2013

On-line el 12 de abril de 2013

* Autor para correspondencia. Departamento de Anestesiologia, Hospital de la Provincia de ShanDong, afiliado a la Universidad de ShanDong, 324 Jingwuweiqilu, Jinan, R.P. de China, 250021.

Correo electronico: zhangmy717@163.com (Z. Meng-yuan).
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Title Annotation:Investigacion cientifica y tecnologica
Author:Meng-yuan, Zhang; Gong-ming, Wang; Fang-lin, Li; Ling, Dong; Yanbing, Xu; Joseph-S., Chiang
Publication:Revista Colombiana de Anestesiologia
Date:Apr 1, 2013
Words:3410
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