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La inmunorreactividad a calbindina en celulas de Purkinje del cerebelo de ratones no es afectada por la infeccion con virus de la rabia.

IMMUNOREACTIVITY TO CALBINDIN IN PURKINJE CELLS IN THE CEREBELLUM OF MICE IS NOT AFFECTED BY RABIES VIRUS INFECTION

INTRODUCCION

La rabia es una zoonosis originada por un virus neurotropico que afecta a mamiferos domesticos y salvajes, y se propaga a los humanos principalmente por mordedura con saliva infectada. Causa unas 60.000 muertes anuales mas que cualquier otra enfermedad zoonotica, principalmente en Asia y Africa, en poblaciones pobres que no disponen de vacunacion adecuada ni tratamiento profilactico (1, 2). En Latinoamerica y el Caribe han disminuido notablemente los casos de rabia gracias a los programas de erradicacion de la rabia canina. No obstante, la falta de atencion medica oportuna en algunas regiones y la transmision originada por la fauna silvestre, mantienen a esta enfermedad como un problema de salud publica en America Latina (3), incluyendo a Colombia (4).

Dentro de las manifestaciones clinicas de la rabia estan: hidrofobia e hiperexcitacion, alucinaciones, debilidad progresiva de las extremidades hasta la paralisis, coma y finalmente la muerte del paciente. Cuando aparecen los primeros sintomas neurologicos, el desenlace es inevitablemente fatal, por esta razon es una de las enfermedades con mas alta tasa de mortalidad (1, 5 ,6). No obstante, los hallazgos histopatologicos en el sistema nervioso central (SNC) de los animales infectados no explican la severidad del cuadro clinico de la rabia y su letalidad (6, 7). En el examen neurohistologico post mortem solo se detectan alteraciones minimas del tejido nervioso y no se observan signos de muerte celular, tales como necrosis o apoptosis en la infeccion natural (7-9). Por esta razon, se ha sugerido que la fisiopatologia de la rabia se fundamenta mas en disfuncion neuronal que en dano morfologico tisular (10).

Por lo tanto, se requiere mas investigacion para entender los mecanismos basicos involucrados en esta enfermedad, por ejemplo, mediante el uso de metodos que aporten informacion mas alla de la que ofrece la histopatologia convencional (11). Una alternativa para el estudio histoquimico de patologias que afectan al sistema nervioso es el uso de marcadores de poblaciones neuronales, tales como las proteinas de union a calcio (CaBP, por sus siglas en ingles), conocidas ademas por ser reguladores metabolicos del calcio intracelular (11, 12). La inmunorreactividad de estas proteinas ha sido evaluada en el tejido nervioso de enfermedades neurologicas tales como el Alzheimer (13-15), el Parkinson, la corea de Huntington (15) y la esquizofrenia (16), asi como en casos de encefalitis por sida (17).

Dentro de las CaBP, la calbindina (CB) se destaca por su interaccion con proteinas involucradas en cascadas de senalizacion que usan el calcio como segundo mensajero (18, 19). La CB es comunmente encontrada en neuronas gabaergicas del SNC (11, 12, 20, 21) y hay evidencia experimental que sugiere efecto de la rabia sobre el sistema de neurotransmision gabaergica (22, 23). En estudios previos hemos reportado disminucion en la inmunorreactividad a CB, en diferentes areas del sistema nervioso de raton, como respuesta a la infeccion con el virus de la rabia (11, 21, 24, 25).

Una de las partes del sistema nervioso en la que faltaba evaluar el efecto de la infeccion sobre la expresion de CB era el cerebelo, estructura importante dentro del sistema motor (el mas afectado por la rabia) y cuyas celulas mas representativas, las celulas de Purkinje, son generalmente infectadas por el virus. Esto se evidencia porque en ellas se forman una gran cantidad de cuerpos de Negri (rasgo patognomonico de la infeccion por rabia), lo que las hace una de las celulas preferidas para el diagnostico histopatologico de la rabia (6, 7). Ademas, las celulas de Purkinje son las neuronas con mayor concentracion de CB en todo el sistema nervioso (26). Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la infeccion con virus de la rabia sobre la inmunorreactividad a CB en las celulas de Purkinje del cerebelo de ratones.

MATERIALES Y METODOS

Manejo de los animales e inoculacion del virus de la rabia

Se utilizaron hembras de ratones ICR-CD1 (Institute of Cancer Research--Linea CD1), de 4 semanas de edad, confinadas en el bioterio del Instituto Nacional de Salud (INS) en condiciones de temperatura y humedad controladas, y acceso libre a agua y alimento. Se utilizo virus de la cepa CVS (Challenge Virus Standard) a partir de una alicuota suministrada por el Laboratorio de Virologia del INS. Para reproducir el virus se siguio el procedimiento reportado por Koprowski (27), que consiste en la obtencion de diluciones seriadas a partir de la maceracion de cerebros de ratones lactantes previamente infectados con el virus por via intracerebral y su posterior titulacion (11).

Para llevar a cabo el estudio aqui propuesto, se inocularon 7 ratones por via intramuscular en las extremidades posteriores con una cantidad de 0,03 mL de dilucion 1/10 equivalente a 109 DL50. Cada animal infectado tuvo su respectivo control que correspondia a un animal inoculado con solucion vehiculo, (solucion diluyente sin el virus). Para todos los procedimientos se siguieron las normas eticas y legales requeridas para la investigacion con animales de laboratorio en Colombia (Ley 84 de 1989 y Resolucion No. 8430 de 1993 del Ministerio de Salud) y con aprobacion otorgada por el Comite de Etica del INS.

Extraccion, post-fijacion y preparacion del cerebelo

Los ratones inoculados con el virus y sus controles fueron sacrificados cuando los infectados alcanzaron la fase avanzada de la enfermedad, los 6 dias a partir de la inoculacion (caracterizada por presentar pelo erizado, superficie corporal muy fria, paralisis de las extremidades inferiores y perdida de peso acentuada). Para extraer los encefalos se anestesiaron los animales mediante una inyeccion de 0,2 mL de hidrato de cloral al 30% por via intraperitoneal (350mg/ Kg). A continuacion, se realizo la fijacion por perfusion intracardiaca, inicialmente con 50 mL de solucion amortiguadora de fosfatos salina (PBS) a pH 7,3 e inmediatamente despues con 100 mL de paraformaldehido (PFA) al 4%. Finalmente, se extrajeron los encefalos completos, se transfirieron a PFA al 4% y se conservaron a 4[grados]C hasta su procesamiento para inmunohistoquimica, una o dos semanas despues.

Se separaron los dos hemisferios con una cuchilla a lo largo de la cisura longitudinal. Luego se desprendio el cerebelo y se coloco en un vibratomo (Vibratome[R] 1000 Plus) en el que se realizaron cortes seriados, de 50 [micro]m de espesor, en plano sagital en direccion lateral a medial. Los cortes se recogieron con un pincel y se trasladaron a recipientes pequenos de vidrio (semejantes a cajas de Petri) dentro de los cuales se llevaron a cabo las reacciones inmunohistoquimicas. Los cortes se mantuvieron en flotacion y agitacion constante asi como a temperatura ambiente (20[grados]C) durante todo el procedimiento.

Inmunohistoquimica

Cada secuencia de dos cortes seriados se destino alternativamente para la inmunodeteccion de CB y de antigenos virales de rabia siguiendo el protocolo inmunohistoquimico basico publicado anteriormente (11, 28), el cual se resume asi: los cortes se lavaron tres veces con PBS a pH 7,3 (posteriores lavados se hicieron tambien con la misma solucion); se trataron con cloruro de amonio 0,05M durante 30 minutos para limpiar los aldehidos; se lavaron y se incubaron en peroxido de hidrogeno al 3% durante 30 minutos para bloquear la peroxidasa endogena; de nuevo se lavaron y se procedio a incubarlos en una solucion para bloquear sitios inespecificos y permeabilizar las membranas; esta solucion se componia de suero normal al 3%, albumina de suero bovino al 3% y triton al 10% durante 1 hora. A continuacion se retiro la solucion anterior, y sin lavar, los cortes se incubaron toda la noche en el anticuerpo primario: anti-CB (Sigma S9848 clon CB-955) en dilucion 1:2500 o en anticuerpo elaborado contra el virus de la rabia en dilucion 1:1000 (antisuero elaborado en conejo) (28).

Al dia siguiente los cortes destinados a la inmunorreaccion para CB se lavaron y se incubaron en anticuerpo secundario biotinilado (anti-raton IgG Sigma, 1:400), durante 2 horas y los cortes para inmunotincion de rabia se incubaron en anticuerpo biotinilado (anti-conejo IgG Sima, 1:600) durante 1 hora. Luego, todos los cortes se trataron con solucion ABC (complejo avidina-biotina-peroxidasa) (Vectastain) por 2 horas. Por ultimo, el revelado se llevo a cabo con el cromogeno diaminobenzidina (DAB) al 5%. Los cortes se extendieron en laminas portaobjeto previamente tratadas con gelatina al 1%, para facilitar su adherencia, se secaron a temperatura ambiente y se montaron con Entellan (Merck). El mismo procedimiento se utilizo para obtener controles negativos pero omitiendo los anticuerpos primarios o secundarios. Ademas, se hizo un segundo control negativo para la inmunohistoquimica del virus de la rabia en el que se aplico el protocolo completo a cortes de cerebelo de ratones no infectados (28).

Analisis cualitativo y cuantitativo

En primer lugar, se verifico la presencia de antigenos virales en las celulas de Purkinje en los cortes de cerebelo de los animales infectados. Luego se observaron los cortes procesados para inmunohistoquimica de CB para comparar el patron de marcacion de la proteina entre los controles y los infectados. Se enfoco la atencion a las caracteristicas morfologicas y la distribucion de las celulas de Purkinje positivas para CB. El analisis cuantitativo se llevo a cabo mediante densitometria optica (medicion del paso de luz a traves del tejido sometido a inmunotincion) en los cortes seleccionados. Para ello se realizo primero la captura y digitalizacion de imagenes en un microscopio Axiophot Zeiss, equipado con una camara Evolution VF-y software Q capture Pro 6.0. Despues se utilizo el programa Image J que cuenta con un sistema para obtener la medida de densidad optica promedio de acuerdo con una escala de grises en la que se miden los niveles de absorbancia de luz de los cortes (25).

Para llevar a cabo las mediciones se escogieron tres cortes por cada cerebelo (unidad experimental). Se seleccionaron las folias cerebelares II o III, con ayuda del atlas de Paxinos y Franklyn (29), por su facilidad de ubicacion y delineacion. En cada corte se seleccionaron 20 celulas de Purkinje de las folias II o III. En ellas se hicieron mediciones por separado de los cuerpos celulares (somas) y de sus correspondientes dendritas (midiendo campos de 0,1 [mm.sup.2] de la capa molecular). Tambien se midio la densitometria optica en la folia II completa; por lo tanto, se conto con estas 3 variables para comparar los datos entre los grupos de controles e infectados. En el analisis de los datos se utilizo la prueba no parametrica de Wilcoxon-Mann-Whitney para comparar los grupos de infectados y sus controles a traves del programa InfoStat (25).

RESULTADOS

Inmunorreactividad a antigenos del virus de la rabia en celulas de Purkinje

El antigeno viral se distribuyo ocupando todo el pericarion, el tronco dendritico principal y parte de las ramas secundarias de las celulas de Purkinje haciendo resaltar su morfologia neuronal (excepto el axon) dentro de la capa molecular. Ademas, se observaron abundantes inclusiones citoplasmaticas (cuerpos de Negri) tanto en los somas como en las dendritas principales de las celulas de Purkinje. En los controles no infectados apenas se evidencio un tenue "ruido de fondo" producido por la reaccion inespecifica del anticuerpo primario o del cromogeno (DAB) con algunos componentes del tejido nervioso (Figura 1).

Efecto de la infeccion sobre la expresion de CB en las celulas de Purkinje

Las imagenes panoramicas del cerebelo en el microscopio revelaron que solo las celulas de Purkinje fueron inmunorreactivas a CB. La distribucion de la proteina demarco la morfologia de estas neuronas, destacando su soma y su arborizacion dendritica, y acentuo la inmunorreactividad en la capa molecular de la corteza cerebelar (Figura 2). Esta inmunotincion fue homogenea en la mayor parte de las folias en todos los niveles observados, desde los cortes mas laterales hasta los del plano medial donde se localizaron las areas seleccionadas (folias II y III) para hacer las mediciones densitometricas. Al comparar las imagenes de las muestras de los controles con aquellas de los infectados, no se evidenciaron mayores diferencias, aunque en los infectados se notaron mas fragmentos de dendritas inmunorreactivas dentro de la capa molecular (Figuras 2B y D).

La evaluacion cuantitativa de la expresion de CB mediante densitometria optica no arrojo diferencia estadisticamente significativa entre la transmitancia de luz obtenida para los cortes de ratones control e infectados en la folia II (p>0,999), los somas de las celulas de Purkinje (p=0,335) y la arborizacion dendritica en la capa molecular (p=0,208) (Tabla 1), es decir, no hubo cambio significativo en la inmunotincion de CB, aunque las imagenes (Figuras 2 B y D) mostraron una tendencia al aumento de inmunotincion de CB en las celulas de Purkinje de los animales infectados.

DISCUSION

La demarcacion de la morfologia celular de las neuronas inmunorreactivas y la presencia de cuerpos de Negri abundantes demostraron que el virus infecto masivamente a las celulas de Purkinje como se habia descrito (28). Puesto que el virus se disemina por transporte axonal retrogrado, ingresa primero a los nucleos profundos del cerebelo desde la medula espinal (probablemente haciendo relevo en los nucleos vestibulares y reticulares) y luego es conducido por los axones de las celulas de Purkinje hasta la corteza cerebelar. Recientemente, se establecio en nuestro modelo animal que el virus llega a los nucleos profundos 64 horas despues de ser inoculado por via intramuscular en las extremidades posteriores y a las 72 horas ya se ha diseminado a las celulas de Purkinje, mientras que en areas mas distales como el hipocampo la infeccion fue detectada varias horas despues (30).

Del presente trabajo se destaca el hecho de no haber encontrado cambios estadisticamente significativos en la inmunorreactividad a CB de las celulas de Purkinje por efecto de la infeccion con el virus CV S de la rabia. Previamente, se habia demostrado perdida de inmunorreactividad a CB en la corteza cerebral (11,21) el estriado (21), el hipocampo (24) y la medula espinal (25) luego de la infeccion intramuscular con el mismo tipo de virus. Tambien es interesante anotar que el virus de la rabia, a pesar de infectar masivamente a las celulas de Purkinje, celulas tipicamente gabaergicas, no provoca en ellas una disminucion en la expresion de CB como si sucede, por ejemplo, con celulas gabaergicas de la corteza cerebral y el estriado que son tambien inmunorreactivas a CB.

Las celulas de Purkinje, aunque estan entre las neuronas mas frecuentemente infectadas por el virus de la rabia, parecen tener cierta resistencia a los efectos de la infeccion experimental con virus CVS en el modelo de raton. Esto se ha demostrado en estudios en los que se ha inducido apoptosis mediante inoculacion intracerebral del virus. Mientras otras neuronas principales que tambien son infectadas, como las celulas piramidales de la corteza cerebral y el hipocampo, sufren apoptosis, las celulas de Purkinje son poco susceptibles a ese tipo de muerte neuronal en la patologia de la rabia (31, 32).

Tampoco es raro que la CB presente diferencias en su inmunorreactividad en diferentes regiones del SNC afectado por una misma patologia. Por ejemplo, en la enfermedad de Alzheimer, la CB no parece afectarse en la corteza visual (13) pero disminuye su expresion en neuronas colinergicas del nucleo basal magnocelular (14) . En un estudio se encontro disminucion de la concentracion de CB en el nucleo basal con enfermedad de Alzheimer, en la sustancia negra con enfermedad de Parkinson y en el estriado con enfermedad de Huntington, pero no se presentaron cambios en la expresion de CB en la neocorteza y el cerebelo de las mismas muestras (15). Tambien es conocido el concepto de vulnerabilidad selectiva neuronal en las infecciones virales (33). Asi, por ejemplo, en tejido cerebral de pacientes con sida la CB sufre disminucion significativa de su inmunorreactividad en la corteza cerebral pero no en los nucleos basales ni en el hipocampo (17).

Otro aspecto que se debe tener en cuenta al evaluar el efecto de la rabia sobre la inmunorreactividad a CB en celulas de Purkinje de raton es que estas celulas tambien contienen una alta concentracion de otra importante proteina reguladora del calcio intracelular, la parvoalbumina (PV) y las dos moleculas interactuan metabolicamente (34); esto no ocurre en los otros tipos de celulas CB+ que han sido evaluados. La colocalizacion de estas dos proteinas simultaneamente en una misma neurona es poco frecuente (12, 34, 35). Ademas, el efecto de la rabia sobre la PV ha sido opuesto al observado en CB. La infeccion genera aumento en la expresion de PV en diferentes partes del sistema nervioso en el modelo de raton (11, 25), incluyendo las celulas de Purkinje (36).

La presencia de PV en estas neuronas podria interferir con el efecto de la infeccion sobre la expresion de CB.

Por ultimo, se podria especular que la CB presente en las celulas de Purkinje de raton tiene caracteristicas bioquimicas diferentes a las de otras neuronas inmunorreactivas a CB. Hay evidencia de que esto puede ocurrir con la CB bajo diferentes condiciones metabolicas (34, 35, 37); esto podria reflejarse en la respuesta de la proteina a la infeccion. Para resolver estas inquietudes es necesario emplear otros metodos bioquimicos y moleculares que aporten al conocimiento de la expresion de CB y otras CaBP en respuesta a la infeccion con el virus de la rabia.

En un estudio reciente se reporto perdida de CB en celulas de Purkinje de bovinos afectados por rabia (38). Esta diferencia con ratones se puede sustentar en que la distribucion y tipologia de las celulas inmunorreactivas a las CaBP (incluyendo CB) difieren notablemente entre los artiodactilos y los ordenes de mamiferos que han sido mas estudiados: roedores, carnivoros y primates, los cuales son mas afines entre si (39). Por esta razon, los resultados experimentales con especies de estos ultimos taxones son mas extrapolables a lo que sucede con el sistema nervioso humano (40).

FINANCIACION

Este trabajo fue financiado con recursos del Departamento Administrativo de Ciencias, Tecnologia e Innovacion COLCIENCIAS y el Instituto Nacional de Salud (INS, Colombia). Proyecto Codigo 210454531601, Contrato 378 de 2011.

DOI: 10.17151/biosa.2016.15.2.2

Recibido: junio 27 de 2016--Aceptado: agosto 16 de 2016

CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran no tener ningun conflicto de interes relacionado con este articulo.

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Julian Ricardo Naizaque G. [1]

Orlando Torres-Fernandez. [2]

[1] Biologo, Estudiante de Maestria en Neurociencias. Laboratorio de Microscopia, Grupo de Morfologia Celular, Instituto Nacional de Salud (INS). Bogota, Colombia. Correo: jrnaizaqueg@unal.edu.co

[2] Biologo, Magister en Morfologia, Doctor en Ciencias Biomedicas. Laboratorio de Microscopia, Grupo de Morfologia Celular, Instituto Nacional de Salud (INS). Bogota, Colombia. Correo: otorresf@ins.gov.co

Leyenda: Figura 1. Inmunohistoquimica para rabia en muestras de cerebelo de ratones. A. Imagen panoramica de un corte sagital de cerebelo en un animal control. Apenas se nota un "ruido de fondo" producido por la reaccion inespecifica del cromogeno con el tejido nervioso (2, 5X). B. Inmunorreactividad a los antigenos del virus sobre la folia VIII en el cerebelo de un raton infectado con rabia. La inmunotincion se concentra en los somas de las celulas de Purkinje y su arborizacion dendritica dentro de la capa molecular (2,5X). C. Celula de Purkinje positiva para rabia. La inmunotincion demarca gran parte de la morfologia neuronal. Las flechas indican inclusiones intracitoplasmaticas (cuerpos de Negri) (40X). m: capa molecular; g: capa granular.

Leyenda: Figura 2. Inmunorreactividad para CB en muestras de cerebelo de ratones. A. Folia III del cerebelo de un raton control a nivel del nucleo fastigiado y el cuarto ventriculo (10X). B. Folia III del cerebelo de un raton infectado con el virus de la rabia a nivel del nucleo fastigiado y el cuarto ventriculo (10X). C. Detalle en mayor aumento de la corteza cerebelar en una muestra control. Es evidente la inmunorreactividad en las celulas de Purkinje (40X). D. Detalle en mayor aumento de la corteza cerebelar en una muestra de raton infectado (40X). Notese una tendencia a la mayor inmunotincion en los infectados. m: capa molecular; g: capa granular.
Tabla 1. Valores de la densitometria optica (inmunorreactividad a CB)
en la corteza del cerebelo de ratones infectados con rabia y los
controles. La medicion se realizo en celulas de Purkinje
individuales, en segmentos de la capa molecular, donde la
inmunorreactividad esta determinada por las dendritas de las celulas
de Purkinje y en campos que abarcaron la folia II completa. Cada dato
corresponde al promedio de mediciones tomadas en tres cortes por cada
muestra. Los valores se encuentran dentro de una escala que va desde
0 (muy oscuro o 0% de luz transmitida) hasta 255 (transparente o 100%
de luz transmitida).

MUESTRA    Celulas de Purkinje            Capa molecular

           Control        Infectado       Control

1          89,33          105,34          139,95
2          97,11          110,26          148,15
3          81,30          99,70           128,85
4          89,58          99,88           138,07
5          90,99          86,23           132,09
6          87,43          104,66          132,17
7          104,44         86,95           166,14
Promedio   91,45          99,00           140,77
DS         [+ o -] 7,4    [+ o -] 9,21    [+ o -] 12,9
           p=0,2086                       p=0,3351

MUESTRA    Capa molecular   Folias

           Infectado        Control          Infectado

1          141,24           146,80           127,85
2          162,59           149,72           156,93
3          146,84           117,46           130,44
4          143,76           138,62           134,13
5          132,17           130,55           132,88
6          137,26           126,99           136,53
7          156,59           172,96           149,61
Promedio   145,78           140,44           138,34
DS         [+ o -] 10,67    [+ o -] 18,23    [+ o -] 10,77
                            p>0,999
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Author:Naizaque G., Julian Ricardo; Torres-Fernandez, Orlando
Publication:Biosalud
Article Type:Ensayo
Date:Jul 1, 2016
Words:5062
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