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La genotipificacion y fenotipificacion de la resistencia del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) a los farmacos antirretrovirales.

Los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) son miembros del genero de los Lentivirus de la familia Retroviridae que pueden infectar tanto a humanos como a primates (1). Hasta el momento se han identificado dos miembros dentro de los Lentivirus que infectan a humanos, el VIH-1 y el VIH-2. El VIH-1 es el mas extendido en el mundo. De acuerdo con el informe de Barcelona de UNIAIDS se estima que a diciembre de 2002 habia 42 millones de personas en el mundo infectadas por el VIH-1; aproximadamente la mitad de ellas en el Subsahara africano. En 1986, se identifico el VIH-2 a partir de 2 pacientes africanos con SIDA que no presentaban reactividad serologica frente al VIH-1, el agente clasico de la enfermedad2. La distribucion del VIH-2 es mas restringida geograficamente, teniendo su epicentro en Africa Occidental (Guinea-Bissau, Senegal, Costa de Marfil y Camerun), aunque tambien existe y se propaga lentamente en la India, Portugal, Angola, Mozambique y Brasil.

El aumento de la capacidad de accion antiviral, facilitado por el desarrollo de nuevos farmacos, ha incrementado la frecuencia de mutantes virales resistentes. Esto desde el punto de vista terapeutico es un inconveniente, porque compromete el exito de la terapia antirretroviral. Como una aproximacion hacia un diseno mas racional y personalizado de la terapia antiviral, se han estudiado los cambios mutacionales producidos por la accion de drogas antivirales sobre los genes que codifican por la retrotranscriptasa (RT) y la proteasa (P) del virus. La determinacion sistematica de estas mutaciones resistentes ha ayudado al diseno de pruebas que permiten conocer el estado genetico, en cuanto a resistencia antiviral, de las variantes que tiene un individuo infectado. Este conocimiento teorico a priori, permite el manejo terapeutico personalizado que asegura un mayor exito en el tratamiento del SIDA/ VIH. En esta revision se hara una descripcion de las bases geneticas de la resistencia, de los metodos para determinarla y su aplicacion en el manejo integral del individuo infectado por el VIH-1. Finalmente se dara una vision personal y critica del problema en Colombia.

LA VARIACION GENETICA DEL VIH-1

La gran heterogeneidad genetica del VIH-1 es el resultado de la elevada tasa de mutacion que se genera durante la replicacion del ARN viral. La tasa de mutacion se define como el numero de bases incorrectamente incorporadas por nucleotido y por ciclo de replicacion. Representa el numero de veces que la ARN polimerasa incorpora un nucleotido erroneo y es del orden de [10.sup.-3]-[10.sup.-5] sustituciones/nucleotido/ciclo replicativo en virus ARN (3-5). La razon principal de la alta tasa de mutacion es que las ARN polimerasas y las retrotranscriptasas (RT) carecen de una actividad exonucleasa 3'-5' denominada actividad editorial (4,5), asi se incrementa la probabilidad de incorporacion equivoca de nucleotidos cuando se compara con las ADN polimerasas que, por lo general, tienen mecanismos de correccion y reparacion (4). La variacion genetica en los virus ARN no solo puede ocurrir por mutaciones puntuales (transiciones y transversiones), sino tambien por adiciones y deleciones, por recombinacion homologa y no homologa y por reordenamiento de segmentos genomicos (6).

Las poblaciones de virus ARN replican como distribuciones complejas de genomas diferentes pero geneticamente relacionadas, denominadas cuasiespecies (6,7). Toda poblacion de virus ARN presenta una secuencia definida estadisticamente llamada secuencia promedio o consenso, que tiene en cada posicion el nucleotido mas frecuente del conjunto de moleculas de la poblacion. Cada genoma viral puede diferir del consenso en un numero distinto de posiciones nucleotidicas. Las cuasiespecies constituyen un reservorio de variantes virales, que representan un amplio rango de fenotipos con respecto a virulencia, tropismo, cinetica de replicacion y composicion antigenica.

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El tamano poblacional es de gran importancia en la heterogeneidad genetica. En un individuo infectado por el VIH-1 puede existir del orden de [10.sup.9] a [10.sup.12] viriones (8), siendo el recambio de viriones y de celulas infectadas muy elevado (9,10). Por tanto, el control de las enfermedades infecciosas causadas por virus ARN, entre ellas el SIDA/VIH, constituye una tarea dificil por la gran plasticidad genetica y el enorme potencial evolutivo del VIH-1 y 2 (11).

Las cepas del VIH-1 que circulan alrededor del mundo presentan gran heterogeneidad de genotipos y de subtipos virales12 (Mapa 1). Los analisis filogeneticos obtenidos con base en sus secuencias genicas, principalmente de los genes pol y env, han revelado dos grandes grupos dentro del VIH-1: el grupo M ("main" o principal), subdividido en 10 subtipos hasta el momento (A-J) y el grupo O ("outlier"), con varios aislados muy divergentes entre si (12-14) (Grafica 1). Para el VIH-2 se han descrito 6 subtipos (AF) (15,16). El subtipo A del VIH-1 y en menor medida el B, son los mas frecuentes a nivel mundial. Los subtipos C, D y E, y quiza el F, podrian comportarse como no patogenicos en el ser humano. La gran expansion actual del VIH permite prever la aparicion de mas variantes del VIH-1 y del VIH-2 en el futuro (17).

La variacion en la secuencia de aminoacidos de la proteina gp 120 entre los subtipos del VIH-1 es mayor que la observada en un mismo individuo o en un subtipo (18,19). Dentro de un mismo subtipo, los aislados varian entre 3% y 23% en su secuencia de nucleotidos. La divergencia genetica entre distintos subtipos del VIH-1 oscila en torno a 20% y 30% dentro del grupo M, y en mas de 35% entre los aislados del grupo M y del O, si consideramos la secuencia genetica del gen env que codifica a las proteinas de superficie (19). Los virus del grupo O del VIH-1 presentan un grado de variabilidad mayor, aunque no han sido clasificados en subtipos por el bajo numero de aislados caracterizados hasta la fecha (20). La divergencia genetica entre los subtipos del grupo M es de 14% en la region gag (21). Ademas, las secuencias nucleotidicas del VIH-1 identificadas hasta ahora solo tienen 50% de homologia con las del VIH-2 (12). Las distancias geneticas entre subtipos son, en promedio, dos veces mayores que para aislados separados del mismo subtipo (22). Los subtipos de la mayoria de los aislados del VIH-1 son congruentes para gag y env (12); sin embargo, los subtipos E y G son variantes mosaico, esto es, con env de E y G, respectivamente, pero gag de A.

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Todos los subtipos del VIH-1 y del VIH-2 se transmiten por via sexual, parenteral y vertical, aunque con diferente eficiencia. De igual modo, todos pueden causar manifestaciones clinicas en las personas infectadas, aunque el VIH-2 es menos virulento, los aislados del subtipo C del VIH-1 apenas inducen formacion de sincicios, una propiedad asociada con mayor virulencia; sin embargo, el curso de la enfermedad no es mas favorable en estos pacientes que en los infectados por otros subtipos.

RESISTENCIAS DEL VIH AL TRATAMIENTO ANTIRRETROVIRAL

Desde el punto de vista genetico los virus estan provistos de una gran capacidad de adaptacion a los cambios introducidos en su medio natural. El VIH fundamenta esta cualidad en diversos mecanismos, entre los que cabe destacar cuatro:

1. La retrotranscriptasa que carece de actividad exonucleasa 3'? 5', que actua como correctora de errors (23).

2. Tanto las proteinas estructurales como aquellas con actividad funcional poseen una notable plasticidad functional (8,24).

3. El virus presenta una alta tasa de replicacion, que permite generar del orden de 10 (10) <<nuevos>> viriones cada dia (8).

4. Esta bien documentado que en un determinado momento coexisten en cada persona infectada todas las posibles cuasiespecies del VIH-1 (6,11).

Por la notable heterogeneidad genetica del VIH se producen procesos evolutivos, como la mutacion que dara paso a la seleccion de cuasiespecies en virtud de su capacidad de supervivencia en un ambiente <<hostil>> (un medicamento antiviral), generandose por tanto un proceso de seleccion de aquellas que presenten caracteristicas de supervivencia mas favorables en estas circunstancias (3). Como las mutaciones aparecen de forma espontanea y simplemente se seleccionan bajo la presion selectiva de los farmacos, actualmente el VIH-1 tiene capacidad de desarrollar resistencias frente a todos los antirretrovirales disponibles e incluso una capacidad potencial frente a moleculas que estan por disenarse (25-27).

La resistencia en sentido amplio se define como cualquier cambio que mejore la replicacion del VIH en presencia de un inhibidor (28). Es importante tener en cuenta que el concepto de resistencia es relativo, porque si se parte de un inoculo lo suficientemente pequeno y se usa un farmaco en concentracion suficiente, un virus resistente podria presentarse como sensible. En terminos especificos, la resistencia del VIH al tratamiento antirretroviral consiste en un fenotipo alterado como resultado de un cambio en el genotipo viral que se puede detectar tanto in vitro como in vivo (29).

Epidemiologicamente se puede hablar de resistencias primarias y secundarias (11,29). Son resistencias primarias cuando se encuentran en virus de pacientes que no han sido tratados previamente, lo que implica que la infeccion se ha adquirido a partir de cepas de VIH-1 resistentes. Por el contrario, se trata de resistencias secundarias cuando aparecen en la poblacion viral de un paciente como consecuencia de la presion selectiva ejercida por la exposicion a farmacos antirretrovirales.

TIPOS DE MUTACIONES ASOCIADAS CON LA RESISTENCIA

La resistencia farmacologica al VIH-1 surge frente a la terapia antirretroviral de supresion viral incompleta y limita ampliamente el exito a largo plazo de la terapia. Se conocen como mutaciones primarias aquellas alteraciones en el material genomico que una vez expresadas daran lugar a cambios en el sitio activo de la enzima, pues afectan la afinidad de esta por su sustrato. Habitualmente se seleccionan pronto en el curso del tratamiento por la presion selectiva ejercida por el farmaco, en un intento de evadir su accion inhibidora del medicamento (30). Las mutaciones secundarias se van acumulando en el genoma viral que ya posee mutaciones primarias con la finalidad de restaurar la ventaja cinetica que ha pagado la enzima por la mutacion primaria. Son seleccionadas por la ventaja replicativa que confieren y la mejora de la afinidad por el sustrato natural de la enzima. Por si mismas, estas mutaciones secundarias poseen un efecto minimo o nulo en la magnitud de la resistencia al tratamiento antiretroviral (30).

Tanto la transcriptasa reversa como la proteasa del VIH-1 han sido seleccionadas como potenciales blancos terapeuticos para su inhibicion mediante farmacos. Actualmente existen una serie de medicamentos inhibidores que se han clasificado como nucleotidos/ nucleosidos analogos de la RT (NRTI), no nucleosidos inhibidores de la RT (NNTRI) y los inhibidores de la proteasa (PI).

La transcriptasa reversa retroviral es una ADN polimerasa dependiente de moldes de ARN que cataliza la sintesis del ADN proviral. La enzima es un heterodimero conformado por las subunidades p66 y p51. La subunidad p51 posee 440 residuos de aminoacidos mientras que la p66 tiene 560 residuos. Aunque p51 y p66 comparten 440 residuos sus plegamientos tridimensionales son diferentes. La subunidad p66 contiene los sitios de union a la curvatura del ADN sustrato y el sitio activo que cataliza la formacion de enlaces fosfodiester entre nucleotidos 5'-trifosfato (dNTP) libres y el extremo 5' de la cadena de ADN que esta siendo sintetizada; por el contrario la p51 no tiene ninguna actividad catalitica y sirve como andamio para la actividad enzimatica de la p66. La subunidad p66 tiene cinco subdominios que incluyen los de los dedos, la palma y la muneca que participan activamente en la reaccion de polimerizacion, ademas de los subdominios conector y de ARNsa H. La mayoria de las mutaciones resistentes se localizan en la region de la polimerasa 5' y en particular en los dedos y en la palma (31,32). En la Grafica 2a y b se presentan las principales mutaciones que cambian codones de la secuencia de aminoacidos de la RT salvaje y que exhiben resistencia a los NRTI (zidovudine, didanosine, zalcitibine, stavudine, lamivudine, y abacavir) y a los NNRTI (nevirapine, delavirdine y enfavirenz).

El tenofir disoproxil fumarato (Tenofir DF) es el unico nucleotido analogo inhibidor de la RT que ha sido aprobado por la FDA. Recientemente se han presentado resultados de los ensayos clinicos de este inhibidor y de un analisis integrado de resistencia genotipica (33,34). Los estudios 902 y 907 eran de caracter aleatorizado y controlados con placebo en pacientes con carga viral mayor de 400 copias/ml que recibieron terapia antirretroviral estable mas de 8 semanas y luego anadieron a su regimen tenofovir DF o placebo. Despues de 24 semanas, se cambio de grupo a los pacientes asignados a placebo para que recibieran tenofovir DF. Hasta el momento se dispone de datos a la semana 48 de terapia con tenofovir DF de 333 pacientes que inicialmente recibieron el farmaco y de 103 que cambiaron desde placebo a tenofovir DF. Se determino una resistencia extendida a nivel basal, pues casi 75% de los pacientes tenia MAT. En conjunto, la reduccion de la carga viral media despues de 48 semanas de terapia fue aproximadamente de 0.6 [log.sub.10] copias/ml (una reduccion de 4 veces).

Los pacientes con la mutacion L210W presentaban un indice de respuesta marcadamente inferior y una disminucion de la susceptibilidad fenotipica. La L210W fue casi siempre encontrada en asociacion con la T215Y (en mas de 98% de los casos) o la M41L (en mas de 94%); por ello, la presencia de la L210W era diagnostico de 3 o mas MAT, incluyendo la M41L y la L210W. Los indices de respuesta en pacientes con un patron alternativo de MAT (la D67N, la K70R y las K219Q/E/N) funcionaron mucho mejor, con solo cambios menores en la susceptibilidad fenotipica. La mutacion M184V asociada con la resistencia a la lamivudina se relaciono con un aumento de la respuesta virologica 35. Esta pendiente por determinar que importancia tienen para tenofovir otros patrones de mutaciones de ITIN observados con frecuencia junto con otras mutaciones identificadas recientemente como importantes para la respuesta de los ITIN como la 69D, la 44D y la 118I (36,37).

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La proteasa del VIH-1 es la enzima responsable por el procesamiento postraduccional de la poliproteinas precursoras virales gag y gag-pol que generan las proteinas estructurales del virion y las enzimas retrovirales respectivamente. La enzima es una aspartico proteasa compuesta por dos monomeros identicos no covalentemente asociadas con 99 residuos (38). Su sitio activo contiene una triada catalitica conformada por Asp-Thr-Gly en las posiciones 25 a 27.

En la actualidad existen seis inhibidores de la proteasa que aprobados por la FDA: amprenavir, indinavir, lopinavir (manufacturado en combinacion con ritonavir), nelfinavir, ritonavir y saquinavir. El espectro de mutaciones seleccionadas por el tratamiento con estos inhibidores sobre la proteasa esta bien caracterizado y se resume en la Grafica 3.

JUSTIFICACION DE LA DETERMINACION DE RESISTENCIAS DEL VIH

Para el tratamiento de la infeccion por el VIH-1 se han aprobado 16 medicamentos antirretrovirales: 7 son analogos de nucleotidos/nucleosidos que son inhibidores de la RT (NRTI); 6 inhibidores de la proteasa (PI) y 3 son no nucleosidos inhibidores de la RT NNRTI). En individuos que no han sido tratados previamente, el empleo de dos o mas combinaciones de clases de inhibidores, terapia de alto rendimiento HAART), produce una prolongada supresion y una reconstitucion inmunologica.

Numerosos estudios retrospectivos realizados a lo largo de los anos han demostrado la correlacion entre la presencia de mutaciones y el fracaso terapeutico (37,38). Recientemente se han llevado a cabo estudios prospectivos que comparan la evolucion de pacientes distribuidos en dos cohortes: en un grupo pacientes tratados segun recomendaciones empiricas generales y en el otro pacientes cuyo tratamiento es guiado por los resultados de las pruebas de resistencia al tratamiento antirretroviral. Los resultados de este ultimo tipo de estudios avalan la realizacion de dichas pruebas para la seleccion del tratamiento mas eficaz en los pacientes previamente tratados en los cuales no se han obtenido respuesta virologica completa (39). En el Cuadro 1 se muestran los principales ensayos aleatorizados controlados que han demostrado el impacto a corto plazo de la deteccion de resistencia a los antirretrovirales (38).

PRUEBAS PARA LA DETERMINACION DE RESISTENCIAS

Existen dos grandes grupos de tecnicas para la determinacion de resistencias del VIH al tratamiento antirretroviral: las genotipicas y las fenotipicas (Cuadro 2). Las pruebas genotipicas tienen como base el analisis del genoma y por tanto encuentran la presencia de mutaciones. En funcion del principio en que se basen, el numero de mutaciones detectables es distinto. Las tecnicas que utilizan la secuenciacion detectan todas las mutaciones presentes en las regiones del genoma del VIH que codifican para la retrotranscriptasa y para la proteasa. Cuando el fundamento de la tecnica es la hibridacion, solo se encuentra determinado numero de mutaciones de significacion conocida (40).

Las pruebas fenotipicas consisten en sistemas de replicacion in vitro que enfrentan al virus con diferentes concentraciones de farmacos antirretrovirales (Cuadro 2). El grado de inhibicion del crecimiento se establece por comparacion con una cepa de referencia (41).

PRUEBAS GENOTIPICAS COMERCIALES

Existen tres pruebas genotipicas comerciales, la secuenciacion directa de ARN retroviral y dos tecnicas basadas en la hibridacion (LiPA[TM] y GeneChip[TM]), cuyo fundamento se describe brevemente a continuacion.

Secuenciacion. El principio general de esta tecnica consiste en la obtencion de moleculas de ADN un nucleotido mas largo que la precedente y su posterior separacion mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de alta resolucion (42).

En la actualidad, aunque el principio basico no ha cambiado, las tecnicas modernas de secuenciacion se derivan del metodo de Sanger (43), segun el cual en lugar de fraccionar el ADN en cuestion, se procede a la sintesis de pequenos fragmentos a partir de la cadena molde. Esta sintesis tiene una peculiaridad, que es la incorporacion de nucleotidos terminadores de cadena. Estos nucleotidos en realidad son didesoxinucleosidos- 5'-trifosfato (ddNTP), es decir, carecen de grupo hidroxilo (OH) en posicion 3', que es fundamental para la elongacion de la cadena, porque es precisamente en esta posicion donde la polimerasa inserta el siguiente nucleotido durante la sintesis de ADN. La adicion de la proporcion adecuada de nucleotidos naturales con respecto a estos didesoxinucleotidos dara lugar a la sintesis de fragmentos de diversos tamanos.

Para secuenciar el VIH se pueden adoptar dos estrategias: la secuenciacion del genoma proviral integrado en los linfocitos, que ya esta como ADN, o la realizacion de una retrotranscripcion previa de ARN viral plasmatico, para obtener una coleccion de cADN retrovirales. Para poder obtener secuencias confiables, un requisito fundamental es la idoneidad del material de partida, tanto en pureza como en cantidad. Para garantizar este aspecto se realiza, en primera instancia, una PCR <<anidada>>, que no es otra cosa que dos PCR seguidas, de forma que el amplificado conseguido es mucho mas abundante que si se realizase una PCR ordinaria. Tras la obtencion del material genetico suficiente se procede a la purificacion del amplificado para eliminar restos de iniciadores, sales, enzimas, nucleotidos, etc.

Una vez obtenidos todos los fragmentos se procede a su separacion electroforetica, que se realiza de forma automatizada en un secuenciador; esta puede ser segun la clasica PAGE de alta resolucion o mediante electroforesis capilar. Independientemente de la tecnica de electroforesis acoplada al secuenciador, los fragmentos se separaran en funcion de su tamano molecular. Las senales se recogen en un procesador electronico acoplado al secuenciador y este deduce la secuencia por comparacion de los fragmentos solapantes, de manera que esta secuencia en realidad es una secuencia consenso que representa las secuencias de las subpoblaciones virales mayoritarias.

Para determinar la presencia de mutaciones que confieren resistencia a los antirretrovirales se extrae el genoma de una muestra del paciente y se procede a su secuenciacion. Una vez obtenida la secuencia del VIH de la muestra problema, la secuencia obtenida del gen RT o de la proteasa se compara con las correspondientes secuencias de una cepa salvaje del VIH prototipo no resistente utilizando un programa informatico acoplado al secuenciador (44,45).

LiPA[TM]. El fundamento de esta tecnica es una hibridacion reversa post-PCR (45-47). El soporte de la hibridacion consiste en tiras de nitrocelulosa con sondas de oligonucleotidos especificos inmovilizadas en lineas paralelas. Estas sondas son complementarias a la secuencia de mutaciones conocidas que confieren resistencia a los farmacos antirretrovirales. La amplificacion de la muestra se realiza con oligonucleotidos cebadores biotinilados que permitiran el revelado de la reaccion. Despues de la hibridizacion se anade un conjugado compuesto por estreptavidina-fosfatasa alcalina, que se unira a cualquier hibrido formado sobre la tira. Al anadir el sustrato de la enzima se producira un precipitado marron-purpura en las posiciones correspondientes.

VIH GeneChip[TM] (Affimetrix). A pesar de que el fundamento de esta tecnica es una hibridacion, el resultado final es la secuenciacion del material amplificado a partir de la muestra. El soporte de hibridacion son microarreglos de ADN o <<chips>> de silicio que contienen un <<biblioteca combinatoria>> de sondas, que consiste en una gran cantidad de oligonucleotidos solapantes (409.000/1.28 [cm.sup.2]). La hibridacion de estos microarreglos con cADN retroviral va a permitir identificar el nucleotido presente en cada posicion de la secuencia a analizar (48,49). Como los productos de RT-PCR estan marcados, permitira deducir la secuencia la deteccion de fluorescencia tras la hibridacion mediante barrido de laser e integracion de las senales obtenidas con un programa informatico. Una ventaja de esta tecnica es que permite el analisis simultaneo de un elevado numero de muestras.

Pruebas fenotipicas comerciales. Como las pruebas genotipicas son una medida indirecta, pues la presencia de mutaciones no siempre implica su expresion, las pruebas fenotipicas deberian ser el primer escalon natural en la deteccion de resistencias (50,51). Basicamente estas tecnicas consistian en el cocultivo de linfocitos del paciente con lineas celulares linfoides, como MT2 y MT4, en presencia de farmacos antirretrovirales (52). Transcurridas unas semanas se media la replicacion viral por la produccion de antigeno p24 o la actividad retrotranscriptasa. Estas tecnicas tienen varias limitaciones e inconvenientes como son la laboriosidad, altos costos, la infraestructura necesaria, el largo tiempo requerido y la falta de estandarizacion. Todo esto ha sido resuelto en parte por las tecnicas de virus recombinantes (RVA) (53).

Las tecnicas de virus recombinantes determinan la concentracion que inhibe 50% de la infectividad ([IC.sub.50]) y la comparan con la [IC.sub.50] de una cepa de referencia o de un aislamiento anterior de un mismo paciente. Actualmente, existen dos tecnicas comerciales que se diferencian sobre todo en los siguientes aspectos:

1. Sistema de produccion del virus recombinante.

2. Mecanismo de deteccion de la replicacion viral.

3. Valor umbral de carga viral requerido.

4. Tiempo de realizacion.

5. Cepa de referencia.

6. Punto de corte.

Entre las principales ventajas que presentan las pruebas fenotipicas de resistencia a los farmacos antirretrovirales estan su capacidad para medir directamente la sensibilidad al farmaco en cuestion, de forma importante aportan informacion sobre resistencias cruzadas, que se pueden aplicar a cualquier molecula y que son relativamente faciles de interpretar.

Limitaciones de las pruebas de deteccion de resistencias. Una precaucion importante para tener en cuenta a la hora de tomar las muestras para determinar resistencia, es asegurar que en ese momento el paciente continua con el tratamiento que supuestamente ha fracasado. Algunos autores (54) recomiendan que el plazo maximo transcurrido entre el cese del tratamiento y la deteccion de resistencias no supere los 15 dias, pues el rapido recambio de la poblacion viral conduciria a un predominio de subpoblaciones salvajes que daria lugar a falsos negativos en la determinacion de resistencias (55).

Dentro de las limitaciones que en general presentan estas tecnicas, independientemente del principio en que se basen, esta la proporcion minima que debe representar una subpoblacion determinada con respecto al global de la muestra (56). A pesar de que varia en funcion de la sensibilidad de la tecnica, se puede decir que se necesita una proporcion de 20% para que esa subpoblacion este representada en el conjunto y por tanto sea detectable. Ademas, se requiere un umbral de carga viral minimo para garantizar la obtencion de resultados fiables, que por lo general se establece en 1.000 copias de ARN/ml, aunque algunas tecnicas aseguran que se podria rebajar este umbral a 500 copias de ARN/ml (Cuadro 3).

Como ya se ha dicho, ambos tipos de tecnicas de determinacion de resistencias poseen ventajas y desventajas, pero en principio las genotipicas parecen mas rapidas, asequibles y baratas, aunque utilizar sus resultados para predecir la respuesta a los farmacos puede resultar un poco prematuro por varios factores: presencia de mezclas de subpoblaciones no determinadas, conocimiento incompleto de las mutaciones que confieren resistencia, interaccion de diferentes mutaciones, resistencias cruzadas y respuesta variable a los farmacos en funcion de los pacientes. Por eso, es necesario definir mejor el valor predictivo de este tipo de tecnicas. Por el contrario, las fenotipicas son una medida directa de la resistencia, pero su interpretacion tambien es dificil. Poseen la ventaja de determinar la influencia de mutaciones multiples en el genoma, a diferencia de las tecnicas genotipicas, pero tambien por ello puede quedar enmascarado el papel individual de una mutacion determinada. Otro inconveniente es que para llegar a determinar fenotipicamente una resistencia es necesario que una proporcion suficientemente grande de la muestra posea algunas mutaciones (Cuadro 3).

RECOMENDACIONES PARA EL MANEJO DE LAS PRUEBAS DE RESISTENCIA

Desde diferentes organizaciones internacionales se han emitido recomendaciones para la deteccion de resistencias a los antirretrovirales. Entre las guias internacionales se destacan cuatro como ineludibles: las emitidas por el Department of Health and Human Services (DHHS) de los Estados Unidos (57), las de la British HIV Association (58), las publicadas por Hirsch et al. (59) y por Schinazi et al. (60)

La incorporacion selectiva de las tecnicas genotipicas a la practica asistencial tiene interes, primero, por el beneficio individual de cada paciente, pues su filosofia es optimizar e individualizar el tratamiento. En sentido colectivo, esta incorporacion tambien tiene utilidad pues permite conocer la <<epidemiologia>> de las cepas resistentes del VIH, incidir en la mejor utilizacion del arsenal terapeutico disponible e intentar disminuir el riesgo de aparicion de resistencias potencialmente transmisibles.

Aspectos pendientes. Desde el punto de vista de los presentes autores existen al menos seis aspectos relativos con la determinacion de resistencias del VIH cuyo esclarecimiento debe ser prioritario (Cuadro 4). Es preciso establecer cuales son los beneficios constatables a largo plazo en terminos de evolucion virologica. A continuacion se delimitara en que situaciones debe optarse por una prueba genotipica o fenotipica. En tercer lugar, convendria describir las caracteristicas intrinsecas de sensibilidad de las diversas tecnicas para detectar subpoblaciones virales minoritarias. Es tambien oportuno disponer de un metodo de evaluacion especifico para delimitar las resistencias atribuibles a cada farmaco en el contexto de regimenes combinados. Otro punto pendiente de resolucion es establecer la cadencia de las determinaciones de resistencias y las resistencias cruzadas. En ultima instancia, parece inexcusable impulsar estudios de costo-efectividad en la aplicacion asistencial de las pruebas de resistencia.

Uno de los aspectos relativos con la determinacion de resistencias que por su trascendencia requiere un tratamiento especial, es la interpretacion de los resultados de estas tecnicas (61). No existe una pauta acerca de cual sea la mejor interpretacion de las pruebas. Entre las posibilidades disponibles se encuentra la interdisciplinaria, que implica la participacion de microbiologos, clinicos y farmacologos (62) y los sistemas basados en reglas generadas por la evidencia cientifica y la realizacion del denominado <<fenotipo virtual>> (Virco[TM]), que es una algoritmo de busqueda por confrontacion de las mutaciones generadas por un tratamiento en una gran base de datos que correlaciona una determinada mutacion con un fenotipo resistente especifico. En la practica se usan estos tres tipos de interpretaciones, que probablemente aportan sus beneficios, pero se necesitan estudios que las comparen con el fin de hallar el mejor metodo.

Tanto las pruebas genotipicas como las fenotipicas presentan problemas a la hora de interpretar sus resultados. Las pruebas genotipicas aportan informacion sobre <<posibles>> resistencias, en el sentido de que no se puede garantizar la expresion de las mutaciones determinadas y por ello requieren guias de interpretacion basadas en la mejor evidencia cientifica disponible (63). Ademas, estas tecnicas poseen mayor valor para descubrir resistencias, considerando las mutaciones presentes, que para predecir sensibilidad seria necesario descartar todas las posibles causas de resistencia.

Un hecho que reviste especial dificultad es la interpretacion de patrones de varias mutaciones, multirresistencia64. Por su parte, las tecnicas fenotipicas constituyen una medida de la replicacion viral en presencia de farmacos antirretrovirales y esta responde a diversos factores, unos conocidos y otros no (60). Ademas, en este sentido, los puntos de corte para determinar la resistencia no estan ni bien definidos ni clinicamente validados. Otro factor que dificulta la interpretacion de los resultados es el desconocimiento de los niveles minimos requeridos in vivo para lograr la supresion de la replicacion viral (65), que resulta aun mas complejo en el caso de los inhibidores de la retrotranscriptasa analogos de nucleosido, pues estos se activan por trifosforilacion en la celula blanco, de manera que la concentracion activa de farmaco ha de medirse en el interior de la celula, con la dificultad que esto entrana. Se debe considerar el hecho de que existen distintas causas del fracaso del tratamiento antirretroviral: el paciente, el farmaco y el VIH. La principal causa de fracaso atribuible al paciente es el mal cumplimiento de la pauta prescrita. De los aspectos relativos al farmaco se destaca, tanto parametros farmacocineticos como otros factores farmacologicos. Dentro de los primeros, el mas directamente asociado al fracaso es una absorcion insuficiente del farmaco, que condicionara concentraciones plasmaticas subterapeuticas. Con respecto a los factores farmacologicos, se encuentran circunstancias asociadas con el fracaso virologico como una insuficiente potencia antiviral intrinseca de la combinacion de farmacos, interacciones de antirretrovirales y otros farmacos, y una activacion farmacologica inadecuada.

Por ultimo, el fracaso puede estar condicionado por causas atribuibles al propio VIH-1, como son la replicacion en compartimientos <<santuario>> y el desarrollo de resistencias (38). Por tanto, a pesar de la importancia que posee la determinacion de resistencias al tratamiento antirretroviral, no se debe olvidar que existen otras causas de fracaso que se deben tambien explorar.

Este campo esta en constante evolucion, que exige una continua puesta al dia debido al desarrollo de nuevos farmacos y nuevos blancos terapeuticos, la descripcion de nuevas mutaciones asociadas con la resistencia y la acumulacion y jerarquizacion de evidencia cientifica. Existen bases de datos de alimentacion continua y facil consulta a traves de varias sitios del Internet, de mutaciones que confieren resistencia al VIH que en este sentido facilita enormemente la actualizacion de los conocimientos. Asimismo, las tecnicas de determinacion de resistencia se veran obligadas a asumir este dinamismo, adaptandose a los datos que se vayan generando. Por tanto, cada vez se debe tener en cuenta mas factores a la hora de interpretar los resultados de la determinacion de resistencias del VIH a los farmacos antirretrovirales.

CONSIDERACIONES FINALES

La pandemia del SIDA/VIH se perfila como uno de los problemas mas agudos de la salud publica mundial de este milenio. La dinamica mutacional del VIH-1 asociada con factores ambientales naturales o impuestos, hace casi imposible en las condiciones actuales, la cura de esta enfermedad. Un aspecto preocupante de esta situacion es la gran amplificacion en la transmision de cepas cada vez con un mayor espectro de resistencia, multirresistencia, que obliga al desarrollo de nuevos esquemas terapeuticos.

Infortunadamente los paises del tercer mundo en los que la prevalencia del virus es mas alta que en la mayoria de los paises desarrollados, se debaten entre la pertinencia del tratamiento y el costo de la terapia antiviral. Es importante destacar que en los paises tercer mundistas, la aplicacion de monoterapia o de combinaciones que se sabe desarrollaran rapidamente resistencia a las terapias, es la que el Estado y los sistemas de medicina asistencial ofrecen casi a reganadientes. Tal como se ha demostrado, este tipo de terapia puede ser una solucion parcial al problema, solo si se complementa con el seguimiento genetico de la resistencia asociada. Infortunadamente los elevados costos de estos metodos hacen casi imposible su aplicacion por los sistemas de cubrimiento de salud.

Epidemiologicamente en Colombia no existen estudios completos que muestren cual es la circulacion de los subtipos virales, ni mucho menos de las variantes resistentes; esto produce una absoluta falta de conocimiento para el manejo de este gran problema de salud publica nacional. Ademas existen muy pocas opciones para brindarle al portador del VIH-1 un manejo terapeutico integral adecuado. La monoterapia es cosa del pasado; su ineficiencia no compensa los <<menores costos>> ante lo que ofrece la terapia multiple y de alto rendimiento TAR. En este sentido el paciente esta en una desventaja clinica pues el exito terapeutico de la terapia que se administra en el sistema publico de salud y en las EPS, esta obsoleta y aboca al paciente a una disminucion progresiva y acelerada de su condicion fisica contraviniendo el derecho fundamental a una vida normal.

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Felipe Garcia-Vallejo, Ph.D. [1], Martha C. Dominguez, M.Sc. [2]

[1.] Profesor Titular, Director Cientifico, Laboratorio de Biologia Molecular y Patogenesis, Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Fisiologicas, Facultad de Salud, Universidad del Valle, Cali. e-mail: fegarva@telesat.com.co

[2.] Aspirante a Doctora en Ciencias Biomedicas, Investigadora Asociada del Laboratorio de Biologia Molecular y Patogenesis, Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Fisiologicas, Facultad de Salud, Universidad del Valle, Cali. e-mail: mdominguez1@telesat.com.co
Cuadro 1
Ensayos aleatorios controlados que avalan la deteccion de
resistencias del VIH-1 a los antirretrovirales

Estudio                           Diseno

ADAM         Genotipo vs. recomendaciones empiricas generales
VIRADAPT     Genotipo vs. recomendaciones empiricas generales
GART         Genotipo vs. interpretacion experta vs. recomendaciones
empiricas    generales
VIRA3001     Genotipo vs. recomendaciones empiricas generales
Kaiser       Fenotipo vs. recomendaciones empiricas generales
NARVAL       Genotipo vs. recomendaciones empiricas generales
Havana       Genotipo vs. recomendaciones empiricas generales

Baxter JD, Mayers DL, Wentworth DN, Neaton JD, Merigan TC and the
and the CPCRA 046 Study Team. A pilot study of the short-term
effects of antiretroviral management based on plasma genotypic
antiretroviral resistance testing (GART) in patients failing
antiretroviral therapy. CPCRA 046. 6th Chicago: Conference on
Retroviruses and Opportunistic Infections, 31 Jan-4 Feb, 1999.

Cuadro 2
Pruebas comerciales para la determinacion de resistencias del
VIH-1 a drogas antirretrovirales

Metodologia      Denominacion      Compania           Aplicacion

Secuenciacion    HIV Genotyping    PE Biosystem       Genotipificacion
                 system kit
                 TruGene HIV       Visible Genetics
                 Resistance Kit
                 VircoGen          Virco
                 GeneSeq HIV       ViroLogic Inc.     Genotipificacion

Hibridizacion    Imno-Lipa HIV     Versant/Bayer      Genotipificacion
                 nucleosides
                 Imno-Lipa HIV     Versant/Bayer      Genotipificacion
                 protease
                 Imno-Lipa HIV     Versant/Bayer      Genotipificacion
                 non-nucleosides
                 Imno-Lipa HIV     Versant/Bayer      Genotipificacion
                 MultiDrug
                 Resistance
                 HIV PRT-440
                 ("GeneChip")
                                   Affimetrix         Genotipificacion
Virus            Antivirogram      Virco              Fenotipificacion
Recombinantes
                 Phenosense        Virologic Inc.     Fenotipificacion

Cuadro 3
Caracteristicas de las pruebas comerciales de resistencia del
VIH-1 a medicamentos antirretrovirales

Prueba                   Sensibilidad        Complejidad

LIPA                         1%-5%               Baja
HIV Genotyping Kit          20%-25%              Alta
TruGene                     10%-20%              Alta
Antivirogram                10%-20%              Alta
PhenoSense                    10%                Alta

Prueba                    Umbral ARN            Tiempo

LIPA                      500 cpARN/ml         2 a 3 dias
HIV Genotyping Kit       1000 cpARN/ml         5 dias
TruGene                  1000 cpARN/ml         2 dias
Antivirogram             1000 cpARN/ml         3 semanas
PhenoSense               1000 cpARN/ml         14 dias

Cuadro 4

Aspectos pendientes por resolver en la resistencia del
VIH a medicamentos antirretrovirales

--Beneficios que ofrece la evolucion virologica a largo plazo

--Situaciones en que sea preferible determinar el genotipo o el
fenotipo

--Sensibilidad de las pruebas para discriminar subpoblaciones
minoritarias

--Evaluacion de la resistencia a una droga antirretroviral durante una
terapia combinada

--Cadencia de la deteccion de resistencias
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Author:Garcia-Vallejo, Felipe; Dominguez, Martha C.
Publication:Colombia Medica
Article Type:Report
Date:Jul 1, 2003
Words:7601
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