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Inmunotipificacion de linfoma canino y su relacion con el pronostico clinico.

Immunophenotyping of canine lymphoma and relationship with clinical prognosis

Introduccion

El linfoma es una de las neoplasias frecuentes en la especie canina representando el 24,7% (Gavazza et al., 2008) de las neoplasias de todos los sistemas organicos y aproximadamente el 83% de los tumores hematopoyeticos (Kaiser, 1981; Jacobs et al., 2002). Debido a que el linfoma canino tiene muchas similitudes con el linfoma no Hodgkin (LNH), es un modelo atractivo para los estudios en humanos (Jamadar et al., 2009; Vail et al., 2009). En humanos, los linfomas Hodgkin y los LNH se diferencian, entre otras caracteristicas, porque los primeros muestran la presencia de unas celulas gigantes (mas de 50 [micron]m) denominadas de Reed-Sternberg (Chuaqui & Gonzalez, 2011). Los LNH son mas frecuentes y el riesgo de sufrir la enfermedad y morir es cada vez mayor, lo que obliga a un tratamiento quirurgico, radioterapia, quimioterapia o terapia biologica, para tratar de controlar la enfermedad (Gavazza et al., 2008). Recientemente fue publicado un articulo senalando que el uso de animales de compania aparentemente tiene un efecto benefico en el sentido de reducir la probabilidad de sufrir LNH (Tranah et al., 2008).

Igual como ocurre en humanos, existen varios sistemas de clasificacion de tumores linfoides en los animales domesticos. La denominada clasificacion de Kiel, actualizada con base a criterios inmunocitologicos se puede aplicar a la citologia por aspiracion con aguja fina (Fournel et al., 1997), existiendo correlaciones fuertes con la clasificacion de la OMS (Uppenkamp & Feller, 2002; Ponce et al., 2010; Vezzali et al., 2010). Otra clasificacion tiene que ver con el sitio donde se origina, pudiendo ser mediastinico, multicentrico, gastrointestinal y extranodal, este ultimo involucra a los rinones, el sistema nervioso central, la piel y el corazon, entre otros (Gavazza et al., 2008). El linfoma multicentrico es el mas frecuente (85% de los casos), se localiza a nivel de los ganglios linfaticos pudiendo algunas veces involucrar al higado, bazo y medula osea, explicando de esa forma la presentacion de los signos clinicos inespecificos como anorexia, perdida de peso, vomito, diarrea, poliuria, polidipsia y fiebre (Gavazza et al., 2008).

La mayoria de los linfomas en los caninos son de grado histologico alto o intermedio, mientras que el linfoma de bajo grado (menos agresivo) representa cerca del 5% de los casos (Arespacochaga et al., 2007). Varios factores pronosticos se han reportado en el linfoma canino, entre ellos el genero (MacEwen et al., 1987), el peso corporal (Garrett et al., 2002), la presencia de anemia (Miller et al., 2009), el estadio clinico (Hosoya et al., 2007) y el inmunofenotipo (Greenlee et al., 1990).

La inmunotipificacion de linfomas en caninos ha permitido en muchos casos la aproximacion entre el diagnostico y el pronostico, facilitando las decisiones clinicas de tratamiento o eutanasia de los pacientes, sin embargo, en algunos casos en los que la inmunotipificacion no fue posible, el diagnostico clasico morfologico fue la unica opcion para establecer ese factor pronostico (Arespacochaga et al., 2007).

El estudio tuvo como objetivo analizar las posibles diferencias en la expresion de receptores de membrana que permitieran clasificar los casos de linfoma en dos grupos (celulas B o celulas T) y comparar esa expresion con la condicion de malignidad de los diagnosticos obtenidos.

Material y Metodos

Animales y tipo de estudio

Se realizo un estudio retrospectivo utilizando el archivo del Laboratorio de Patologia Veterinaria de la Universidad de Caldas, donde se encontraron dieciocho casos registrados con el diagnostico de Linfoma canino entre el ano 2000 y el 2008. Once casos presentaron datos clinico-patologicos completos, de los cuales ocho caninos habian muerto o fueron eutanasiados por causa de la enfermedad avanzada y ninguno habia recibido tratamiento. De estos ultimos, solo de cinco casos se tenia archivo de tejidos conservados en bloques de parafina y finalmente fueron usados para la presente investigacion. Todos los animales fueron atendidos por consulta externa en el Hospital Veterinario de la Universidad de Caldas por manifestar decaimiento general, inapetencia, aumentos de volumen en nodos linfoides en diferentes partes del cuerpo y en la piel. El criterio diagnostico incluyo radiografias, biopsias por aspiracion con aguja fina y finalmente histopatologia a partir de especimenes obtenidos en las necropsias.

Estudio inmunohistoquimico

El estudio inmunohistoquimico fue realizado en el Laboratorio de Patologia de la Universidad Estadual Paulista (FCAV-UNESP), en Sao Paulo, Brasil, de acuerdo a la tecnica estandarizada en el Laboratorio de Neuropatologia (Pedraza et al., 2008). Los anticuerpos primarios, los secundarios y el tipo de recuperacion antigenica se resumen en la Tabla 1. Los cortes de tejido fueron desparafinados por calor y colocados en banos de alcohol en concentraciones decrecientes para deshidratarlos. Posteriormente se utilizo un bloqueador de peroxidasa endogena (Dako[R]) durante 20 minutos. Los cortes fueron banados en solucion tampon de salina fosfato (PBS) e incubados por 30 minutos en una solucion de albumina serica bovina en PBS al 2,5% para bloquear proteinas inespecificas. Tres incubaciones se realizaron seguidas cada una por dos lavados con PBS; primero, con el anticuerpo primario especifico para cada antigeno celular; segundo, con un anticuerpo secundario biotinilado dirigido contra el anticuerpo primario; y tercero, con el complejo avidina-biotina (Dako[R]) diluido en PBS durante 30 minutos a 30[grados]C. El complejo se revelo con la adicion de 3,3 diaminobenzidina.

Finalmente los cortes fueron contra coloreados con hematoxilina de Harris, deshidratados por el paso en varios alcoholes crecientes, aclarados con xilol y montados con balsamo de Canada.

Resultados y Discusion

Todos los casos fueron considerados de alta malignidad, tanto por la clasificacion morfologica de las neoplasias como por la condicion clinica de los pacientes que finalmente murieron por causa de la enfermedad. La inmunodeteccion, usando anticuerpos contra el antigeno [CD.sub.3] de la superficie celular de Linfocitos T, permitio la localizacion de este tipo de celulas en un alto grado de infiltracion en dos de los cinco casos, diagnosticados histopatologicamente como linfoma, uno de ellos con metastasis a varios organos. Los Linfocitos B evidenciados por la deteccion del antigeno BLA, fueron encontrados solo en un caso que habia sido tambien positivo a la marcacion de [CD.sub.3], sin embargo, por el escaso conteo de linfocitos marcados (calculado en menos del 5% de la proporcion) se considero negativo (Figura 1 y Tabla 2), aunque existen reportes de linfomas linfoblasticos T que demuestran expresion conjunta de [CD.sub.3] y [CD.sub.79a] (usado para Linfocitos B) en la misma celula (Sapierzynski, 2010). Los restantes tres casos, un linfoma, un linfoma multicentrico y un linfosarcoma multicentrico linfoblastico, fueron negativos para la deteccion de ambos marcadores y fueron clasificados como linfomas no B/no T. Lo mismo ha ocurrido en LNH en humanos, donde se atribuye que el origen de este tipo de linfomas es a partir de celulas naturales asesinas (NK); para su confirmacion, seria necesario utilizar otros anticuerpos especificos para antigenos de membrana de esas celulas, que en humanos son CD56, CD94 y CD16 (Abbas et al., 1999). Estos antigenos no han sido utilizados en perros y, por lo tanto, se desconoce si existe una reaccion cruzada entre estas especies (Dobson et al., 2001; Thomas et al., 2001).

[FIGURA 1 OMITIR]

Una segunda posibilidad para que no hubiera marcacion es que su origen fuera a partir de celulas precursoras B o inmaduras T, las cuales en este estado no presentan la expresion de los anticuerpos usados, por lo que seria necesario utilizar marcadores de membrana especificos, como ocurre en humanos con los CD9 y CD10 para precursores B y CD44, CD25 y CD117 para precursores T (Abbas et al., 1999).

El control positivo para los dos marcadores usados en el presente estudio correspondio a un linfonodo normal de canino, el cual fue procesado con 12 horas de fijacion en una solucion de formol tamponado en fosfato, mientras que los casos analizados estuvieron por un periodo de tiempo que vario entre los cinco dias y los dos meses en solucion fijadora de formol acido, lo cual podria ser un motivo para ocasionar danos estructurales a los antigenos de membrana y de esta forma los anticuerpos no pudieran ligarse a ellos, tal vez utilizando otros sistemas simultaneos de recuperacion antigenica (como la utilizacion de un sistema pascal de presion) los resultados podrian variar en este sentido. De igual forma, el uso de un linfonodo normal como control positivo podria estar relacionado con otra posibilidad para intentar explicar la falla en la utilizacion de estos inmunomarcadores, tal como esta reportado en la literatura, que puede ser la presencia de linfocitos malignos anaplasicos o mal diferenciados que no expresen las mismas moleculas o proteinas presentes en las celulas bien diferenciadas (Alvarez et al., 2009).

Existen reportes en el sentido de que la clasificacion morfologica del linfoma canino como unico parametro de pronostico clinico no es adecuada, mientras que la inmunotipificacion ha demostrado ser muy util en el diagnostico a traves de identificacion de marcadores especificos en las lineas celulares (Vernau & Moore, 1999). Se sabe que la mayoria de linfomas y leucemias en humanos tienen perfiles de expresion genica que caracterizan a los diferentes tipos histologicos e inmunofenotipicos de linfoma y leucemia; se pueden identificar diferentes subtipos con base en el perfil de expresion genica (Alizadeh et al., 2000). En el presente estudio se pudo establecer que los pacientes afectados con este tipo de tumores en algunas ocasiones se agravan y terminan muriendo por causa de la enfermedad, esto es, por la carencia de un protocolo de manejo que incluya un diagnostico temprano con un criterio inmunomolecular que facilite el establecimiento de un pronostico y permita recuperar algunos casos mediante tratamiento quimioterapeutico. En el futuro, este tipo de estudios podrian ser realizados con mayor facilidad, obteniendo asi una mejor clasificacion del linfoma canino, con base en las caracteristicas histologicas, inmunofenotipicas y geneticas.

Conclusiones

Fue posible marcar Linfocitos T y B en casos de linfoma canino que habian sido archivados en bloques de parafina, lo que permite suponer una eficiente utilizacion de la tecnica de inmunohistoquimica para casos rutinarios en el Hospital Veterinario de la Universidad de Caldas.

El linfoma canino en Manizales deber ser mejor estudiado y caracterizado con el fin de iniciar protocolos de tratamiento en pacientes que puedan ser sometidos a este tipo de terapia.

Es necesario proponer investigaciones tendientes a la inmunotipificacion de linfomas caninos, relacionando las diferentes moleculas presentes en ellos con el pronostico clinico de los pacientes afectados.

Referencias Bibliograficas

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Monica Aristizabal-Arbelaez (1), Lina Osorio-Morales (1), Francisco Pedraza-Ordonez (1,2)

(1) Grupo de Investigacion en Patologia Veterinaria, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia.

(2) Departamento de Salud Animal, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Caldas. Manizales, Colombia.

fpedraza@ucaldas.edu.co

(Recibido: octubre 5, 2010; aprobado: noviembre 24, 2010)
Tabla 1. Relacion de anticuerpos utilizados para detectar dos
poblaciones de linfocitosen tejido neoplasico linfoide de caninos.

Reactivacion/     Anticuerpos     Dilucion/   Anticuerpos   Dilucion/
Recuperacion       primarios        Tiempo     secundarios    Tiempo
Antigenica

Stem Cock (1)   Antilinfocito B   1:200 12-18  Cabra anti-   1:200 45
                NCL-BLA 36 (3)      horas       raton (b)    minutos
Pronasa (2)     Antilinfocito T   1:100 2      Cabra anti-   1:300 45
                [CD.sub.3](4 a)    horas       conejo (c)    minutos

(1) Stem cock, 20 minutos (solucion de citrato pH 6,0).
(2) Recuperacion enzimatica, 15 minutos. (3) Anticuerpo monoclonal.
(4) Anticuerpo policlonal. a Dako A0452. (b) Dako E0433. (c) Dako
E0432.

Tabla 2. Principales datos de los pacientes relatados.

                                              Diagnostico
Numero   Raza              Sexo     Edad      histopatologico

00-003   Mestizo Pastor    Macho    8 anos    Linfoma y metastasis
         Boxer             Macho    6 anos    Linfoma
06-126   Siberiano         Hembra   10 anos   Linfosarcoma
                                              multicentrico
                                              linfoblastico
07-097   Labrador dorado   Macho    7 anos    Linfoma
08-054   Labrador          Macho    7 anos    Linfoma multicentrico

            Caracteristica
           Inmunofenotipica

Numero   [CD.sub.3]  BLA

00-003   Positivo    Negativo
         Positivo    Negativo *
06-126   Negativo    Negativo
07-097   Negativo    Negativo
08-054   Negativo    Negativo

* Inicialmente positivo, sin embargo, fue considerado negativo por
la escasa marcacion contra el antigeno BLA de la superficie celular
del Linfocito B.
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Title Annotation:ARTICULO CORTO
Author:Aristizabal-Arbelaez, Monica; Osorio-Morales, Lina; Pedraza-Ordonez, Francisco
Publication:Veterinaria y Zootecnia
Article Type:Report
Date:Jul 1, 2010
Words:2965
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