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Inmunogenicidad del veneno de Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) y su evaluacion por metodos inmunoenzimaticos.

Immunogenicity of Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) venom and its evaluation by immunoenzymatic methods

Introduccion

Los venenos de serpientes son mezclas complejas de sustancias, principalmente proteinas, producidas por una glandula sero -- mucosa, e inoculados mediante un aparato especializado compuesto por colmillos acanalados los cuales ingresan por presion en los tejidos. Debido a su accion toxica, estas proteinas han sido clasificadas como miotoxinas, hemorraginas, nefrotoxinas, neurotoxinas y toxinas coagulantes; sin embargo, debido a su variada accion farmacologica y a sus propiedades farmacocineticas, Chippaux y Goyffon (1998) agruparon estas sustancias en dos categorias: a) toxinas, que son polipeptidos con un peso molecular menor a 30 kDa, abundantes en los venenos de serpientes de la familia Elapidae; y b) enzimas, las cuales poseen un peso molecular mayor a 30 kDa y constituyen el componente principal del veneno de serpientes de la familia Viperidae.

Las ponzonas procedentes de la familia Viperidae causan principalmente hemorragia, edema, mionecrosis y disturbios en la coagulacion, siendo la incidencia mundial anual de mordedura por serpientes de 5 millones de habitantes (Chippaux y Goyffon, 1991) con calculos de muertes estimados entre 60 a 80 mil (Warrell, 1996). Por ello, el ofidismo constituye un problema de salud publica para los paises que cuentan con una fauna ponzonosa muy variada, tal como ocurre en el Peru (Yarleque 2000).

En nuestro pais, las mordeduras por serpientes se producen en su mayoria en las zonas silvestres de selva alta y baja y en numerosos reportes se consigna a los especimenes de la familia Viperidae como las principales agresoras (Levano & Fernandez 2004). Dentro de estas, se considera a la especie Bothrops atrox "jergon" como la mas comun para la zonas selvaticas, B. brazili "jergon shushupe" localizada principalmente en la selva norte, Lachesis muta "shushupe", que habita diversas regiones de la selva amazonica y Crotalus durissus "cascabel" restringida al valle de Sandia, provincia de Puno. De estas serpientes, es de especial interes la especie B. atrox por ser la serpiente de mayor peligro y la causante entre el 88 y 92% de accidentes ofidicos registrados en el pais (Loja, 2000).

Frente al envenenamiento ofidico, la seroterapia es la unica alternativa especifica para contrarrestar su accion, por ello se producen antivenenos mediante hiperinmunizacion de animales seroproductores (por ejemplo, caballos, ovejas, cabras, etc.), usando venenos de especies de serpientes taxonomicamente cercanas (Theakston et al. 2003). A pesar de la efectividad en el tratamiento, se pueden presentar reacciones alergicas tardias producto de la inoculacion del antiveneno. En el caso de los antivenenos producidos en el Peru, el Instituto Nacional de Salud elabora un antiveneno botropico polivalente mediante la inoculacion de caballos con una mezcla de venenos de las serpientes B. atrox, B. brazili, B. pictus, B. barnetti y B. hyoprora, el cual resulta efectivo en la neutralizacion de los danos locales producidos durante el envenenamiento, pero presenta propiedades limitadas para reducir el edema y la necrosis (Rojas et al. 2005). Asi, se requiere de un mejor conocimiento de las propiedades inmunogenicas de los componentes proteicos de los venenos de serpientes, la cual puede lograrse con la aplicacion de tecnicas inmunoenzimaticas como el analisis por Western Blot y el ELISA (EnzymeLinked Immunosorbent Assay), en las cuales la reactividad de un antigeno es valorada cualitativa y cuantitativamente.

Por este motivo, en el presente trabajo se ha realizado un estudio de la inmunogenicidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox (Linnaeus, 1758), y luego se evaluo la reactividad cruzada del suero hiperinmune producido contra los venenos de otras serpientes peruanas de la familia Viperidae, mediante tecnicas inmunoenzimaticas. Estos resultados contribuiran al mejoramiento de la calidad de los antivenenos polivalentes comerciales producidos en el Peru.

Materiales y metodos

Material biologico.-- Se empleo el veneno de la serpiente Bothrops atrox obtenido a partir de ejemplares procedentes de Pucallpa -- Ucayali y mantenidos en el Serpentario "Oswaldo Meneses" -- Museo de Historia Natural -- UNMSM. El veneno fue extraido por presion manual, despues liofilizado y mantenido a 4 [grados]C hasta su uso. Para evaluar la reactividad cruzada se emplearon venenos de las especies: B. brazili, L. muta y C. durissus, procedentes de ejemplares mantenidos en el mismo serpentario.

Para la obtencion del suero hiperinmune se emplearon conejos albinos machos Nueva Zelanda (2,5 kg de peso aprox.), los cuales fueron mantenidos en el Instituto de Medicina Tropical Daniel Alcides Carrion de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Cuantificacion de proteinas.-- La cantidad de proteina fue calculada midiendo la absorbancia de luz UV a 280 nm (Warburg & Christian 1944) y por el metodo de Lowry et al. (1951) modificado en nuestro laboratorio (Loayza et al. 1985) empleando albumina serica bovina como proteina estandar.

Protocolo de inmunizacion.-- El veneno crudo de B. atrox (1 mg/mL) preparado en PBS, fue emulsificado con un volumen equivalente de Adyuvante Completo de Freund (CFA) e inyectado por via intradermica, en cada uno de los conejos albinos en volumenes de 0,25 mL seleccionando cuatro lugares del dorso.

Luego de 10 dias se aplicaron tres dosis de refuerzo preparadas en Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) a intervalos de 30 dias. Diez dias despues de aplicada cada dosis de refuerzo, se extrajo sangre a partir de la vena marginal de la oreja y al finalizar el protocolo de inmunizacion, la sangre se obtuvo mediante puncion cardiaca, a fin de evaluar la presencia de anticuerpos reactivos en el suero contra el veneno en estudio.

Deteccion de anticuerpos contra el veneno de B. atrox y calculo del titulo de anticuerpos.-- Se realizo mediante la tecnica de ELISA (Engvall & Perlmann 1971), siguiendo el metodo de titulacion a punto final (Alzamora et al. 2002). Para ello se emplearon placas de 96 pocillos (Nunc -- ImmunoTM, Dinamarca) cubiertas con 100 [micron]L/pocillo de veneno de B. atrox (0,25 [micron]g/mL) disuelto en buffer de cubierta (carbonato de sodio 0,015 M; bicarbonato de sodio 0,035 M; pH 7,6), durante una noche a 4 [grados]C. Despues de tres lavados sucesivos empleando buffer de lavado (NaCl 0,15 M, Tween-20 0,05%), se aplico en los pocillos buffer de bloqueo (leche descremada al 3%, Tween-20 0,05% en PBS pH 7,4) por 1 h a 37 [grados]C. Luego de tres lavados, se aplicaron 100 [micron]L/pocillo de suero de conejo obtenido a los dias 0, 10, 40, 70, asi como al final del protocolo de inmunizacion (dia 90), diluido seriadamente con factor 2 a partir de 1/1000 en el buffer de bloqueo, e incubados durante 1 h a 37 [grados]C. Las placas fueron lavadas nuevamente y los anticuerpos unidos fueron detectados empleando anti-IgG de conejo conjugado con fosfatasa alcalina (1/4000 en buffer de bloqueo) seguido de la adicion del sustrato respectivo (100 [micron]L/pocillo de p-nitrofenil fosfato disuelto en buffer Tris). Despues de 30 min a 20 - 22 [grados]C, la reaccion se detuvo mediante la adicion de 50 [micron]L/pocillo de NaOH 3 M registrandose la absorbancia a 405 nm en un lector de placas Titertek Multiskan PLUS MKII. El titulo del suero correspondio a la inversa de la dilucion del mismo que produjo un 50% de la maxima absorbancia registrada.

Evaluacion de la reactividad cruzada entre el suero anti-B. atrox y otros venenos de serpientes peruanas.-- La reactividad cruzada del suero anti-B. atrox contra los venenos de B. brazili, L. muta y C. durissus fue evaluada mediante la tecnica de ELISA para lo cual se emplearon placas de 96 pocillos cubiertas con 100 uL/pocillo de los respectivos venenos (0,25 [micron]g/mL). Luego se siguieron los pasos establecidos en el procedimiento anterior, empleando el mismo suero de conejo diluido a partir de 1/1000. La reactividad cruzada fue expresada como porcentaje de las densidades opticas resultantes de la reaccion entre los mencionados venenos y el suero anti-B. atrox considerando como 100% el valor de absorbancia obtenido entre el veneno de B. atrox y su respectivo suero a una dilucion equivalente al titulo obtenido.

Analisis electroforetico de los venenos en estudio.-- Los venenos en estudio (20 - 25 [micron]g) fueron tratados con buffer de muestra bajo condiciones no reductoras (Tris -- HCl 0,05 M, pH 6,8; SDS 2%, azul de bromofenol 0,1%, glicerol 10%) durante 5 min a 100 [grados]C para luego ser sometidos a PAGE -- SDS al 12% durante 1 h a 100 voltios constantes (Laemmli 1970). Se utilizaron como proteinas patrones de peso molecular: fosforilasa b (97 kDa), albumina (66 kDa), ovoalbumina (45 kDa), anhidrasa carbonica (29 kDa), inhibidor de tripsina (20,1 kDa) y lisozima (14,3 kDa). Despues de la corrida, los geles fueron tenidos con azul de Coomassie R-250 0,1% durante 2 h y lavados con solucion decolorante conteniendo metanol, acido acetico y agua (4:3:4) hasta evidenciar las bandas proteicas.

Analisis por Western Blot.-- Los venenos en estudio (10 - 15 [micron]g) separados previamente mediante PAGE -- SDS, fueron transferidos a membranas de polifluoruro de vinilideno (PVDF) en buffer de transferencia (Tris 0,02 M, pH 8,3; glicina 0,192 M, SDS 0,1%, metanol 20%) durante 50 min a 100 voltios (Towbin et al. 1979). Las membranas fueron bloqueadas usando el buffer respectivo (leche descremada al 5% en Tris-HCl 0,02 M, NaCl 0,15 M, pH 7,5, Tween-20 1%) durante una noche a 4 [grados]C. Despues se procedio al lavado con buffer de lavado (NaCl 0,15 M, Tween-20 0,05%) y luego las membranas fueron enfrentadas con el suero hiperinmune de conejo (1/1000) diluido en buffer de bloqueo. Luego de 1 h de exposicion a 20 - 22 [grados]C, las membranas fueron lavadas nuevamente y esta vez expuestas a anti-IgG de conejo ligada a fosfatasa alcalina (1/4000) durante 1 h a 20 - 22 [grados]C, para luego de lavados sucesivos incubarlas con una solucion de revelado (NBT [nitro-azul tetrazolio] y BCIP [bromo-cloro indolil sulfato] en buffer Tris-HCl 0,1 M; NaCl 0,1 M; Mg[Cl.sub.2] 0,005 M; pH 9,5). Posteriormente, las membranas fueron sumergidas en agua destilada para detener el desarrollo de color y finalmente se procedio al analisis visual de los patrones de reactividad del suero hiperinmune, obtenido experimentalmente contra los diferentes venenos.

[FIGURA 1 OMITIR]

Resultados

Deteccion y titulo de anticuerpos contra el veneno de B. atrox.-- Se realizo el seguimiento de la respuesta inmune de los conejos albinos mediante la tecnica de ELISA desde el dia 0 hasta el dia 90 del protocolo de inmunizacion (Fig. 1). Los resultaron muestran los niveles de produccion de anticuerpos IgG especificos contra el veneno de B. atrox, los cuales alcanzan su maximo valor despues de la tercera dosis de refuerzo (dia 70), y se mantuvieron hasta el final del protocolo de inmunizacion. Asimismo, el titulo de anticuerpos anti-B. atrox en el suero obtenido al final del protocolo de inmunizacion correspondio al valor de 256000 (Fig. 2).

Reactividad cruzada determinada por ELISA.-- Al evaluarse la reactividad de los cuatro venenos en estudio contra el suero hiperinmune anti-B. atrox mediante la tecnica de ELISA; se alcanzaron diversos valores de densidad optica a 405 nm, donde el maximo valor correspondio a la reaccion entre el veneno de B. atrox y su correspondiente suero (Fig. 3). Ademas, se observo que el suero reacciono de forma cruzada con los otros venenos de serpientes, pero con diferente intensidad, siendo los valores de reactividad cruzada para los venenos de B. brazili, L. muta y C. durissus, de 23,7, 4,0 y 1,8%, respectivamente.

[FIGURA 2 OMITIR]

Comparacion de los perfiles de veneno de serpiente mediante PAGE-SDS.-- La Figura 4a muestra los patrones proteicos obtenidos para los venenos de B. atrox, B. brazili, L. muta y C. durissus mediante PAGE -- SDS en condiciones no reductoras. En todos los casos, se detecto un minimo de 10 bandas proteicas, observandose que cada veneno presenta un patron caracteristico. Ademas se pudieron detectar varios componentes de pesos moleculares similares en todos los venenos dentro del rango de 14,3 y 66 kDa. Sin embargo tambien se visualizaron bandas especificas entre los 25 y 60 kDa especialmente en el veneno de B. atrox. En el caso del veneno de B. brazili se distinguieron proteinas en el rango de 30 a 45 kDa y componentes de bajo peso molecular alrededor de los 14,3 kDa. Para el veneno de L. muta se pudieron apreciar bandas proteicas en un rango mucho mayor (14,3 - 97 kDa) donde las mas abundantes se concentraron en el rango de los 30 kDa. En cambio, para el caso del veneno de C. durissus se observaron bandas mayormente agrupadas en el rango de los 14,3 a 30 kDa.

Reactividad cruzada determinada por Western Blot.-- La Figura 4b muestra que el suero anti -- B. atrox reacciono con los componentes proteicos de los venenos de B. atrox, B. brazili, L. muta y C. durissus lo cual se evidencia por la formacion de bandas coloreadas. Para el caso del veneno de B. atrox se obtuvo una intensa reactividad comprendiendo bandas en el rango de 14.3 a 97 kDa, lo cual indica que la mayoria de sus componentes son inmunogenicos. Por otro lado el suero reacciono de forma cruzada con los componentes del veneno de B. brazili abarcando un rango de pesos moleculares similar al anterior, pero con menor intensidad y a su vez mostrando un numero menor de bandas coloreadas. Los venenos de L. muta y C. durissus reaccionaron con menor intensidad frente al suero anti-B. atrox, donde la reactividad de este ultimo se limito a componentes alrededor de los 66 kDa y a otros comprendidos en el rango de 14.4 a 20,1 kDa.

[FIGURA 3 OMITIR]

[FIGURA 4 OMITIR]

Discusion

Los venenos de serpientes peruanas han sido durante muchos anos, objeto de estudio mediante el empleo de herramientas bioquimicas dirigidas principalmente al analisis de su actividad enzimatica, tanto en sistemas in vitro como su actividad biologica mediante el empleo de animales de experimentacion, cuyos efectos semejan a los mostrados por las personas envenenadas (Yarleque 2000). Como resultado de estos estudios, se ha podido clasificar a estos venenos como proteoliticos, coagulantes, hemorragicos, nefrotoxicos, neurotoxicos y miotoxicos, lo cual se puede correlacionar con la sintomatologia manifestada por las personas accidentadas producto de la mordedura de estos animales (Levano & Fernandez 2004).

La principal herramienta terapeutica contra estos accidentes es el empleo de antivenenos producidos en caballos, ovejas, cabras y conejos, elaborados con sueros obtenidos a partir de la inoculacion de estos animales con el veneno de las serpientes de mayor importancia en salud publica de un pais, tomando como punto de partida la incidencia de su mordedura en una determinada poblacion (Theakston et al. 2003). En Peru, el Instituto Nacional de Salud, mediante el Centro Nacional de Productos Biologicos, es el encargado de elaborar diferentes tipos de antivenenos como el botropico polivalente (el cual utiliza los venenos de B. atrox "jergon de la selva", B. brazili "jergon shushupe", B. pictus "jergon de la costa", B. barnetti "macanche" y B. hyoprora "jergon"), el laquesico monovalente (empleando el veneno de L. muta "shushupe") y el crotalido monovalente (obtenido a partir del veneno de C. durissus "cascabel sudamericana"). A pesar de la efectividad mostrada por estas preparaciones biologicas en el tratamiento de mordeduras ofidicas, existe escasa informacion sobre las caracteristicas inmunoquimicas de los venenos utilizados para su produccion, por lo que resulta crucial estudiar la potencial reactividad inmunologica cruzada presente entre estos venenos a fin de optimizar la produccion de tales inmunobiologicos, asi como para el desarrollo de sistemas de deteccion de venenos para la identificacion de la especie de serpiente responsable de un envenenamiento a fin de seguir el tratamiento apropiado (Van Dong et al. 2003).

Para la produccion de anticuerpos se siguen diversos esquemas o protocolos de inmunizacion, los cuales consideran diferentes parametros para su desarrollo (Christensen 1979); entre ellos se considera el tiempo necesario para obtener un titulo aceptable de anticuerpos, la edad del animal inmunizado y el empleo de adyuvantes. Ademas se debe tener en cuenta la naturaleza del antigeno y su toxicidad, asi como la del antiveneno que se pretende producir (Heneine & Heneine 1998). En el presente estudio se utilizaron conejos albinos de raza Nueva Zelanda como animales de experimentacion, los cuales fueron inmunizados con una cantidad de veneno de B. atrox que se encuentra por debajo del valor de toxicidad (DL50) reportado (Laing et al. 2004, Rojas et al. 2005) por lo que no se observaron reacciones secundarias en los animales que pudieran interferir con la produccion de anticuerpos. A fin de garantizar la produccion de altos titulos de anticuerpos en el suero, el veneno fue emulsificado previamente con adyuvante completo de Freund (CFA) para la inmunizacion primaria y adyuvante incompleto de Freund (IFA) para las dosis de refuerzo, co-adyuvantes ampliamente utilizados por su capacidad de localizar a los antigenos en la zona de inoculacion durante un periodo de tiempo prolongado. La eficacia de este metodo puede ser monitoreada por diversos metodos inmunoquimicos tales como inmunodifusion, inmunoelectroforesis, inmunofluorescencia, hemaglutinacion, radioinmunoensayo (RIA), etc. (Theakston 1983). Sin embargo, se ha encontrado que la tecnica de ELISA es el metodo mas usado para la deteccion especifica de venenos de serpientes y sus respectivos anticuerpos (Selvanayagam & Gopalakrishnakone 1999). La respuesta inmune de los conejos inoculados fue monitoreada mediante la tecnica de ELISA (Fig. 1) donde el aumento de la absorbancia a 405 nm, indica el aumento en la cantidad de inmunocomplejos formados producto del reconocimiento entre el antigeno y los anticuerpos IgG especificos presentes en el suero de los conejos inmunizados. A partir de estos resultados se considera que el procedimiento empleado resulta practico, eficiente y de corta duracion, convirtiendolo en un metodo util para la obtencion de anticuerpos contra el veneno de B. atrox.

Para la obtencion del titulo de los antivenenos estudiados existen diversos metodos, siendo el mas util el de la titulacion a punto final (Alzamora et al. 2002). Este metodo consiste en analizar los sueros problema en diluciones seriadas con factor 2 partiendo de una dilucion inicial fij a. En nuestro esquema experimental se eligio como titulo la dilucion de suero que produce un 50% de la absorbancia maxima, siendo el titulo anti-B. atrox correspondiente al valor de 256000 (Fig. 2), el cual muestra que el veneno analizado es altamente inmunogenico. En el caso de los venenos de serpientes y los protocolos de inmunizacion para la obtencion de anticuerpos especificos, se considera que el titulo de anticuerpos para un antiveneno es alto cuando su valor es mayor a 32000 (Van Dong et al. 2003). Sin embargo tambien se han observado titulos que alcanzan valores de 2048000 para los venenos de B. atrox y L. muta provenientes de Brazil (Colombini et al. 2001). Si bien estos valores estan muy por encima de los hallados en la presente investigacion, hay que tener en cuenta el tipo de conjugado empleado en ambos tipos de ensayos, el cual basa la sensibilidad de su deteccion en la enzima acoplada que realiza la hidrolisis del sustrato respectivo. En el presente trabajo se utilizo un conjugado acoplado a la enzima fosfatasa alcalina el cual reacciono sobre el sustrato p-nitrofenil fosfato para dar una coloracion amarilla cuya absorbancia es registrada a 405 nm.

A fin de realizar un analisis comparativo de los venenos de serpientes en estudio: B. atrox, B. brazili, L. muta y C. durissus, se analizo el patron electroforetico de sus proteinas mediante PAGE -- SDS en condiciones no reductoras (Fig. 4a). En el caso del veneno de B. atrox se pueden observar bandas especificas entre los 25 y 60 kDa, las cuales corresponderian a proteinas tales como la miotoxina (27 kDa; Huatuco et al. 2004) y la L-aminoacido oxidasa (60 kDa; Lazo et al. 2007). Asi mismo podria notarse la presencia de la atroxina, una metaloproteinasa dependiente de Ca2+, principal responsable del efecto proteolitico y hemorragico de este veneno (19,9 kDa, Pantigoso et al. 1996). En el perfil electroforetico del veneno de B. brazili, se distinguen bandas proteicas dentro del rango de 30 a 45 kDa que corresponderian a la miotoxina (30 kDa, Pantigoso et al. 2001), incluyendo una L-aminoacido oxidasa (59,9 kDa, Solis et al. 1999). Ademas de las proteinas mencionadas, se pueden distinguir componentes de bajo peso molecular como es el caso para una fibrinogenasa (22 kDa, Azanero et al. 2000) y una fosfolipasa A2 (21,2 kDa, Zeballos et al. 1999) previamente reportadas. Ambos venenos tuvieron un numero similar de componentes, si bien la distribucion de bandas de sus perfiles electroforeticos es claramente diferente. Con respecto al patron de bandas para el veneno de L. muta, este presenta un rango mucho mayor abarcando proteinas desde los 14,4 kDa hasta los 97 kDa como se ha reportado para el caso de la fosfolipasa A2 (19,2 kDa, Mejia et al. 2006), la proteinasa I (25,1 kDa, Rodriguez & Yarleque 1991), la enzima similar a trombina (40,0 kDa, Yarleque et al. 1989) y la L-aminoacido oxidasa (60,6 kDa, Cisneros et al. 2006). En el caso del veneno de C. durissus, se observa un menor numero de bandas, donde las proteinas se encuentran agrupadas en el rango de 14,4 a 30 kDa, sin embargo solo se ha reportado la presencia de ciertas actividades enzimaticas como la proteolitica, amidolitica, coagulante, fosfolipasa A2 y L-aminoacido oxidasa (Remuzgo et al. 2000). A partir de este analisis, los componentes de los venenos en estudio pueden dividirse en dos grupos basados en sus pesos moleculares; por un lado los de alto y mediano peso molecular (mayor a 15 kDa) y por otro los de bajo peso molecular (menor a 15 kDa). Esta heterogeneidad en los perfiles obtenidos ha sido reportada para venenos de otras especies sudamericanas, como B. alternatus, B. atrox, B. cotiara, B. erythromelas, B. jararaca, B. jararacussus, B. moojeni, B. neuwiedi y B. pradoi de Brazil (da Silva et al. 1990); centroamericanas, incluyendo a L. muta stenophrys y C. durissus durissus de Costa Rica (Anderson et al.1993); norteamericanas como C. atrox, C. viridis viridis, C. adamanteus y C. horridus horridus (Ownby & Colberg 1990) y asiaticas como Naja naja siamensis, Ophiophagus hannah, Bungarusfasciatus, Vipera russelli, Calloselasma rhodostoma y Trimeresurus albolabris (Chinonavanig et al. 1988).

Para el analisis de la reactividad inmunologica de los venenos de serpientes estudiados contra el suero anti-B. atrox, se empleo en primer lugar el metodo de ELISA. Mediante esta tecnica se pudo determinar que los anticuerpos presentes en el suero hiperinmune reaccionaron con los venenos de serpientes, donde la densidad optica mas fuerte fue la obtenida entre el veneno de B. atrox y su antiveneno homologo (Fig. 3). En estos experimentos de titulacion, se pudo observar tambien reactividad cruzada con los otros venenos de serpientes, donde el mayor valor correspondio a la reaccion del suero hiperinmune con el veneno de B. brazili, seguido por titulos bajos contra los venenos de L. muta y C. durissus. Estos resultados indican que los venenos en estudio contienen proteinas estructuralmente relacionadas con los componentes del veneno de B. atrox, los cuales varian tanto en intensidad como en abundancia. Estos resultados deben ser correlacionados con los de otros metodos inmunoenzimaticos, siendo el mas idoneo el de Western Blot (Li & Ownby 1994), ya que si solo se utiliza un metodo para este tipo de analisis, se podria llegar a conclusiones e interpretaciones erroneas sobre la reactividad entre los venenos y antivenenos (Siigur et al. 2000). Por esta razon se evaluo de forma adicional la inmunogenicidad de los componentes de los venenos en estudio utilizando el ensayo de Western Blot, el cual consiste en primer lugar en la separacion de los componentes proteicos del veneno mediante PAGE -- SDS, para luego ser transferidos a membranas de nitrocelulosa y puedan asi ser detectadas por los anticuerpos presentes en el suero hiperinmune obtenido. De este modo, la formacion de inmunocomplejos es detectada de forma similar que en un ELISA indirecto. La Fig. 4b muestra el patron caracteristico de coloracion de bandas correspondiente a los componentes inmunorreactivos de los venenos en estudio analizados previamente por PAGE -- SDS (Fig. 4a). Esta metodologia permite la visualizacion directa y la comparacion de la reaccion de un mismo suero con los componentes del veneno homologo y los venenos heterologos bajo las mismas condiciones. De esta manera se pudo observar que las proteinas de los venenos reaccionaron con el suero hiperinmune producido contra el veneno de B. atrox lo cual indica que la mayor parte de los componentes proteicos son potencialmente inmunogenicos. Estos resultados pueden correlacionarse con los de Chinonavanig et al. (1988), quien trabajando con el veneno de serpientes de Tailandia, encontro que los componentes de alto peso molecular fueron inmunogenicos, donde ademas otros componentes de menor peso molecular tambien lo fueron. En los demas carriles se pudo observar una reactividad inmunologica cruzada entre los anticuerpos del suero hiperinmune con las proteinas de los venenos de B. brazili (carril 2), L. muta (carril 3) y C. durissus (carril 4). La mayoria de estas bandas de reaccion corresponden a proteinas de alto y mediano peso molecular y con una elevada inmunorreactividad. Tales reacciones cruzadas entre los venenos de viperidos han sido descritas antes para el caso de un antiveneno anti-C. atrox y los venenos de C. adamenteus, C. h. horridus y C. v. viridis de norteamerica (Minton 1979). En nuestro estudio, se obtuvieron resultados mediante ELISA, pero con esta tecnica no se pudieron determinar los componentes especificos que contribuyen a la reactividad cruzada. En el caso del veneno de B. brazili (Fig. 6b, carril 2), las reacciones cruzadas ocurren con una intensidad casi similar a la del veneno homologo, lo que indicaria un alto grado de conservacion en la estructura de sus proteinas con las del veneno de B. atrox lo cual se correlaciona con los datos obtenidos por ELISA. Para el veneno de L. muta (Fig. 6b, carril 3), la mayor reactividad se concentro en componentes de alto y mediano peso molecular (20 - 60 kDa), donde se encuentran agrupados componentes como proteasas y otras toxinas hemorragicas. Finalmente, el veneno de C. durissus (Fig. 6b, carril 4), reacciono pobremente con el antiveneno, donde la mayor reactividad se concentro en un componente de alto peso molecular (> 66 kDa) que podria corresponder a su L-aminoacido oxidasa.

En el desarrollo de pruebas de inmunodiagnostico para identificacion rapida de la especie responsable de un envenenamiento, los componentes del veneno que reaccionan cruzadamente podrian dar lugar a ambiguedad o inclusive error en el diagnostico (Marshall & Herrmann 1984, McCarthy 1984, Ho et al. 1986). Los anticuerpos producidos contra el veneno de B. atrox mostraron una reactividad cruzada con los tres venenos heterologos, por lo que seria necesaria la preparacion de anticuerpos especificos de especie como paso preliminar en el desarrollo del kit de diagnostico. Una aproximacion para la obtencion de tales anticuerpos ha sido reportada en el trabajo de Sandoval et al. (2006), donde utilizando columnas de afinidad con el veneno inmovilizado de B. atrox se pudieron capturar los anticuerpos IgG especificos a partir del suero hiperinmune. Queda por analizar si estos anticuerpos reaccionan de forma cruzada o no contra otros venenos de serpientes empleando las tecnicas descritas en este trabajo.

Agradecimientos

El presente trabajo fue desarrollado gracias al apoyo recibido en marco del Convenio firmado entre la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Peru) y las Universidad de Liverpool y Oxford (Inglaterra).

Literatura citada

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Gustavo A. Sandoval (1), Julio Mendoza (1), William Roldan (2), Yrma Espinoza (2), Hilda Solis (2), Armando Yarleque * (1)

(1) Laboratorio de Biologia Molecular. Facultad de Ciencias Biologicas. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima -- Peru.

(2) Instituto de Medicina Tropical "Daniel Alcides Carrion". Facultad de Medicina Humana. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima -- Peru.

* Correspondencia: Dr. Armando Yarleque, Laboratorio de Biologia Molecular, Facultad de Ciencias Biologicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, apartado postal 110058, Lima 11, Peru.

E-mail: ayarleque48@gmail.com

Presentado: 12/02/2011

Aceptado: 23/07/2011

Publicado online: 08/02/2012
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Author:Sandoval, Gustavo A.; Mendoza, Julio; Roldan, William; Espinoza, Yrma; Solis, Hilda; Yarleque, Arman
Publication:Revista peruana de biologia
Date:Dec 1, 2011
Words:6264
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