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Inhibidores de proteasas de plantas efectivos contra las aspartico proteasas de Hypothenemus hampei.

Resumen: La broca del cafe (Hypothenemus hampei), produce las perdidas economicas mas graves al cultivo de cafe (Coffea arabica). En extractos proteinicos de insectos adultos se identificaron aspartico proteasas las cuales mostraron dos bandas de actividad proteolitica en los zimogramas y una actividad maxima a pH 2,5 en los ensayos espectrofotometricos. Esta enzima se clasifico como catepsina D considerando su inhibicion por pepstatina A y la hidrolisis de hemoglobina. Para encontrar inhibidores de las aspartico proteasas de H. hampei, se evaluaron extractos proteinicos de semillas de plantas no-huesped como: Lupinus bogotensis, Brachiaria humidicola, Amaranthus hypochondriacus, Phaseolus acutifolius, Phaseolus coccineus, Hyptis suaveolens, Centrosema pubescens y Trifolium repens. El extracto proteinico de L. bogotensis produjo la mayor inhibicion de las aspartico proteasas con una actividad especifica de 74,1 UI/mg; en comparacion con los extractos de H. suaveolens, B. humidicola y A. hypochondriacus que presentaron una inhibicion menor de las aspartico proteasas. Los demas extractos proteinicos no inhibieron la actividad aspartico proteasa. La actividad proteolitica de H. hampei se inhibio en un 90% con 100 [micro]g del extracto crudo de L. bogotensis, mientras que se necesito 1 mg de extracto crudo de H. suaveolens y B. humidicola para inhibir la actividad en 70 y 60%, respectivamente. Los zimogramas identificaron posibles inhibidores de proteasas en los extractos de L. bogotensis, H. suaveolens, B. humidicola y A. hypochondriacus que bloquearon in vitro la actividad de las aspartico proteasas del insecto. La expresion de genes de inhibidores de proteasas en cafe es una alternativa para obtener variedades resistentes.

Palabras clave: Lupinus bogotensis. Leguminosae. Inhibidor de aspartico proteasa. Aspartico proteasa. Itypothenemus hampei.

Abstract: The coffee berry borer, ttypothenemus hampei, is one of the most devastating coffee pests (Coffea arabica). Aspartic proteases were identified in protein extracts of adult insects, showing two bands of proteolytic activity in zymograms and a maximum activity at pH 2.5 in the spectrophotometric assays. Considering its inhibition by pepstatin A and hemoglobin hydrolysis this enzyme was classified as cathepsin D. Seeds extracts of Lupinus bogotensis, Brachiaria humidicola, Amaranthus hypochondriacus, Phaseolus acutifolius, Phaseolus coccineus, Hyptis suaveolens, Centrosema pubescens, and Trifolium repens were evaluated to identify aspartic protease inhibitors. The greatest inhibitory activity of aspartic proteases was found in L. bogotensis extract with a specific activity of 74.1 IU/mg, compared with extracts of li. suaveolens, B. humidicola, and A. hypochondriacus that showed a lower inhibition of aspartic proteases. Other protein extracts did not inhibit aspartic protease activity. The proteolytic activity of H. hampei was inhibited by 90% with 100 [micro]g of crude extract of L. bogotensis, whereas it took 1 mg of crude extract of H. suaveolens and B. humidicola to inhibit the activity at 70 and 60% respectively. The zymograms identified potential protease inhibitors in extracts of L. bogotensis, H. suaveolens, B. humidicola and A. hypochondriacus that blocked in vitro activity of aspartic proteases of the insect. The expression of protease inhibitor genes in coffee is an alternative to obtain resistant varieties.

Key words: Lupinus bogotensis. Leguminosae. Aspartic protease inhibitor. Aspartic protease. Hypothenemus hampei.

Plant protease inhibitors effective against aspartic proteases from Coffee Berry Borer (Hypothenemus hampei)

Introduccion

El cafe (Coffea spp., Rubiaceae) es el producto agricola mas importante en 70 paises de la region tropical humeda (Jaramillo et al. 2006). En Colombia, el cultivo de cafe representa el 12,4 % del producto interno bruto agropecuario (MADRIICA-OAC 2008). La broca del cafe, Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) (Coleoptera: Curculionidae) es el insecto plaga que causa las mayores perdidas economicas al calfe; debido a que se alimenta del endospermo disminuyendo el rendimiento y alterando la calidad del grano (Duque y Baker 2003; Bustillo 2008).

Muchos caficultores controlan H. hampei con insecticidas como endosulfan, clorpirifos, pirimifos metil y fenitrotion (Villalba et al. 1995). La creciente preocupacion ambiental y el incremento de la resistencia de H. hampei a los insecti cidas (Navarro et al. 2010), han estimulado la busqueda de estrategias de control amigables con el ambiente (Jaramillo et al. 2006). Entre estas estrategias, diversas proteinas vegetales tienen potencial para el control de insectos incluyendo las lectinas, los inhibidores de proteasas (IPs), los inhibidores de [alfa]-amilasas y las proteinas de almacenamiento de las semillas, vicilinas, leguminas y arcelinas (Macedo et al. 2007; Prasad et al. 2010; Barbosa et al. 2010; Sales et al. 2005).

La habilidad de los IPs para interferir con el crecimiento y desarrollo de insectos se atribuye a su capacidad para impedir el acceso al substrato, reduciendo la disponibilidad de aminoacidos de las proteinas ingeridas Ryan (1990); y en algunos casos ocasionando la muerte, como el inhibidor de tripsina Kunitz de soya sobre el coleoptero Anthonomus grandis Boheman, 1843 (Franco et al. 2004). Los IPs se clasifican segun la enzima digestiva con la que interactuan en serin, cistein, aspartico, metalo, glutamico y treonin proteasa (Laskowski et al. 2003). Segun, Molina et al. (2010) la digestion en el intestino medio de H. hampei es facilitada por aspartico proteasas activas al pH acido de esa region corporal (Ossa et al. 2000). De acuerdo con esta informacion, la inhibicion de las aspartico proteasas es un mecanismo de defensa promisorio para el control de este coleoptero.

Todas las plantas tienen algun nivel de resistencia endogena al ataque por insectos plaga. Sin embargo, como resultado de la co-evolucion los insectos se adaptan a los mecanismos de defensa de las plantas por evasion o detoxificacion (Gatehouse 2002). Por ejemplo, los coleopteros se alimentan de leguminosas que tienen un alto contenido de compuestos toxicos, mientras que otros insectos no utilizan estas semillas como fuente de alimento (Sales et al. 2005). Ademas, los insectos comprometen las estrategias de defensa de las plantas usando sus mecanismos de senalizacion, es asi como Helicoverpa zea (Boddie, 1850) emplea las moleculas de senalizacion, jasmonato y salicilato de las plantas huesped, para activar cuatro de sus genes citocromo P450, facilitando la induccion de sus enzimas de detoxificacion de manera rapida y especifica (Li et al. 2002). Esta asociacion es altamente especifica, por esto semillas de muy pocas especies sirven de alimento a un insecto particular (Gatehouse 2002).

La co-evolucion de H. hampei y el genero Coffea sugiere que es necesario evaluar el efecto de IPs de plantas nohuesped como leguminosas y solanaceas, en las cuales se han identificado IPs efectivos contra insectos (Sumikawa et al. 2010; Tamhane et al. 2007). Recientemente se identifico el primer inhibidor de aspartico proteasa de Lupinus bogotensis (LbAPI) que tiene una identidad de 76% con vicilinas de las semillas de Lupinus albus (Linnaeus, 1753). Esto sugiere que los IPs de aspartico proteasas son proteinas multifuncionales que actuan como proteinas de almacenamiento de las semillas, inhiben aspartico proteasas, y tambien pueden unirse a las estructuras que contienen quitina en el intestino medio de coleopteros como H. hampei (Molina et al. 2010). Sin embargo, para conseguir resistencia durable contra un insecto es necesario utilizar varios IPs, por esto el objetivo de este trabajo es la identificacion de inhibidores de las aspartico proteasas en plantas no-huesped y sus variaciones en especificidad contra las proteasas digestivas de H. hampei.

Materiales y Metodos

Materiales. Se evaluaron semillas de cinco plantas de la familia Fabaceae: L. bogotensis (Benth, 1845), Centrosema pubescens (Benth, 1839), Trifolium repens (Linnaeus, 1753), Phaseolus acutifolius (Gray, 1852) y Phaseolus coccineus (Linnaeus, 1753) y de una planta de la familia Poaceae: Brachiaria humidicola; estas semillas se adquirieron en la empresa Semicol (Bogota, Colombia). Tambien se probaron semillas de una Amaranthaceae: Amaranthus hypochondriacus (Linnaeus, 1753), y una Lamiaceae: Hyptis suaveolens (L., Poit. 1806), suministradas por el Centro de Investigaciones y de Estudios Avanzados (Cinvestav), Irapuato, Mexico.

Los insectos adultos de la broca del cafe proporcionados por la unidad de cria de Cenicafe (Chinchina, Colombia), se criaron en cafe pergamino seco con una humedad de 45% y se mantuvieron bajo condiciones controladas a una temperatura de 27[grados]C con una humedad relativa del 65-75%; los insectos empleados para la extraccion estaban recien emergidos de las semillas de cafe.

Se utilizaron reactivos grado analitico, NaC1, HC1, cloroformo, metanol y acido acetico de Merck (Darmstadt, Germany). La hemoglobina bovina, albumina serica bovina (BSA), pepsina (EC 3.4.23.1), pepstatina A, tripsina (EC 3.4 21.4), N a-benzoyl-L-arginine ethyl ester (BAEE), fenilmetilsulfonilo fluoruro (PMSF), acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), trans epoxisuccinilo-l-leucilo-amida (4) guanidino butano (E-64), Tris, dodecil sulfato de sodio (SDS), glicerol, casa comercial Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). La solucion de Bradford, la solucion de acrilamida-bis-acrilamida, persulfato de amonio de Bio-Rad (Hercules, CA, USA). La resina de exclusion Bio-Gel[R] P-6DG empacada en una columna Econo-Pac[R] 10DG de Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Las membranas de ultrafiltracion de 30 kDa (Amicon, Millipore) y el dispositivo de filtracion centrifuga Centriprep[R], membrana Ultracel YM-3, limite de peso molecular nominal 3 kDa (Amicon, Millipore) (Beverly, MA, USA). Las membranas de dialisis de 3,5 kDa (Spectra/Por[R]) (Broadwick Street, CA, USA).

Extraceion de las aspartieo proteasas de II. hampei (APH). Para la extraccion de las aspartico proteasas se maceraron lOO g de insectos adultos en 0,2 M de bufer succinico pH 6,0 en una relacion 1:5 p/v a 4[grados]C. El homogeneizado se centrifugo a 9.500 g por 15 mina 4[grados]C. El sobrenadante se dializo tres veces cada seis horas contra 5 1 de [H.sub.2]O con 100 ml de bufer succinico 50 mM pH 6,0 utilizando una membrana de 3,5 kDa (Spectra/Por[R]), el dializado se liofilizo y se utilizo como fuente de aspartico proteasas.

Ensayos de actividad inhibitoria. La actividad proteolitica de las aspartico proteasas de H. hampei y pepsina se determino evaluando la hidrolisis de hemoglobina a 280 nm en 0,2 M de bufer citrato, 0,1 M NaC1 pH 2,5 (Lenney 1975). El extracto proteinico se incubo con 1,3 mi de hemoglobina al 1% como sustrato. Despues de dos horas se adicionaron 2,5 ml de [C1.sub.3]C[O.sub.2]H 0,34 N para detener la reaccion. Una tmidad de actividad enzimatica se definio como la cantidad de enzima que cataliza un incremento en 0,01 unidades de absorbancia. El inhibidor se incubo con el extracto proteinico de H. hampei durante 15 min (Lenney 1975). Una unidad de inhibicion se definio como la diferencia entre las actividades proteoliticas medidas en ausencia y presencia del inhibidor. Las variables medidas fueron: las unidades de inhibicion por mi de extracto (UI [ml.sup.-1]), las unidades de inhibicion por gramo de tejido (UI [g.sup.-1]), las unidades de inhibicion totales (UI) y la actividad especifica, unidades de inhibicion por miligramo de tejido (UI [mg.sup.-1]). Se evaluo la inhibicion de las aspartico proteasas por E-64 (Oliveira et al. 2002); EDTA; PMSF (Schwertz y Takenaka 1955) y pepstatina A (Lenney 1975). Una concentracion final de 1 [micro]M se utilizo para todos los inhibidores con la excepcion de pepstatina A, el cual se uso en una concentracion final de 1 [micro]M.

Electroforesis en gel de poliacrilamida. La electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) se realizo segun Schagger y von Jagow (1987). Las proteinas usadas como estandar de peso molecular fueron: miosina (210 kDa), [beta]-galactosidasa (118 kDa), BSA (82 kDa), anhidrasa carbonica (40 kDa), inhibidor tripsina de soya (31 kDa), lisozima (17 kDa) y aprotinina (6 kDa). Las proteinas se detectaron por tincion con 0,1% de azul de Coomassie brillante G-250 por 30 min y la destincion se realizo con AcOH:[H.sub.2]O (1:9, v/v) por 1 h.

Zimogramas. Para el zimograma de actividad proteolitica 20 mg de extracto proteinico del intestino medio de H. hampei se separaron en un gel nativo al 10%. El gel se incubo en una solucion de hemoglobina al 1% en 0,2 M de bufer citrato pH 2,5 durante 1 h a 4[grados]C. Despues, se retiro el exceso de substrato y el gel se incubo durante 4 h a 30[grados]C. Finalmente, el gel se tino con azul de Coomassie durante 30 min, y se destino con AcOH:[H.sub.2]O (1:9, v/v) por 1 h.

En el zimograma de inhibicion se preincubaron 20 [micro]g de extracto proteinico del intestino medio de H. hampei con 40 [micro]g de los extractos de las semillas de L. bogotensis, A. hypochondriacus, B. humidicola e H. suaveolens durante 30 mina 30[grados]C. Despues, se siguio el mismo procedimiento descrito en el zimograma de actividad proteolitica.

Para el zimograma del inhibidor, los extractos crudos de las semillas se separaron por SDS-PAGE. El gel se incubo en una solucion de 1% de hemoglobina bovina en 0,2 M de bufer citrato pH 2,5 durante 1 h a 4[grados]C. Luego, el gel se lavo con [H.sub.2]O desionizada y se incubo en una solucion con 10 mg/ rol de extracto proteinico de H. hampei, durante 4 h a 30[grados]C. Finalmente, el gel se tino con azul de Coomassie durante 30 min, y se destino con AcOH:[H.sub.2]O (1:9, v/v) por 1 h. Los inhibidores de aspartico proteasas se observaron como bandas azules sobre fondo claro, porque las aspartico proteasas digieren la hemoglobina presente en el gel, a excepcion del lugar donde la banda (inhibidor) esta localizado.

Actividad de APH en funcion del pH. Para determinar la actividad de las aspartico proteasas en funcion del pH, el extracto crudo de adultos de H. hampei (1 mg/ml) se incubo 30 ruin a 37[grados]C con diferentes bufer (100 mM): citrato de sodio (pH 2-4), acetato de sodio (pH 5), fosfato de sodio (pH 6-7), Tris-HC1 (pH 7,5). Despues, se ajusto el pHa 2,5 para evaluar la actividad inhibidora contra las aspartico proteasas de H. hampei segun Lenney (1975). Los resultados representan el promedio de tres pruebas independientes.

Identificacion de los inhibidores de aspartico proteasas (IAP) en las semillas. Para la identificacion de los IAP se realizaron ensayos enzimaticos y zimogramas. 200 g de las semillas secas se molieron en un molino criogenico marca Restch, la harina se tamizo a traves de dos mallas de 1,4 mm y 0,85 mm en un separador estandar. La fraccion mas fina (150 g) se desgraso en agitacion durante 30 min en una mezcla de CH[Cl.sub.3]:MeOH (750 ml, 4:1, v/v); este proceso se repitio tres veces. La extraccion de proteinas a partir de harina seca (100 g) se realizo en [H.sub.2]O (500 mi) o 0,2 M de bufer succinico pH 4,5 por 6 h a 4[grados]C. Con todas las semillas se utilizo una relacion 1:5, p/v a excepcion de T. repens con una relacion de 1 : 10, p/v. La suspension se clarifico por centrifugacion a 7.500 g por 30 mina 4[degrees]C. El precipitado se descarto y la suspension liofilizada de los extractos de las semillas se adicionaron a una columna de exclusion por tamano EconoPac[R] 10DG, empacada con Bio-Gel P-oDG para eliminar pigmentos (Molina et al. 2010). La proteina del extracto proteinico se precipito con 80% de (N[H.sub.4])2S[O.sub.4]. El precipitado se disolvio en bufer Tris-HC1 20 mM pH 8,0, se dializo contra [H.sub.2]O desionizada en una membrana de 3,5 kDa (Spectra/ Por[R]) y se liofilizo. Las proteinas liofilizadas se disolvieron en 10 mi de bufer Tris-HCl 20 mM pH 8,0 para fraccionarlas por ultrafiltracion con una membrana de 30 kDa. Las fracciones eluidas de la membrana de 30 kDa, que mostraron actividad inhibidora contra las aspartico proteasas de H. hampei, se concentraron utilizando el dispositivo Centriprep[R], limite de exclusion 3 kDa y se utilizaron como fuente de inhibidor. Se evaluo la actividad inhibidora de los extractos crudos de las semillas contra H. hampei siguiendo el metodo de Lenney (1975).

Determinacion de proteina. La concentracion de proteina se determino por el ensayo de Bradford modificado por Zor y Selinger (1996) usando BSA como estandar.

Analisis estadistico. Para la determinacion de las mejores condiciones de extraccion de los IPs se utilizo un experimento multifactorial, los tratamientos evaluaron el empleo o no de desgrase y la extraccion con agua o 0,2 M de bufer succinico pH 4,5, se utilizo un diseno experimental completamente al azar y el numero de repeticiones 3. Para la identificacion de la semilla que produce la mayor inhibicion de las aspartico proteasas de H. hampei se realizo un experimento unifactorial, se utilizo un diseno experimental completamente al azar y el numero de repeticiones 3. La unidad experimental fue un tubo conteniendo las aspartico proteasas de H. hampei, el inhibidor de aspartico proteasas, el substrato y acido tricloroacetico.

A los experimentos se les aplico un analisis descriptivo: se estimaron el promedio y la varianza para las unidades de inhibicion totales (UI). Se comprobo la homogeneidad de varianza y se realizo el analisis de varianza, bajo un diseno completamente al azar. La comparacion de medias se realizo mediante prueba de Duncan al 5%. Los datos se procesaron en un computador IBM con el programa SAS version 9.1.

Resultados

Zimograma de las APH. Los zimogramas mostraron dos bandas de actividad aspartico proteasa en los extractos de intestinos (Fig. 1 A) y de adultos completos de H. hampei (Fig. 1B), resultados similares registro Molina et al. (2010). Tambien, Preciado et al. (2000) encontraron tres bandas de actividad proteolitica en el intestino medio y en brocas adultas. El hallazgo de actividad aspartico proteasa en el intestino medio confirmo su funcion digestiva. De acuerdo con estos resultados y considerando que H. hampei es de 0,8 a 0,7 mm de longitud (Bergamin 1943), se utilizaron extractos proteinicos de adultos completos, para obtener la cantidad suficiente de enzima para los ensayos de actividad proteolitica y de inhibicion.

Actividad de las APH en funcion del pH. Las APH son activas a pH entre 2 a 5, con una actividad maxima a pH 2,5 (Fig. 1C). Una caracteristica particular de este tipo de enzimas es su rango optimo de actividad a pH entre 2-6 (Silva y Xavier-Filho 1991; Blanco et al. 1996; Wilhite et al. 2000; Liu et al. 2004; Valencia y Arboleda 2005), el cual coincide con el pH acido del intestino medio de H. hampei (Ossa et al. 2000). La actividad de las APH se evaluo usando como sustrato hemoglobina y BSA, encontrando que las aspartico proteasas digirieron 100% de hemoglobina y 10% de BSA. Esto demostro que estas enzimas digestivas son catepsina D, como previamente registraron Valencia y Arboleda (2005).

Inhibicion de la actividad de las APH por IPs. Pepstatina A en una concentracion de 1 [micro]M inhibio la actividad proteolitica de H. hampei en 83,3% (Fig. 1D), al igual que lo registrado por Valencia y Arboleda (2005). Mientras que los inhibidores de serin proteinasa: PMSF (lmM), cistein proteinasa:

E-64 (lmM) y metaloproteinasa: EDTA (lmM), no inhibieron las enzimas digestivas del insecto. Esto confirmo la presencia de aspartico proteasas en el intestino medio.

[FIGURA 1 OMITIR]

Extraccion de los IAP en las semillas de L. bogotensis y B. humidicola. El extracto acuoso de L. bogotensis con harina desgrasada presento 8.764 UI y una actividad especifica de 97,4 UI [mg.sup.-1], siendo esta inhibicion significativamente superior al resto de los tratamientos, segun la prueba de Duncan al 5%. Del mismo modo, el extracto acuoso de B. humidicola con harina desgrasada mostro la mayor inhibicion de las APH con 2.426 UI son miles no decimas (Tabla 1). El empleo de harina desgrasada en la extraccion con agua o con bufer succinico 0,2 M pH 4,5, aumento significativamente la inhibicion (P<0,0001) de las APH (4.284 UI) en comparacion con la harina sin desgrasar (2.572 UI). Esto indica que la grasa interfiere con la determinacion de la actividad inhibidora de las APH. La extraccion de los IPs fue mejor con agua, obteniendose una inhibicion mayor de las proteasas de H. hampei (4.215 UI) que con bufer succinico 0,2 M pH 4,5 (2.641 UI). Con base en estos resultados se selecciono la extraccion de los inhibidores de aspartico proteasas de harina desgrasada y agua en una relacion 1:5, p/v.

[FIGURA 2 OMITIR]

Identificacion de IAP en los extractos vegetales. 100 [micro]g del extracto conteniendo los inhibidores de aspartico proteasas de L. bogotensis (IAPLb) disminuyeron en 100% y 90% la actividad de pepsina y de las APH, respectivamente (Fig. 2A); mientras que con B. humidicola e H. suaveolens se requiere 1 mg de extracto crudo para inhibir la actividad de las APH en 60% y 70%, respectivamente (Fig. 2B). Estos resultados son promisorios ya que se inhibio la actividad de las APH con una concentracion muy baja de IAPLb.

El extracto de L. bogotensis produjo la mayor inhibicion de las proteasas de H. hampei con 5.560 UI y una actividad especifica de 74,1 UI [mg.sup.-1], en comparacion con H. suaveolens, B. humidicola y A. hypochondriacus que fueron iguales, segun la prueba de Duncan al 5% (Tabla 2). Los extractos proteinicos de P. coccineus, P. acutifolius, T. repens y C. pubescens no inhibieron las aspartico proteasas de H. hampei. Las diferencias en la inhibicion podrian deberse a la selectividad que los inhibidores de plantas han desarrollado para reconocer enzimas especificas de insectos, a la inactivacion de los IPs por proteasas digestivas y a variaciones en afinidad entre los IPs y las enzimas digestivas (Ryan 1990).

[FIGURA 3 OMITIR]

Zimogramas para la identificacion de IAP. los zimogramas son determinaciones cualitativas, que se utilizaron para identificar las bandas de IPs en los extractos proteinicos, mientras que los ensayos de inhibicion cuantifican la inhibicion de las aspartico proteasas de II. hampei por los IPs de extractos de plantas. Valencia et al. (2007) usaron este metodo para la deteccion de inhibidores de [alpha]-amilasas de Phaseolus vulgaris (Linnaeus, 1753). La separacion electroforetica de los extractos proteinicos de las semillas mostro la presencia de bandas en un rango de masa molecular entre 6 a 30 kDa (Fig. 3A). El zimograma mostro que las bandas de proteina de B. humidicola, H. suaveolens, L. bogotensis y A. hypochondriacus son resistentes a la digestion por las APH del insecto; esto sugiere que son inhibidores tipo aspartico proteasa (Fig. 3B). Mientras que las proteinas de los extractos de C. pubescens, T. repens, P. acutifolius y P. coccineus, son digeridas por las aspartico proteasas de H. hampei y no actuan como IPs; confirmando los resultados de los ensayos de inhibicion.

Zimograma de inhibicion. En este zimograma (Fig. 3C) no se observaron las bandas de actividad proteolitica cuando se incubo el extracto de H. hampei con los inhibidores presentes en los extractos de L. bogotensis, B. humidicola, H. suaveolens y A. hypochondriacus, confirmando los resultados de los ensayos de inhibicion. Esto indica que los IPs se unen al sitio activo de las aspartico proteasas inhibiendo su actividad, lo cual se refleja en la desaparicion de las dos bandas de actividad proteolitica.

Discusion

Para la identificacion de inhibidores de las APH se utilizaron extractos

proteinicos de insectos adultos que representan la actividad aspartico proteasa. De forma similar, extractos de las larvas del coleoptero Tribolium castaneum (Herbst, 1797) se emplearon para purificar la aspartico proteinasa tipo catepsina D, debido a que los zimogramas mostraron actividad proteolitica en intestinos y larvas, demostrando la naturaleza digestiva de esta enzima (Blanco et al. 1996). En otra investigacion se encontro que en Prostephanus truncatus (Horn, 1878) la actividad [alpha]-amilasa es mayor en larvas de segundo instar y en adultos (Mendiola et al. 2000). Ademas, la actividad de [alpha]-amilasa y de tripsina de P. truncatus fue mas alta en adultos que en larvas; esto sugiere que es mejor utilizar adultos para evaluar el efecto de inhibidores de estas enzimas (Vasquez et al. 1999).

Las aspartico proteasas de H. hampei presentaron un rango optimo de actividad a pH 2 a 5. De manera similar, otros coleopteros como Callosobruchus maculatus (Fabricius, 1775), T. castaneum, P. truncatus, Hyperapostica (Gyllenhal, 1813), Zabrotes subfasciatus (Boheman, 1833), Leptinotarsa decemlineata (Say, 1824) y Diabrotica virgifera (LeConte, 1868), que utilizan aspartico proteasas para la digestion de las proteinas del alimento, tienen una actividad proteolitica optima en un rango de pH de 3 a 6 (Silva y Xavier-Filho 1991; Blanco et al. 1996; Vasquez et al. 1999; Wilhite et al. 2000; Lemos et al. 1990; Wolfson y Murdock 1987; Liu et al. 2004). En general, las aspartico proteasas se han encontrado en insectos de los ordenes hemiptera y coleoptero que se caracterizan por el pH acido del intestino medio (Houseman y Downe 1983).

La presencia de aspartico proteasas en el intestino medio de H. hampei se confirmo por su inhibicion con pepstatina A, este inhibidor ha sido utilizado para identificar aspartico proteasas en el intestino medio de varios coleopteros como T. castaneum, C. maculatus, Z. subfasciatus e H. hampei, por la perdida de la actividad proteolitica de la enzima (Blanco et al. 1996; Silva y Xavier-Filho 1991; Valencia y Arboleda 2005). La actividad aspartico proteasa del intestino medio de las larvas de Z. subfasciatus fue inhibida completamente con el empleo de 14 [micro]M de pepstatina A (Lemos et al. 1990). Del mismo modo, la actividad proteolitica del intestino medio de H. postica se redujo en 50% por la adicion de pepstatina A y del inhibidor de catepsina D de papa (Mares et al. 1989). Mientras que el inhibidor de aspartico proteasas de calabaza (SQAPI), que inhibe pepsina pero no catepsina D (Christeller et al. 1998), no inhibio la actividad proteolitica de H. postica, esto confirmo que catepsina D es la principal aspartico proteinasa de este gorgojo (Wilhite et al. 2000).

Se concluye que las aspartico proteasas de H. hampei son de tipo catepsina D porque digieren casi exclusivamente hemoglobina. De forma similar, la enzima aislada de T. castaneum se clasifico como catepsina D porque digiere unicamente hemoglobina (Blanco et al. 1996). Tambien, la aspartico proteinasa presente en el intestino medio de las larvas de C. maculatus es catepsina D porque digiere 100% de hemoglobina y 30% de BSA (Silva y Xavier-Filho 1991). Catepsina D es una de las aspartico proteasas mejor estudiadas en vertebrados y artropodos; esta enzima es responsable de la digestion intracelular y extracelular de proteinas en el lumen del intestino medio de muchos coleopteros donde las cistein proteasas son las enzimas digestivas mas importantes (Ahn y Zhu-Salzman 2009). En Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) esta involucrada en la produccion de vitelogenina (Cho y Raickel 1992). En Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) su actividad coincide con la hidrolisis del cuerpo graso (Rabossi et al. 2004). En Bombix mori (Linnaeus, 1758) su accion en la muerte celular programada es clave en la metamorfosis para la transformacion de pupa a larva (Lee et al. 2009). Esta enzima tambien participa en la digestion de la sangre en acaros y garrapatas (Boldbaatar et al. 2006).

En C. maculatus y Z. subsfasciatus las aspartico y cistein proteasas son responsables de la digestion de las proteinas del alimento (Silva y Xavier-Filho 1991). Es probable que en H. hampei ambas enzimas son responsables de la proteolisis como ocurre en otros coleopteros, debido a que las cistein proteasas son activas en un rango de pH entre 5 a 7, cercano al de H. hampei. El conocimiento del papel de los diferentes tipos de proteasas en el tracto digestivo del insecto, ayudara a entender los sitios de vulnerabilidad bioquimica, por esto es necesario continuar con la caracterizacion de las enzimas digestivas de la broca del cafe.

Las mejores condiciones para la extraccion de los inhibidores de las aspartico proteasas de semillas de plantas fueron el empleo de agua y de harina desgrasada. La extraccion con agua ha sido empleada para aislar inhibidores de Cicer arietinum (Linnaeus, 1753), Gossypium arboreum (Linnaeus, 1753), Arachis hypogea (Linnaeus, 1753), Psophocarpus tetragonolobus (L., DC. 1825), Solanum tuberosum (Linnaeus, 1753), e H. suaveolens (Harsulkar et al. 1999; Giri et al. 2003; Aguirre et al. 2004). El procedimiento de desgrase se ha utilizado con exito para la identificacion y purificacion de IPs en las semillas de A. hypochondriacus, Inga laurina (Sw., Willd. 1806), Cicer echinospermum (Davis, 1869), A. hypogea, y P. tetragonolobus (Valdes et al. 1993; Rodriguez et al. 2007; Harsulkar et al. 1999).

Se identificaron inhibidores de las aspartico proteasas de H. hampei en las semillas de L. bogotensis, B. humidicola, H. suaveolens y A. hypochondriacus, estos IPs bloquean la digestion de las proteinas del alimento en el intestino medio y podrian utilizarse para el control del insecto. La broca del cafe es monofaga, sugiriendo que su mecanismo de defensa podria ser menos complejo y mas vulnerable a la accion de IPs de plantas no-huesped que los insectos polifagos. Sin embargo, los estudios con IPs han mostrado que cuando se inhiben las proteasas mas importantes para la digestion de las proteinas del alimento en el intestino medio, se incrementa la actividad de otras enzimas insensibles al inhibidor y que en su ausencia no estan sobre-expresadas. Esto permite la digestion de las proteinas de la dieta en presencia del inhibidor y es fundamental para la supervivencia de los insectos (Zhu-Salzman et al. 2003; Amirhusin et al. 2007). En consecuencia, para una inhibicion efectiva de las enzimas digestivas de los insectos es necesaria la expresion de diversos IPs (Jongsma y Bolter 1997).

Para conseguir resistencia durable contra H. hampei, los IPs de las semillas de L. bogotensis, H. suaveolens y B. humidicola pueden transferirse a cafe mediante ingenieria genetica para producir plantas trangenicas con variaciones en la resistencia contra este insecto. Plantas de tabaco que expresan genes del inhibidor de proteinasa de tomate I (fuerte inhibidor de quimotripsina y debil de tripsina) y II (fuerte inhibidor de tripsina y quimotripsina) mostraron diferencias en la especificidad contra Manduca sexta Linnaeus, 1763 (Johnson et al. 1989). El crecimiento de las larvas de M. sexta que se alimentaron de las hojas de tabaco transformadas con el inhibidor de proteinasa II se redujo significativamente en comparacion con el crecimiento de las larvas que se alimentaron de las hojas sin transformar. Mientras, que el inhibidor de proteinasa I tuvo poco efecto en el crecimiento de las larvas de este lepidoptero (Johnson et al. 1989). Estos resultados muestran la importancia de identificar nuevos IPs con variaciones en la especificidad contra diferentes enzimas de los insectos (Mendiola et al. 2000).

H. hampei y C. arabica co-evolucionaron favoreciendo la adaptacion del insecto a los compuestos toxicos de la planta. Los IPs de L. bogotensis, H. suaveolens y B. humidicola, plantas no-huesped de la broca del cafe, inhiben las proteasas del insecto; mientras que los inhibidores de la planta huesped no bloquean las proteasas del insecto. Otros estudios han mostrado que los IPs de A. hypogaea, P tetragonolobus y S. tuberosum, plantas no-huesped de Helicoverpa armigera (Hubner, 1805) inhiben las isoproteinasas y el crecimiento de las larvas de este lepidoptero, en comparacion con los IPs de las plantas huesped (Harsulkar et al. 1999; Giri et al. 2003). De igual manera, el inhibidor de tripsina de Momordica charantia (Linnaeus, 1753) planta no-huesped de H. armigera y Spodoptera litura (Fabricius, 1775), afecto la fertilidad y fecundidad de las larvas de ambos insectos (Telang et al. 2003). Tambien, las vicilinas de leguminosas no-huesped de C. maculatus como P. vulgaris, Phaseolus lunatus (Linnaeus, 1753), Canavalia ensiformis (L., DC. 1825), y Glicine max (L., Merr. 1917) retardaron el desarrollo de las larvas del insecto (Yunes et al. 1998). Mientras que las vicilinas de Vigna angularis (Willd, 1969) una especie geneticamente cercana a la planta huesped Vigna Unguiculata (L., Walp. 1843) no afectaron el desarrollo de las larvas de este insecto (Yunes et al. 1998). Estos resultados muestran la importancia de evaluar IPs de plantas no-huesped contra las enzimas de insectos en la busqueda del control de plagas via transgenesis.

Los inhibidores presentes en el extracto crudo de L. bogotensis produjeron la mayor inhibicion de las aspartico proteasas de H. hampei usando una concentracion de extracto proteinico de 100 [micro]g, menor en comparacion con otras investigaciones que usaron 160 [micro]g de extracto crudo de M. charantia con una inhibicion del 84% de la actividad de las proteinasas del intestino de H. armigera (Telang et al. 2003). Del mismo modo, una concentracion diez veces mayor de extracto crudo de P. vulgaris y Amaranthus spp., solo inhibio la actividad [alpha]-amilasa de H. hampei en un 80% y 40%, respectivamente (Valencia et al. 2000). De forma similar, 1 mg de extracto crudo de Amaranthus cruentus (Linnaeus, 1759) solo inhibio 80% de la actividad amilasa de H. hampei (Valencia et al. 2000).

Estos resultados sugieren que los IAPLbs podrian ser buenos candidatos para transferir a cafe mediante ingenieria genetica para producir plantas resistentes contra H. hampei, debido a que inhiben las enzimas del insecto a bajas concentraciones y al pH encontrado en el intestino medio del insecto. Ademas, esta leguminosa no ha estado expuesta a H. hampei, proporcionando nuevos y mas potentes inhibidores de las proteasas de este insecto. Esto coincide con investigaciones previas que muestran que los IPs de plantas no-huesped son mejores para inhibir las proteasas de un insecto particular que los inhibidores de las plantas huesped (Harsulkar et al. 1999; Giri et al. 2003).

Conclusiones

Se identificaron inhibidores de las aspartico proteasas de H. hampei en diferentes semillas; los inhibidores de L. bogotensis produjeron una mayor inhibicion de las aspartico proteasas del insecto en comparacion con los IPs de H. suaveolens, B. humidicola y A. hypochondriacus. Los IPs se unen al centro activo de la enzima bloqueando su actividad proteolitica. Esto muestra que los IPs de plantas no-huesped pueden suministrar nuevos y mas potentes inhibidores de las proteasas de H. hampei. Estos inhibidores de proteasas pueden transferirse a cafe en la busqueda de resistencia durable contra H. hampei. Este trabajo junto con el de Scarafoni et al. (2008) y Molina et al. (2010) confirma la existencia de inhibidores de proteasas en las semillas de Lupinus spp., contrario a lo que se habia publicado de la falta de actividad inhibitoria de las proteasas de L. albus y Lupinus luteus (Linnaeus, 1753) (Gallardo et al. 1974).

Agradecimientos

Agradecemos al Ministerio de Agricultura y Desarrolo Rural de Colombia por la donacion de recursos para llevar a cabo este proyecto, a Colciencias por la beca de doctorado de Diana Molina, y a los revisores del manuscrito.

Recibido: 27-ago-2010 * Aceptado: 2-jun-2011

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DIANA MOLINA V (1), ALEJANDRO BLANCO-LABRA (2) y HUMBERTO ZAMORA E. (3)

(1) Investigador Cientifico Ph.D. Centro Nacional de Investigaciones de Cafe (Cenicafe), Disciplina de Mejoramiento genetico, Plan Alto Km. 4 - via antigua a Manizales, Chinchina, Caldas, Colombia. Diana.molina@cafedecolombia.com. Autor para correspondencia. (2) Investigador titular Ph.D. Departamento de Biotecnologia y Bioquimica, Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados (Cinvestav) Unidad Irapuato, Km 9.6 Libramiento Norte, Carretera Irapuato - Leon, C.P. 36821 lrapuato, Guanajuato, Mexico. ablanco@ira.cinvestav.mx. (3) Profesor asociado Ph.D. Departamento de Quimica, Universidad Nacional de Colombia, Carrera 30 #45-03, Ciudad universitaria, Bogota, Cundinamarca, Colombia. hmzamorae@unal.edu.co
Tabla 1. Actividad inhibidora de los IAPs de las semillas de
L. bogolensis y B. humidicola contra las APH.

Especie         Tratamiento               Bufer

L. bogolensis   Desgrasado                Agua
L. bogolensis   Desgrasado      B succinico 0.2 M pH 4.5
L. bogolensis   Sin desgrasar             Agua
L. bogolensis   Sin desgrasar   B succinico 0.2 M pH 4.5
B. humidicola   Desgrasado                Agua
B. humidicola   Desgrasado      B succinico 0.2 M pH 4.5
B. humidicola   Sin desgrasar             Agua
B. humidicola   Sin desgrasar   B succinico 0.2 M pH 4.5

                                 Actividad      Actividad
                                 inhibicion     especifica
Especie         UI [ml.sup.-1]    total UI    UI [mg.sup.-1]

L. bogolensis       219.1           8764 *         97.4
L. bogolensis       123.3           4314           47.9
L. bogolensis       109.8           4391           48.8
L. bogolensis        88.4           3449           38.3
B. humidicola        73.5           2426           27.0
B. humidicola        52.7           1633           18.1
B. humidicola        42.7           1280           14.2
B. humidicola        34.3           1167           13.0

* = p<0.0001.

Tabla 2. Actividad inhibidora de los IAPs de las semillas de
L. bogotensis, B. humidicola, A. hypochondriacus e H. suaveolens
contra las APH.

                                      Actividad inhibicion
Especie              UI [ml.sup.-1]         total UI

L. bogotensis            139,0               5560 A
B. humidicola             58,0               1380 B
H.suaveolens              29,6               1392 B
A. hypochondriacus        16,8              673,3 B

                                     Actividad especifica
Especie              UI [g.sup.-1]      UI [mg.sup.-1]

L. bogotensis            556,0               74,1
B. humidicola            138,0               18,6
H.suaveolens             139,0               18,4
A. hypochondriacus       67,3                9,0

Promedios seguidos por la misma letra son iguales (P<0,0001).
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Title Annotation:Seccion Agricola
Author:Molina V., Diana; Blanco-Labra, Alejandro; Zamora E., Humberto
Publication:Revista Colombiana de Entomologia
Date:Jul 1, 2011
Words:8561
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