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Influencia de las bacterias psicrotrofas en la actividad proteolitica de la leche.

RESUMEN

La refrigeracion de la leche reduce el ritmo de multiplicacion y actividad de los microorganismos, pero ha generado nuevos problemas relacionados con el crecimiento y la actividad de los microorganismos psicrotrofos, que son aquellos que crecen a temperaturas inferiores a 7 [grados]C, independientemente de su temperatura optima. Estos microorganismos producen enzimas termoestables que degradan algunos componentes de la leche deteriorando su calidad y la de sus derivados, y disminuyendo los rendimientos queseros. Con el fin de evaluar la actividad proteolitica de las bacterias psicrotrofas sobre las caseinas y su relacion con la temperatura y tiempo de almacenamiento de la leche, se inocularon diferentes lotes de leche con este tipo de bacterias, hasta obtener recuentos de [10.sup.4] y [10.sup.5] unidades formadoras de colonia por mililitro (ufc/ml); como control se utilizo leche que no recibio inoculacion con recuento de psicrotrofos de [10.sup.3] ufc/ml. Despues de almacenar la lechea4 y 7[grados]C durante tres y seis dias, se evaluo la actividad proteolitica sobre las caseinas. Al almacenar leche durante tres dias a 4 y 7 [grados]C,nose presento actividad proteolitica cuando el recuento inicial de psicrotrofos era del orden de [10.sup.3] ufc/ml, mientras que cuando dicho recuento fue superior a [10.sup.4] ufc/ml se observo actividad proteolitica, siendo mas intensa a 7 [grados]C que a 4 [grados]C. Con almacenamiento de seis dias, solamente la leche conservada a 4 [grados]C con recuento inicial de [10.sup.3] ufc/ml no presento actividad proteolitica, los demas tratamientos mostraron gran actividad proteolitica sobre la fraccion de caseinas aumentando dicha actividad a medida que aumenta el grado de contaminacion.

Palabras clave: leche, refrigeracion, psicrotrofos, Pseudomonas fluorescens, proteolisis, caseinas.

INFLUENCE OF PSICHROTROPHIC BACTERIA IN PROTEOLYTIC ACTIVITY OF MILK

ABSTRACT

Refrigeration of milk reduces the rate of multiplication and activity of microorganisms, but it has generated new problems related to the growth and activity of psichrotrophic microorganisms, which are those that grow at temperatures lower than 7 [degrees]C, no matter the optimum temperature. They produce thermostable enzymes that degrade some components of milk, deteriorating its quality and the one of dairy products. Proteolytic activity in the milk caused by these microorganisms, has relation with several problems of quality and yield of dairy products. In order to evaluate proteolytic activity of psichrotrophic bacteria on casein and its relation with the temperature and time of storage of milk, different lots from milk were inoculated with psichrotrophic bacteria, until obtaining counts of [10.sup.4] and [10.sup.5] units of colonies formers/mL (ucf/ml); as control was used milk that did not receive inoculation with a count of [10.sup.3] ucf/ml. After storing milk at 4 [degrees]C and 7 [degrees]C during three and six days, proteolytic activity on casein was evaluated. Milk stored during three days at 4[grados]C and 7[grados]C, did not show difference in proteolytic activity by temperature effect when the initial count was [10.sup.3] ucf/ml, but when count was [10.sup.4] ucf/ml or more, proteolytic activity was observed. When milk was stored during six days, only the milk conserved at 4 [grados]C with initial count of [10.sup.3] ucf/ml, did not display proteolytic activity, the other treatments showed great proteolytic activity on casein being greater at 7 [grados]C than at 4 [grados]C, and increasing this activity as the contamination level was greater.

Key words: Storage of milk, psichrotrophic, Pseudomonas fluorescens, proteolysis, casein.

INTRODUCCION

La refrigeracion de la leche disminuye la actividad de los microorganismos, pero favorece la seleccion de los psicrotrofos; dichos microorganismos representan menos del 10% de la microbiota de la leche higienica sin refrigerar, pero en leches con mala calidad higienica pueden llegar a constituirse en las bacterias predominantes, tras permanecer almacenada de dos a tres dias bajo condiciones de refrigeracion (1).

Los microorganismos psicrotrofos mas prevalentes en leches crudas pertenecen principalmente al genero Pseudomonas y dentro de este, la especie mas comunmente encontrada es Ps. fluorescens, situacion que se observa en muchos paises (2). A medida que aumenta el numero de microorganismos psicrotrofos en la leche, estos sintetizan enzimas, muchas de las cuales son termoestables, causando alteraciones bioquimicas en los componentes

de la leche. La proteolisis de la leche puede causar disminucion en el rendimiento quesero y cambios en el comportamiento del liquido durante el tratamiento termico, o cambios en la calidad de los productos lacteos (3, 4). Se ha detectado presencia de proteasas en leche, con recuentos de microorganismos psicrotrofos del orden de 106 ufc/ml (5). La sintesis de enzimas ocurre optimamente en la mayoria de las bacterias psicrotrofas entre 20 y 30 [grados]C, sin embargo, a temperaturas bajas se presenta una sintesis considerable (6).

Tras elevarse el conteo de bacterias psicrotroficas en la leche con una cepa de Pseudomonas fluorescens hasta 1,2 x [10.sup.7] ufc/ml, con 24 horas de crecimiento a 7 [grados]C, se duplica el grado de proteolisis con relacion al testigo, y luego de 72 horas de crecimiento tambien a 7 [grados]C, con un conteo de 4,5 x [10.sup.9] ufc/ml, se incrementa la actividad proteolitica en catorce veces con relacion al testigo, mostrando la gran incidencia del nivel de contaminacion en la actividad proteolitica, cuando la leche se almacena a 7 [grados]C o mas (7).

Las proteinas del suero son menos susceptibles de sufrir proteolisis que las caseinas. Las caseinas son las proteinas mas importantes de la leche desde el punto de vista industrial, pues la mayoria, imparten propiedades funcionales a la leche como la termoestabilidad y capacidad de coagulacion, conforman la estructura del queso determinando el rendimiento industrial, tambien influyen directamente en las caracteristicas fisicoquimicas y sensoriales de los productos lacteos.Amedida que se presenta proteolisis de la caseina en la leche durante el almacenamiento, menor es la cantidad disponible para su incorporacion dentro del reticulo de la cuajada durante la elaboracion de quesos, ocasionando una disminucion en el rendimiento (8).

El objetivo de la presente investigacion fue estudiar la actividad proteolitica sobre las caseinas de la leche por el almacenamiento refrigerado a 4 y 7 [grados]Cdurante tres y seis dias, cuando se inicia con diferentes recuentos de bacterias psicrotrofas, con el fin de determinar la importancia de la temperatura y el recuento de psicrotrofos en la conservacion de la leche refrigerada.

MATERIALES Y METODOS

La leche cruda se selecciono segun los criterios fisicoquimicos establecidos en la legislacion colombiana con el fin de asegurar que no presentara alteraciones o deficiencias en la calidad que pudieran afectar los resultados; ademas, se le realizo el recuento en placa de bacterias psicrotrofas segun el metodo de la Federacion Internacional de Lecheria (9), con el objeto de seleccionar solamente leches con bajos recuentos iniciales.

Inoculacion de la leche con bacterias psicrotroficas. La leche se inoculo con caldo infusion cerebro corazon que contenia 108 ufc/ml de la bacteria psicrotrofa Pseudomonas fluorescensATCC 31732, hasta lograr recuentos de psicrotrofos de [10.sup.4] y [10.sup.5] ufc/ml. Como control se utilizo leche sin inoculo con recuento de [10.sup.3] ufc/ml.

Almacenamiento de la leche. Despues de la contaminacion con el inoculo, la leche se almaceno a 4 y 7 [grados]Cdurante 3 y 6 dias, realizandose un control el dia de la inoculacion. Los niveles de contaminacion y la temperatura de almacenamiento se denominaran con las letras bajo (B), medio (M) y alto (A) correspondientes a los recuentos [10.sup.3], [10.sup.4] y [10.sup.5] ufc/ml respectivamente, y los numeros 4 y 7 para las temperaturas 4 y 7 [grados]C, respectivamente.

Fraccionamiento de las proteinas lacteas. Despues del almacenamiento refrigerado de la leche, de cada tratamiento se tomo una muestra de 200 ml, se retiro la grasa por centrifugacion a 11.000 xGdurante 20 minutos a 4 [grados]C; las caseinas se precipitaron a pH 4,6 con buffer acetato. La fraccion obtenida se dializo contra agua desionizada a 4 [grados]C, hasta conseguir fin de acetatos en 3-4 dias, luego se liofilizo y se almaceno a -40 [grados]C; a los liofilizados se les analizo el contenido de proteina por el metodo de Kjeldhal utilizando un equipo Foss Tecator, colocando una cantidad de muestra con un contenido aproximado de 150 mg de proteina.

Evaluacion de la actividad proteolitica. Se determino a traves del cambio en el perfil electroforetico de las caseinas, con electroforesis unidimensional, discontinua, en gel de poliacrilamida, con 15% T y 2,7% C, en condiciones desnaturalizantes, aplicando dodecil sulfato sodico (SDS) y -mercaptoetanol. Las electroforesis se corrieron a voltaje constante -200 V y 14 W-, en un equipo Bio-Rad Mini protean II Slab Cell. Las muestras liofilizadas se diluyeron en bicarbonato de amonio 20 milimolar (mM), aplicando 15 g de proteina en cada carril. Se utilizaron los patrones de peso molecular marca Sigma, con pesos moleculares entre 6,5 y 205 kdalton (kDa), referencia M4038. Los geles se tineron con solucion de azul de Comassie R-250, metanol y acido acetico. El perfil electroforetico de las caseinas se examino por densitometria utilizando un analizador de geles Gene Snap Analiza, Genetic System CM 615, marca Hitachi.

Analisis estadistico. El recuento de bacterias psicrotrofas en la leche despues del almacenamiento refrigerado se realizo por triplicado y se analizo mediante estadistica descriptiva. Debido a la complejidad de los analisis electroforeticos, estos no tuvieron replicas, por lo cual se describe la intensidad de las bandas de la fraccion de caseina, sin hacer referencia a ningun tipo de analisis estadistico.

RESULTADOS

El recuento promedio de bacterias psicrotrofas obtenido en la leche almacenada a 4 y 7 [grados]C durante 3 y 6 dias, con diferentes niveles de contaminacion inicial, se presenta en la tabla 1.

Se considera un alto nivel de contaminacion cuando el recuento de bacterias psicrotrofas alcanza el nivel critico de 106 ufc/ml (2, 5). En la tabla 1 se observa que el recuento de bacterias psicrotrofas se acerca a dicho valor, con un almacenamiento de 3 dias a 4 y 7 [grados]Ccuando el recuento inicial es [10.sup.5] ufc/ml, mientras que no se presenta gran crecimiento bacteriano en tres dias cuando se inicia con un recuento de [10.sup.3] ufc/ml, ni a 4 [grados]Ccuando el recuento inicial es del orden de [10.sup.4] ufc/ml. Con 6 dias de almacenamiento -aunque es un tiempo considerado muy prolongado para conservar leche cruda-, si el recuento inicial no supera el valor de [10.sup.3] ufc/ml y la temperatura de almacenamiento no sobrepasa los 4 [grados]Cse obtiene un recuento por debajo de este valor critico de 106 ufc/ml; los demas tratamientos superan este limite, indicando que sufrieron fuerte crecimiento bacteriano.

Efecto del nivel de contaminacion inicial, temperatura y tiempo de almacenamiento de la leche en la actividad proteolitica:

Tres dias de almacenamiento. La figura 1 presenta el electroforegrama correspondiente a la fraccion de caseinas de la leche almacenada durante 3 dias a 4 y 7 [grados]C.La disminucion en intensidad o desaparicion de bandas de alto peso molecular, el aumento de intensidad de las de bajo peso molecular indican actividad proteolitica.

Se aprecia que los perfiles electroforeticos de los tratamientos B4, M4, A4 y B7 son bastante similares, mientras que con los tratamientos M7 y A7, se presenta disminucion de la intensidad de las bandas de mayor peso molecular (31 y 28 kDa), con aumento de intensidad de las de menor peso molecular (18 y 11 kDa). En las figura 2 y 3 se muestran los densitogramas de la banda con peso molecular 31 kDa, correspondiente al electroforegrama de la figura 1; se ha colocado un valor arbitrario de 100 a la intensidad de la banda del tratamiento B4.

En las figuras 1 a 3 se aprecia que los tratamientos M7 y A7 presentan la mayor disminucion en intensidad de la banda mas pesada (31 kDa), y aumento en la intensidad de la banda 18 kDa, indicando que no se presenta actividad proteolitica en las leches con los tratamientos que obtuvieron recuentos de hasta [10.sup.4] ufc/ml en tres dias (tabla 1), mientras que los que lograron recuentos de [10.sup.5] y de [10.sup.6] ufc/ml, mostraron actividad proteolitica, con excepcion del tratamiento A4, que aunque en 3 dias alcanzo un recuento cercano a [10.sup.6] ufc/ml no presento actividad proteolitica, debido a la baja temperatura de almacenamiento, lo cual indica que el no superar los 4 [grados]C como temperatura de almacenamiento puede conferir cierto grado de proteccion contra la proteolisis de las caseinas, al menos durante tres dias. Estos resultados tambien demostraron que niveles de [10.sup.5] ufc/ml, provocan actividad proteolitica en la leche, muy cercanos a lo reportado por muchos autores (2, 5) que aseguran que la actividad proteolitica se presenta con recuentos de psicrotrofos del orden de [10.sup.6] ufc/ml.

[FIGURA 1 OMITIR]

Al almacenar leche con recuentos iniciales de psicrotrofos de [10.sup.3], [10.sup.4] y [10.sup.5] ufc/ml durante tres dias a 4 y 7 [grados]C, no se presento diferencia en la actividad proteolitica por efecto de temperatura cuando el recuento inicial es del orden de [10.sup.3] ufc/ml, mientras que cuando el recuento de psicrotrofos es superior a [10.sup.4] ufc/ml se observo actividad proteolitica, sin presentarse diferencias marcadas entre los recuentos iniciales de [10.sup.4] y de [10.sup.5] ufc/ml, lo que indica que cualquier contaminacion con psicrotrofos, aunque sea leve, es muy relevante para la actividad proteolitica.

Seis dias de almacenamiento. En la figura 4 se observa el electroforegrama de la fraccion de caseina de leche con tres niveles de contaminacion inicial y almacenada durante seis dias a 4 y 7 [grados]C. Se aprecio disminucion de la intensidad relativa de las bandas de mayor peso molecular con aumento de las mas livianas en los tratamientos B7, M7 y A7.

En las figuras 5 y 6 se presentan los densitogramas para las bandas con pesos moleculares de 31 kDa y 11 kDa, asignando un valor arbitrario de 100 a la intensidad de la banda 31 kDa del tratamiento B4.

En las figuras 4 a 6 se aprecia una leve disminucion en intensidad de la banda 31 kDa, con los tratamientos M4, A4 y B7, con intensidades del 68, 62 y 58% con relacion a la intensidad de la banda de referencia, mientras que con los tratamientos M7 y A7 la disminucion de la intensidad de dicha banda es mas fuerte mostrando intensidades de 18 y 22% respectivamente.

[FIGURA 4 OMITIR]

En la figura 5 se observa la aparicion de una nueva banda liviana de peso 11 kDa, que no se observa en el tratamiento B4, la cual presenta baja intensidad con los tratamientos M4 y A4, pero aumenta cuando la leche se almacena a 7 [grados]C y sobre todo en la leche que recibio inoculacion (M7 y A7), que tenia recuentos por encima de [10.sup.7] ufc/ml despues de seis dias de almacenamiento.

DISCUSION

Los resultados microbiologicos indican que es posible almacenar leche hasta por seis dias sin que el recuento de bacterias psicrotroficas alcance el valor critico de [10.sup.6] ufc/ml, si se combina el frio con la limpieza; la sola refrigeracion sin adecuadas practicas higienicas resulta insuficiente, tal como lo describenViejo y Sorhaug (7, 10). Existe una gran diferencia en el crecimiento de este tipo de bacterias cuando la leche se almacena a 7 [grados]C con relacion a cuando se almacena a 4 [grados]C, indicando que el incremento de 3 [grados]C en los tanques de almacenamiento de leche cruda es grave; esta diferencia es mas notoria cuando el recuento inicial es alto. Cuando no se dispone de frio suficiente para bajar la temperatura a 4 [grados]C, solamente se puede almacenar la leche durante tres dias, pero contando con un recuento inicial menor de [10.sup.3] ufc/ml.

Los resultados obtenidos muestran que al almacenar leche con tres niveles de contaminacion durante seis dias a 4 y 7 [grados]C, solamente el tratamiento B4, con recuento inicial y final de psicrotrofos de [10.sup.3] y [10.sup.4] ufc/ml respectivamente, no presenta actividad proteolitica, los demas tratamientos presentan gran actividad proteolitica sobre la fraccion de caseinas siendo mayor a 7 [grados]C que a 4 [grados]C, y aumentando la actividad proteolitica a medida que aumenta el grado de contaminacion.

Mientras que Guerrero (11) encontro moderada actividad proteolitica en leches refrigeradas con recuentos del orden de [10.sup.7] ufc/ml almacenadas hasta por 3 dias a 7 [grados]C, en este estudio se pudo diferenciar la actividad proteolitica que se presenta entre 4 y 7 [grados]C, y entre recuentos iniciales de psicrotrofos de [10.sup.3] y [10.sup.5] ufc/ml, encontrandose que la combinacion de 4 [grados]C y recuento inicial maximo de [10.sup.3] ufc/ml, permite conservar la leche hasta por seis dias sin que se presente actividad proteolitica sobre las caseinas de la leche, mientras que con recuentos superiores o temperaturas de 7 [grados]C, la conservacion de la leche no sobrepasa los tres dias. La conservacion de la leche por mas de tres dias sin que se presente deterioro de la calidad podria ser de gran utilidad principalmente en epocas de abundancia, cuando se acumula gran cantidad de leche en los tanques de las fabricas de lacteos, tambien permitiria ahorro en los costos de transporte, al disminuir la frecuencia de la recogida de la leche de los hatos.

CONCLUSIONES

Cuando la leche inicia con recuentosmuybajos de bacterias psicrotroficas ([10.sup.3] ufc/ml), con tres dias de almacenamiento, no se ven diferencias entre 4 y 7 [grados]C, en la actividad proteolitica sobre las caseinas; pero cuando la leche presenta recuentos medios o altos de bacterias psicrotroficas ([10.sup.4] o [10.sup.5] ufc/ml respectivamente), se presenta aumento de la actividad proteolitica sobre la caseina, siendo mayor a 7 [grados]C que a 4 [grados]C.

Al almacenar leche con tres niveles ascendentes de contaminacion durante seis diasa 4 y 7 [grados]C, se presenta gran actividad proteolitica sobre la fraccion de caseinas siendo mayor a 7[grados]C que a 4 [grados]C, aumentando la actividad proteolitica amedida que aumenta el grado de contaminacion, sugiriendo que existe interaccion entre el grado de contaminacion con bacterias psicrotroficas y la temperatura de almacenamiento.

Se aprecia mayor actividad proteolitica sobre la fraccion de caseinas cuando la leche se almacena durante seis dias que cuando se almacena solamente tres dias, principalmente en los tratamientos con los niveles de contaminacion [10.sup.4] y [10.sup.5] ufc/ml conservados a 7 [grados]C.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan su agradecimiento al Departamento de Quimica de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia.

BIBLIOGRAFIA

(1.) Costa M. Cinetica de crecimiento y produccion de proteasas de Pseudomonas fluorescens en leche cruda a temperaturas de refrigeracion. Archivos Latinoamericanos de Nutricion (51):371-374, 2001.

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(9.) International Dairy Federation. Determinacion de bacterias psicrotroficas en leche. Metodo 101 A., 1991.

(10.) Sorhaug T, Stepaniak l. Psychrotrophs and their enzymes in milk and dairy products: Quality aspects. Trends Food Sci Tech (8):35-40, 1997.

(11.) Guerrero l. Proteolisis de la leche cruda almacenada en frio. Efecto de las enzimas proteoliticas sobre la integridad de las caseinas. Rev Cient (3):187-192, 2003.

Novoa, CF (1), Restrepo LP (2) Departamento de Quimica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia.

(1) cfnovoac@unal.edu.co

(2) lprestrepos@unal.edu.co
Tabla 1. Recuento de bacterias psicrotrofas en leche despues del
almacenamiento

Recuento inicialde       Temperatura de
bacterias psicrotrofas   almacenamiento   Tiempo dealmacenamiento

(log ufc/ml)              ([grados]C)     tres dias(log ufc/ml) *

3,00 (nivel bajo)              4          2,61 [+ o -] 0,27
                               7          3,31 [+ o -] 0,58

4,00 (nivel medio)             4          4,41 [+ o -] 0,58
                               7          5,24 [+ o -] 0,97

5,00 (nivel alto)              4          5,90 [+ o -] 0,61

Recuento inicialde       Temperatura de
bacterias psicrotrofas   almacenamiento   Tiempo dealmacenamiento

(log ufc/ml)              ([grados]C)     seis dias(log ufc/ml)*

3,00 (nivel bajo)              4          4,64 [+ o -] 0,08
                               7          7,46 [+ o -] 0,73

4,00 (nivel medio)             4          5,99 [+ o -] 0,48
                               7          7,74 [+ o -] 0,21

5,00 (nivel alto)              4          7,20 [+ o -] 0,44

* Promedio y desviacion estandar de tres repeticiones.

Figura 2. Intensidad relativa de la banda 31 kDa, de la fraccion
De caseinas de leche almacenada a 4 y 7 [grados]C durante
3 dias.

B4        100
M4         59
A4         76
B7        105
M7         39
A7         49

Nota: tabla derivada de grafico de barra.

Figura 3. Intensidad relativa de la banda 18 kDa, de la fraccion
De caseinas de leche almacenada a 4 y 7 [grados]C durante 3 dias.

B4          9
M4          8
A4          7
B7         15
M7         48
A7         66

Nota: tabla derivada de grafico de barra.

Figura 5. Intensidad relativa de la banda 31 kDa, de la fraccion
De caseinas de leche almacenada a 4 y 7 [grados]C durante 6 dias.

B4        100
M4         68
A4         62
B7         58
M7         18
A7         22

Nota: tabla derivada de grafico de barra.

Figura 6. Intensidad relativa de la banda 11 kDa, de la fraccion
De caseinas de leche almacenada a 4 y 7 [grados]C durante 6 dias.

B4         0
M4         3
A4         4
B7        23
M7        33
A7        35

Nota: tabla derivada de grafico de barra.
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Author:Novoa, C.F.; Restrepo L.P.
Publication:Revista Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
Date:Jan 1, 2007
Words:4094
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