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Influence of NaCl and pH concentration on the extraction of ricin in castor bean (Ricinus communis L.) and its characterization by electrophoresis/Influencia da concentracao de NaCl e pH na extracao de ricina em torta de mamona (Ricinus communis L.) e sua caracterizacao por eletroforese.

INTRODUCAO

A mamoneira (Ricinus communis L.) e uma oleaginosa de alto valor economico pelo fato de apresentar um mercado bem definido para o oleo extraido de suas sementes. Atualmente um grande interesse tem sido dado a torta, residuo desta extracao, por seu alto teor de proteinas (GODOY et al., 2009) Dentre as proteinas encontradas na torta destaca-se a ricina, uma citotoxina, que inviabiliza sua utilizacao como fonte proteica alternativa para alimentacao animal (ANANDAN et al., 2005; STEPHAN et al., 2008).

A ricina e uma proteina heterodimerica constituida por duas cadeias, A e B, ligadas covalentemente por pontes de dissulfeto. Esta proteina pertence a familia das proteinas inibidoras de ribossomo (RIPs) do tipo II (OLSNES, 2004; LORD et al., 1994;. MONZINGO et al., 1993). Na sua forma enzimatica ativa a ricina tem como mecanismo de acao atuacoes diferenciadas das cadeias A (32kDa) e B (34kD). A cadeia A da ricina (32KDa) e uma enzima com atividade N-glicosidica (LORD et al., 1994) que permite a remocao de um residuo de adenina no loop de rRNA (RNA ribossomal 28s) e causa a inativacao especifica e reversivel dos ribossomos eucarioticos, bloqueando a sintese de proteina. Este ciclo esta envolvido na ligacao da cadeia A na fase de alongamento da cadeia polipeptidica, modificando estruturalmente os ribossomos e tornando-os incapazes de realizar a sintese de proteinas (ENDO et al., 1991). A cadeia B (RTB cerca de 34KDa) e uma lectina (LORD, 1994) que se liga a galactose ou a N-acetilgalactosamina das glicoproteinas da superficie da celula promovendo, desta maneira, a endocitose da toxina no citosol. (ENDO & TSURUGI, 1987). A toxina e potencialmente letal para os seres humanos se inalada, ingerida ou injetada (AUDI et al., 2005). Alguns trabalhos cientificos utilizaram a tecnica de eletroforese para detectar a presenca de ricina, utilizando colunas de amido, eletroforese em papel e gel de acrilamida (MACKINNON & ALDERTON, 2000). Esta tecnica e semiquantitativa, pois permite ter uma nocao da massa molecular da proteina, embora nao forneca valores exatos de concentracao que possam ser analisados. Trata-se de uma tecnica muito util e de grande sensibilidade para estudos com ricina (GODOY et al., 2009). A utilizacao desta tecnica para futuros estudos de perda de integridade proteica e uma realidade e deve ser conduzida utilizando tampoes e solucoes adequadas e de melhor capacidade de extracao da ricina.

MATERIAL E METODOS

A cultivar de mamona utilizada neste trabalho foi a 'Paraguacu', cedida pela Embrapa Algodao, Campina Grande, PB, Brasil. As sementes foram prensadas em prensa Expeller para obtencao da torta. A torta desengordurada foi moida em moinho de disco e faca da marca Perten 3600 (1680rpm) de peneira de 0,8mm. Para estudo do teor de proteina extraida da torta estabeleceu-se um delineamento do tipo composto central rotacional de 2a ordem (BOX et al., 1978). O modelo de regressao utilizado foi de superficie de resposta com objetivo de estimar os efeitos simples (lineares e quadraticos) e/ou interacoes que contribuiram para a predicao da resposta do experimento. A visualizacao do comportamento desses efeitos foi realizada atraves da representacao grafica. Os parametros do delineamento estabelecidos como variaveis independentes foram estudadas em cinco niveis codificados com: (-[alpha] -1, 0, +1 e +[alpha]) (Tabela 1). Para a analise estatistica dos resultados foi utilizado software Statistica 7.0.

A extracao da proteina foi realizada utilizando 5g de torta desengordurada e 30ml da solucao tampao como descrito na tabela 2 (Tratamento 1-12). As amostras foram homogeneizadas em blender 34BL97-7012 ( Waring Commercial, New Harford, USA) durante dois minutos e posteriormente filtradas em filtro de algodao. Este filtrado foi submetido a centrifugacao em uma centrifuga da marca Thermo modelo multifuge 3L-R a 4000rpm, sob a temperatura de 4[degrees]C e durante 15 minutos. A analise colorimetrica de proteina extraida no sobrenadante foi feita utilizando o metodo de Bradford (1976) e um espectrofotometro da marca Analytikjena modelo Specord 210 no comprimento de onda de 595nm. Para a analise de cadeia polipeptidica em eletroforese (SDS-PAGE) foi utilizado o sistema de eletroforese da marca Biorad e a metodologia de preparacao dos geis descrita por LAEMMLI (1970). Para o gel de corrida foi utilizada acrilamida na concentracao de 15% e de 4% no gel de aplicacao da amostra. Visando uma analise comparativa do perfil proteico dos extratos em eletroforese (SDS-PAGE), igualou-se a quantidade de proteinas dos 12 diferentes extratos utilizando-se a seguinte estrategia: precipitacao das proteinas com sulfato de amonio 90%, solubilizacao dos pellets de modo a conter concentracoes similares de proteinas nos 12 diferentes tratamentos. Para a etapa de purificacao da amostra foram utilizadas duas estrategias: a) dialise do extrato, contra tampao fosfato pH 7,4; b) precipitacao das proteinas do extrato com sulfato de amonio [[(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4]] 90% e posterior solubilizacao do material em tampao fosfato pH 7,4. Todas as corridas eletroforeticas foram realizadas durante sete horas sob uma tensao de 100V. As proteinas dos geis foram coradas overnight com uma solucao de acido acetico 10% (v/v), alcool metilico 40% (v/v) e Coomassie Brilliant Blue [R.sup.2]50 1% (v/v). O gel foi descorado em solucao contendo 10% (v/v) de acido acetico e 40% (v/v) de alcool metilico, renovando a solucao a cada 30 minutos, ate obtencao de revelacao nitida. O calculo da massa molecular das fracoes proteicas foi efetuado mediante a construcao das curvas padrao, com massas moleculares dos marcadores contra as respectivas distancias percorridas no gel. O marcador de massa molecular utilizado foi do fabricante Biorad com a seguinte composicao: a) marcador de alta massa molecular: miosina, 204,44kDa; 116,58kDa, [beta]-galactosidase; 98,08kDa, albumina de soro bovino; 47,11kDa, ovoalbumina. b) marcador de baixa massa molecular: 103,03kDa, fosforilase B; 80,66kDa, albumina de soro bovino; 49,49kDa, ovoalbumina; 36,54kDa, anidrase carbonica; 28,83kDa, inibidor de tripsina de soja; 19,44kDa lisoenzima.

RESULTADOS E DISCUSSAO

As concentracoes de proteinas extraidas, quantificada segundo o metodo de BRADFORD (1976), apresentaram valores que variaram de 6,989 a 1,657mg 100[g.sup.-1] de torta (Tabela 2). Estudos relacionados ao rendimento de extracao de proteinas de torta de mamona ainda nao sao bem claros. O que tem sido observado e o rendimento de proteina extraida a partir de semente (KIM, 2001; ANANDAN, 2005), que relata valores de extracao de ricina na ordem de 0,3g [kg.sup.-1] de semente. Deve-se ressaltar que essa extracao foi realizada com HCl, pH 3.8 e que este e um liquido extrator diferente dos utilizados neste trabalho. O estudo dos efeitos do pH e concentracao NaCl na concentracao de proteina foi estabelecido atraves de um delineamento composto central rotacional, cujas variaveis e a resposta gerada estao dispostas na tabela 2.

O modelo apresenta um bom resultado para o coeficiente regressao ([R.sup.2]=0,94), indicando que quase 94% da variacao encontrada se deve as variacoes dentro dos ensaios (pH e NaCl) e nao a erro ou a outro fator.

O modelo obtido para o percentual de proteina extraida da torta de mamona e apresentado pela equacao 1. Onde: Proteina (mg 100[g.sup.-1])=-30,34124+9,88708x 0,73414x2+5,88399y-2,06005[y.sup.2] X-pH e Y- Concentracao de NaCL (M).

A analise de variancia para o percentual de proteina extraida da torta de mamona foi significativo a nivel de 5% com efeito tanto linear quanto quadratico para pH (X) e concentracao de NaCl (Y). Ja a interacao entre elas nao foi significativa em nivel de 5%, mostrando que esta interacao nao tem efeito sobre o percentual de proteina extraida. (Figura 1).

Dos cinco diferentes valores de pH (4,0; 4,6; 6,0; 7,4; 8,0) e concentracao NaCl (0,0M; 0,3M; 1,0M; 1,7M; 2,0M) utilizados, o de maior valor de proteina extraida foi observado no tratamento 10 chegando a valores quatro vezes maiores que o encontrado no de minima extracao de proteina (Tabela 3). Foram construidas as superficies de respostas e os graficos de contorno a partir das respostas experimentais dos ensaios (Figura 2), que contribuem para melhor visualizacao dos efeitos de pH e concentracao de NaCl no teor de proteina extraida da torta de mamona. O pH otimo para extracao de proteinas de torta de mamona encontra-se na faixa entre 6,3 e 7,4, bem como a concentracao otima de NaCl para extracao de proteinas de torta de mamona na faixa entre 1,1 e 1,8M. (Figura2), sendo utilizado o tratamento 4 (tampao fosfato 0,2M/ NaCl 1,7M pH 7,4) para posteriores estudos moleculares. Ajustificativa da escolha pelo tratamento 4 baseia-se em dois fatos: a) apresenta valores de pH e de concentracao de NaCl que se encontram na faixa otima b) o valor de proteina extraida (6,7g 100[g.sup.-1]) e maior do que o observado na media das quatro repeticoes (6,37g 100[g.sup.-1]) do ponto central. Pela evidenciacao no gel de eletroforese nao houve extracao preferencial de ricina nos tratamentos testados (Figura 3). Pode-se verificar que o bandeamento tipico das duas cadeias (A e B) foi observado, apresentando neste trabalho massa molecular calculada de 38 e 36kDa, respectivamente. Estes resultados de valores de massa molecular estao proximos aos obtidos por LORD et al. (1994), GODOY et al. (2009) e ANANDAN et al. (2005). Quanto a intensidade de coloracao do gel de poliacrilamida, pode-se dizer que o presente trabalho mostrou resultados melhores do que aqueles descritos por MACHADO et al. (2003) e STEPHAN et al. (2008) que utilizaram liquidos extratores que permitiram menor quantidade de proteina extraida. Posteriormente, etapas de purificacao usando dialise e precipitacao com sulfato de amonio permitiram uma evidenciacao melhor das duas cadeias polipeptidicas de ricina (Figura 4). Podese evidenciar que um gel mais limpo e obtido no tratamento associando dialise e precipitacao com sulfato de amonio, pois neste tratamento nao se observa nem o rastro evidenciado na amostra aplicada sem tratamento previo nem a presenca de material de alta massa molecular no topo do gel, observado em amostras submetidas somente a dialise.

[FIGURE 2 OMITTED]

[FIGURE 3 OMITTED]

CONCLUSAO

Os resultados obtidos de quantificacao de proteinas atraves de estudo de superficie de resposta permitem concluir que a associacao do tampao fosfato de potassio 0,2M com NaCl 1,7M em pH 7.4 foi eficaz para a extracao de ricina. A aplicacao destes extratos no gel de eletroforese comprovou que uma perfeita observacao das cadeias A e B de ricina pode ser feita utilizando a dialise e a precipitacao com sulfato de amonio como metodos de purificacao destes extratos.

[FIGURE 4 OMITTED]

REFERENCIAS

ANANDAN. S. et al. Effect of different physical and chemical treatments on detoxification of ricin in castor cake. Animal Feed Science and Technology, v.120, p.159-168, 2005. Disponivel em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/ pii/S0377840104002305>. Acesso em: 21 set. 2010. doi: 10.1016/janifeedsci.2004.10.002.

AUDI, J. et al. Ricin poisoning: A comprehensive review. Journal of the American Medical Association, v. 294, n.18, p.2342-2351, 2005.

BOX, G.E.P. et al. Statistics for experimenters: an introduction to design, data analysis and model building. New York: John Wiley & Sons, 1978. 672p.

BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analitical Biochemistry, v.72, p.248-254, 1976.

ENDO, Y. et al. Ribosomal RNA identity elements for ricin Achain recognition a catalysis. Journal of Molecular Biology, v.221, p.193-207, 1991. Disponivel em: <http://dx .doi.org/ 10.1016/0022-2836(92)90956-K>. Acesso em: 10 nov. 2010. doi: 10.1016/00222836(92)90 956-K.

ENDO, Y.; TSURUGI, K. RNA N-glycosidase activity of ricin Achain. Mechanism of action of the toxic lectin ricin on eukaryotic ribosomes. Journal Biological Chemistry, v.262, p.8128-8130, 1987.

GODOY, M.G. et al. Use of a low-cost methodology for biodetoxification of castor bean waste and lipase production. Enzyme and Microbial Technology, v. 44, p.317-322, 2009. Disponivel em: <http://www.elsevier.com.br/locate/emt>. Acesso em: 10 nov. 2010. doi:10.10 6/ j.enzimictec.2009.01.002.

KIM, B.K. Effects of oil milling steps on residual toxin and antigen activities of castor bean. Food Science and Biotechnology, v.10, n.3, p.305-310, 2001.

LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature, v.227, p.680-685, 1970.

LORD, J.M. et al. Ricin-structure, mode of action, and some current applications. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology, v.8 p.201-208, 1994.

MACHADO, O.L.T. et al. Characterization of allergenic 2S albumin isoforms from Ricinus communis seeds. Allergologie, v.26 p.45-51, 2003.

MACKINNON, P.J.; ALDERTON, M.R. An investigation of the degradation of the plant toxin, ricin, by sodium hypochlorite. Toxicon, v.38, n.2, p.287-291, 2000.

MONZINGO, A.F. et al. The 2.5 A structure of pokeweed antiviral protein. Journal of Molecular Biology, v.233, p.705-715, 1993.

OLSNES, S. The history of ricin, abrin and related toxins. Toxicon, v.44, p.361-370, 2004. Disponivel em: <http// www.elsevier.com/locate/toxicon>. Acesso em: 22 ago. 2010. doi:10.101 6/j.toxicon.2004.05.003.

STEPHAN, MP. et al. Implantacao do metodo de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) para visualizacao de proteinas de torta de mamona. Rio de Janeiro: Embrapa Agroindustria de Alimentos, 2008. 3p. (Embrapa Agroindustria de Alimentos--Comunicado tecnico, 136).

Barbara Amorim Silva (I) Marilia Penteado Stephan (II) * Maria Gabriela Bello Koblitz (III) Jose Luis Ramirez Ascheri (II)

(I) Programa de Pos-graduacao em Ciencia e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

(II) Ministerio da Agricultura, Pecuaria e Abastecimento, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria, Embrapa Agroindustria de Alimentos (CTAA), 23020-470, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. E-mail: stephan@ctaa.embrapa.br. *Autor para correspondencia.

(III) Escola de Nutricao, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

Recebido para publicacao 20.12.10 Aprovado em 29.02.12 Devolvido pelo autor 21.05.12 CR-4536
Tabela 1--Delineamento completo do desenho experimental.

                           Nivel
Variavel
            -1,414   -1     0    +1    +1,414

pH           4,0     4,6   6,0   7,4    8,0
NaCl(M)      0,0     0,3   1,0   1,7    2,0

Tabela 2--Delineamento completo do desenho experimental.

                                       Variavel
                                                       Proteina g
Tratamento                          pH       NaCl     100[g.sup.-1]

1 Acetato de sodio 0,2M/Nacl        -1        -1         1,657

  0,3M pH 4,6
2 Acetato de sodio 0,2M/Nacl        -1        +1         2,657
  1,7M pH 4,6
3 Fosfato de potassio 0,2M/Nacl     +1        -1         4,755
  0,3M pH 7,4
4 Fosfato de potassio 0,2M/Nacl     +1        +1         6,735
  1,7M pH 7,4
5 Acetato de sodio 0,2M/Nacl        -1,414    0          1,662
  1,0M pH 4,0
6 Fosfato de potassio 0,2M/Nacl     +1,414    0          5,172
  1,0M pH 8,0
7 Fosfato de potassio 0,2M pH 6,0   0         +1,414     1,844
8 Fosfato de potassio 0,2M/Nacl     0         -1,414     6,743
  2,0M pH 6,0
9 Fosfato de potassio 0,2M/Nacl     0         0          6,303
  1,0M pH 6,0
10 Fosfato de potassio 0,2M/Nacl    0         0          6,989
  1,0M pH 6,0
11 Fosfato de potassio 0,2M/Nacl    0         0          6,092
  1,0M pH 6,0
12 Fosfato de potassio 0,2M/Nacl    0         0          6,119
  1,0M pH 6,0

Tabela 3--Analise de variancia para o teor de
proteinas extraidas da torta de mamona.

                                   [R.sup.2] = 0,93979

                      SQ      GL      MQ       Fcalc       Ftab

Regressao          48,0347    5    9,606935   18,73017   1% = 8,75
Residuo            3,0775     6    0,512912
Falta de Ajuste    2,54967    3    0,84989    4,8308
Erro puro          0,52780    3    0,17593
Total              51,11215   11

Figura 1--Diagrama de Pareto para o % de proteina extraida.

(1)pH(L)         5,987462
pH(Q)            -5,15569
(2)NaCI(L)       4,901142
NaCI(Q)          -3,61682
1Lby2L           ,6841865

Standardized Effect Estimate (Absolute Value)

Note: Table made from bar graph.
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Author:Silva, Barbara Amorim; Stephan, Marilia Penteado; Koblitz, Maria Gabriela Bello; Ascheri, Jose Luis
Publication:Ciencia Rural
Date:Jul 1, 2012
Words:2692
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