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Infectividad de Paranosema locustae (Microsporidia) en la "tucura quebrachera" Tropidacris collaris (Orthoptera: Romaleidae) en laboratorio.

Infectivity of Paranosema locustae (Microsporidia) to the 'quebrachera' grasshopper, Tropidacris collaris (Orthoptera: Romaleidae), in the laboratory

Tropidacris collaris (Stoll), la "tucura quebrachera", es un insecto muy grande cuyos ejemplares adultos machos figuran entre los de mayor tamano (73-101 mm) que se conocen en las especies de tucuras (Acridoidea). A pesar de ser conocida comunmente como "langosta quebrachera", se trata en realidad de una tucura tipica, pues no alterna entre fases solitaria y gregaria con distinta coloracion, morfometria, fisiologia y comportamiento, como si lo hacen las verdaderas langostas. En nuestro pais, T. collaris tiene una amplia distribucion geografica y suele ser abundante en zonas localizadas del Norte (Carbonell et al., 2006). Aunque es considerada una especie polifaga, los adultos prefieren el follaje de arboles y arbustos de hoja dura como los "quebrachos" (Aspidosperma, Schinopsis), los "algarrobos" (Prosopis) y el "mistol" (Zizyphus misto!) (Carbonell et al., 1986). Sin embargo, las ninfas, de habitos gregarios, consumen practicamente todo material vegetal que encuentran a su paso. En anos recientes, por factores aun no determinados, T. collaris parece haber incrementado sus poblaciones en algunas zonas, particularmente en el Norte de Cordoba y Este de Santiago del Estero, hecho que ha motivado un incremento en la aplicacion de insecticidas para su control.

El microsporidio originalmente conocido como Nosema locustae y recientemente transferido al nuevo genero Paranosema, es un patogeno esporogenico del tejido adiposo de un amplio espectro de especies de acridoideos, que fue desarrollado como agente de biocontrol de tucuras a largo plazo (Henry, 1990; Lange & Cigliano, 2005). Paranosema locustae se establecio como factor biotico adicional de control en comunidades de tucuras del Oeste de la region Pampeana, en el valle de Gualjaina (Chubut) y en Loncopue (Neuquen), como consecuencia de introducciones realizadas entre 1978-1982 y en 1996 (Lange & Cigliano, 2005; Lange & Azzaro, 2008). La alta susceptibilidad de muchas de las especies de tucuras de nuestro pais (Lange & Cigliano, 2005) y los niveles relativamente elevados de esporulacion mostrados por el patogeno en varias de ellas (Lange, 2003a), son dos de los factores que permitieron su establecimiento. La presente contribucion muestra los resultados de explorar mediante bioensayos, el eventual potencial de P. locustae para el control biologico a largo plazo de T. collaris.

Hasta el presente, los esfuerzos tendientes al desarrollo de una colonia de cria de Tropidacris collaris no han sido exitosos; los insectos empleados en este estudio provinieron de Tres Estacas, Oeste de Chaco, casi en el limite con Santiago del Estero. Fueron colectados en febrero de 2008, como ninfas de segundo, tercero y cuarto estadios. Una vez en el laboratorio, 200 de los ejemplares de la muestra fueron examinados por los metodos de homogenizacion individual en agua destilada y de diseccion/observacion de organos y tejidos, en preparaciones bajo microscopia de contraste de fases (X400, X1000) (Lange & Henry, 1996; Undeen & Vavra, 1997) para determinar la condicion normal (sana) de los mismos. En las poblaciones de insectos terrestres, los microsporidios, cuando no se hallan en fase epizootica, suelen ocurrir en prevalencia relativamente baja, del 1% al 10% (Brooks, 1979), de modo que el examen de 200 ejemplares provee una aceptable estimacion acerca de la eventual presencia-ausencia de un microsporidio dado.

Los esporos de Paranosema locustae, las unidades infectivas transmisibles del patogeno, utilizados en los bioensayos fueron obtenidos de tucuras infectadas (Dichroplus pratensis Bruner), capturadas en la zona de establecimiento de P. locustae en la region Pampeana (Lange & Cigliano, 2005). A partir de este material, se prepararon suspensiones de esporos purificadas segun el metodo de Lange & Henry (1996). La cantidad de esporos fue cuantificada con un hemocitometro siguiendo el protocolo de Undeen & Vavra (1997), y se realizaron las diluciones en agua destilada necesarias para obtener la concentracion de esporos deseada. P. locustae es facilmente distinguible de los otros microsporidios conocidos asociados a tucuras en Argentina, como Liebermannia patagonica, L. dichroplusae (Sokolova et al., 2007) y Liebermannia sp. en Covasacris pallidinota (Bruner) (GenBank accession: EU709818), gracias a los caracteres diagnosticos que posee, que incluyen el tamano de los esporos, condicion diplocariotica, esporogonia disporoblastica y especificidad por el tejido adiposo (Lange, 2003b). Dado que los esporos de P. locustae mantienen su viabilidad por anos bajo congelamiento (Lange, 1997), las suspensiones fueron conservadas a -32[grados] C hasta su utilizacion. Antes de realizar los bioensayos se corroboro la viabilidad de los esporos visualizando su refringencia, bajo microscopia de contraste de fases, caracteristica indicadora de condicion viable (Sokolova et al., 2008). Suspensiones de esporos del mismo origen y mantenidas bajo las mismas condiciones son utilizadas rutinariamente en nuestro laboratorio para producir infecciones (Lange, 2003a, 2005).

Salvo por unas adaptaciones menores, se utilizo la metodologia y dosis estandares para este tipo de estudios, que consiste en inocular por via oral las ninfas de tercer estadio con una cantidad de 1 05 esporos por ninfa (Henry, 1990; Lange, 2003a). Una de las adaptaciones instrumentadas fue el reemplazo del cebo utilizado como vehiculo de administracion de los esporos. Se dejaron de lado los discos de lechuga empleados normalmente, que no resultan atractivos para T. collaris, y se utilizaron en su lugar cebos de la "enredadera" Ampelopsis sp., que en experiencias preliminares resulto un alimento apetecido por las "quebracheras". Debido al gran tamano de T. collaris, la otra adaptacion implementada fue la utilizacion de frascos mas grandes (de 35 ml) para el ayuno previo de 24 horas de las ninfas y el ofrecimiento individual del cebo con esporos a cada una de ellas. Se inocularon (ingirieron totalmente el correspondiente cebo) 50 ninfas y otras 50 recibieron los cebos pero sin esporos (testigos). Dado que cada ninfa fue tratada individualmente, aislada dentro de un frasco y con la misma dosis, cada inoculacion constituyo una repeticion, totalizando 50 replicas de ninfas inoculadas y 50 replicas de ninfas testigo. Una vez inoculados, los ejemplares fueron mantenidos bajo condiciones controladas (30[grados]C, 14 hs luz--10 hs oscuridad, 40 % HR) hasta su muerte o sacrificados los sobrevivientes 70 dias despues de inoculados. Los ejemplares muertos o sacrificados fueron examinados por diseccion y homogenizacion para determinar su condicion (sano vs. infectado), y la intensidad de las infecciones fue estimada mediante microscopia de contraste de fases de acuerdo con las categorizaciones empleadas por Henry et al. (1973), Johnson (1989) y Shi et al. (2008).

Puesto que Paranosema locustae produce variados efectos subletales, causando infecciones de tendencia cronica y no aguda (Lange & Cigliano, 2005), el interes del estudio se centro en conocer la infectividad (capacidad de provocar infeccion, Onstad et al., 2006), no la mortalidad, en T. collaris y por ello se mantuvo la dosis estandar. Dosis mayores suelen aumentar la mortalidad, pero conspiran respecto de la persistencia del patogeno, ya que el huesped tiende a morir antes de llegar a formar esporos, bloqueando las posibilidades de transmision. Tambien, el criterio de estimar la infectividad y no la mortalidad condice con el concepto original seguido para el desarrollo de P. locustae como agente de control, es decir, aumentar los factores para la disminucion y mantenimiento de las densidades de tucuras a largo plazo, a traves de los anos (Henry, 1990).

No se detectaron microsporidios en los 50 ejemplares testigo, ni en los 200 individuos parte de la muestra original. De las 50 ninfas inoculadas, solo 19 (38 %) mostraron infeccion. En solo dos de estas (10,5 %), las infecciones alcanzaron un nivel tal que hubo produccion de esporos. No obstante, la cantidad producida en ambos casos fue infima, constituyo infecciones traza segun las categorizaciones utilizadas por Henry et al. (1973) y Johnson (1989) o de nivel 1 de Shi et al. (2008), en las que se visualizaron no mas de un esporo por campo del microscopio (X400) o cada cinco cuadrantes menores del hemocitometro (de acuerdo al protocolo de Undeen y Vavra, 1997) respectivamente. Asi, a pesar del tiempo prolongado de mantenimiento de los insectos inoculados, la mayoria de las infecciones (17 casos; 89,5%) no mostro formacion de esporos, sino estados proliferantes del ciclo de desarrollo del patogeno (merontes) y formas previas a la esporulacion (esporontes). Tampoco se observaron signos o sintomas que pueden resultar obvios en infecciones fuertes de Paranosema locustae (con gran produccion de esporos), tales como distension abdominal, hipertrofia y cambios de coloracion del cuerpo graso, disrupcion de membranas intersegmentales, letargia o disminucion de consumo (Lange & Cigliano, 2005).

Los resultados obtenidos indican que Paranosema locustae no seria un agente eficaz para el control a largo plazo de Tropidacris collaris. Aunque T. collaris resulto susceptible a P. locustae, tanto la baja proporcion de insectos infectados, como la casi nula produccion de esporos en aquellos que desarrollaron infeccion, sugiere que, en el hipotetico escenario de una aplicacion a campo, el patogeno seria incapaz de reciclar en la poblacion del huesped. El nivel de produccion de unidades infectivas transmisibles de un agente etiologico dado, es uno de los principales factores que gobiernan la persistencia de la correspondiente enfermedad (Andreadis, 1987). Patogenos que, como P. locustae, exhiben transmision horizontal predominante son dependientes, para su persistencia, de la carga de esporos producida por insecto (Dunn & Smith, 2001). Contrariamente a lo ocurrido con T. collaris, en especies de tucuras y langostas de franca susceptibilidad a P. locustae, los porcentajes de infeccion en inoculaciones del tipo de las aqui realizadas son muy elevados, con frecuencia del 100 %, y los niveles de esporulacion tambien, del orden de 108 a 1010 esporos por insecto (Lange, 2003a). Salvo en casos de aplicacion de dosis extremadamente altas, que pueden causar septicemia, en los microsporidios (grupo para el cual no se ha demostrado la produccion de toxinas) la capacidad de producir enfermedad (patogenesis; Onstad et al., 2006) es directamente proporcional a la cantidad de esporos producidos (carga de esporas. Dunn & Smith, 2001), y por ello la falta de signos y sintomas en los individuos infectados con P. locustae concuerda con la casi nula produccion de esporos.

Considerando las especies de tucuras que se han hallado naturalmente infectadas con Paranosema locustae a nivel mundial, aquellas especies en las cuales se han inducido infecciones en laboratorio o a campo y las respectivas cargas de esporas registradas, se ha observado que las especies pertenecientes a la familia Acrididae, particularmente aquellas de las subfamilias Melanoplinae y Oedipodinae y en menor medida Gomphocerinae, suelen resultar las mas susceptibles a P. locustae (Lange, 2005). En este sentido, no emerge aun una tendencia definida respecto de las especies de Romaleidae, aunque parecen, al menos en forma preliminar, menos susceptibles. Una sola especie de Romaleidae (Brachystola magna (Girard)) fue hallada naturalmente infectada en America del Norte (Lange, 2005), region donde P. locustae es autoctono, pero es necesario tener presente que dicha familia se encuentra escasamente representada en ese continente. En la zona de establecimiento de P. locustae en la region Pampeana, donde han sido citadas 12 especies de Romaleidae (Carbonell et al., 2006), se encontraron dos especies afectadas: Diponthus argentinus Pictet & Saussure y Zoniopoda tarsata (Servil le) (Lange, 2005) con produccion de esporos leve (1 a 10 esporos por campo microscopico) o intermedia (10 a 100 esporos por campo) respectivamente, segun la categorizacion de Henry et al. (1973) y Johnson (1989). Por el contrario, Staleochlora viridicata (Serville) resulto inmune a P. locustae en condiciones de laboratorio (Lange, 2003a).

Visto que Paranosema locustae puede ser descartado para el control de Tropidacris collaris y no se han descripto patogenos nativos asociados a este insecto, seria de interes realizar estudios prospectivos tendientes a detectar la eventual ocurrencia de agentes causantes de enfermedades aun no conocidos, asi como determinar la infecctividad de otros patogenos con potencial que podrian resultar de utilidad (Lange, 2004).

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Sebastian Pelliza por la captura de las "tucuras quebracheras" y a la Comision de Investigaciones Cientificas (CIC) de la provincia de Buenos Aires por el apoyo economico brindado.

BIBLIOGRAFIA CITADA

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LANGE, Carlos E., Christian BARDI y Santiago PLISCHUK

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Author:Lange, Carlos E.; Bardi, Christian; Plischuk, Santiago
Publication:Revista de la Sociedad Entomologica Argentina
Date:Jul 1, 2008
Words:2751
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