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Infectious etiology of subclinical mastitis in sheep flocks for meat production/ Etiologia infecciosa da mastite subclinica ovina em rebanhos destinados a producao de carne/ Etiologia infecciosa de la mastitis subclinica en los rebanos de ovejas para la produccion de carne.

INTRODUCAO

A mastite e caracterizada como processo inflamatorio da glandula mamaria predominantemente de origem infecciosa, classificada em mastite clinica ou subclinica, de acordo com a intensidade das alteracoes que causam na glandula e no leite (1,2).

A doenca na forma clinica apresenta sinais macroscopicos evidentes, permitindo o diagnostico seguro pela visualizacao das alteracoes existentes (3). Os sinais podem variar de acordo com o microrganismo e propriedades de virulencia. O leite pode apresentar grumos amarelados ou esbranquicados, ate modificacao total da secrecao, que pode se tornar aguada ou espessa. Nos casos mais graves ha alteracoes inflamatorias do ubere, incluindo dor, hiperemia, edema e aumento da temperatura local (2).

A forma subclinica da doenca nao provoca modificacoes visiveis no aspecto do leite e do ubere, necessitando da adocao de metodos diretos ou indiretos para o diagnostico. Portanto, a mastite subclinica pode se disseminar no rebanho e causar prejuizos financeiros, alem de comprometer a saude do animal (4). Na forma subclinica ocorre reducao da producao e alteracoes na composicao do leite, como o aumento na contagem de celulas somaticas (5). A invasao da glandula mamaria provoca aumento das celulas de defesa, principalmente neutrofilos, no intuito de combater o processo infeccioso. Essas celulas de defesa, somadas as celulas de descamacao do epitelio mamario sao denominadas celulas somaticas. O aumento dessas celulas permite que testes indiretos de diagnostico, como o California Mastitis Test (CMT), auxiliem no diagnostico da mastite subclinica (6).

A relevancia do estudo da mastite em ovinos destinados a producao de carne e justificada pela reducao da producao de leite, por alteracoes na composicao e interferencia no desenvolvimento dos cordeiros (7,8). As bacterias sao os principais agentes etiologicos da mastite infecciosa ovina, com destaque para Staphylococcus aureus, Mannheimia haemolytica, Streptococcus spp., Escherichia coli, Pseudomonas spp., Arcanobacterium pyogenes, estafilococos coagulase negativa, Corynebacterium spp. e Clostridium spp. (9). Em estudo sobre a etiologia da mastite infecciosa de ovinos na Espanha, Ariznabarreta et al. (10) relataram que bacterias do genero Staphylococcus foram as mais prevalentes.

O presente estudo investigou a etiologia da mastite subclinica ovina em dois rebanhos de corte do estado de Sao Paulo e o perfil de resistencia dos isolados.

MATERIAL E METODOS

As amostras de leite foram provenientes de 170 ovelhas oriundas de rebanhos localizados nas cidades de Nova Odessa e Sao Carlos, ambas no estado de Sao Paulo. Os rebanhos foram acompanhados a partir do mes de novembro de 2008 ate dezembro de 2009.

Os animais foram criados de forma intensiva na unidade de ovinos localizada em Nova Odessa, em area de aproximadamente 10 hectares, cujo rebanho era formado por animais das racas Santa Ines, Morada Nova, Texel e Suffolk. Apos o parto, as ovelhas eram confinadas junto com as crias em baias coletivas ate o desmame, quando eram soltas novamente no pasto.

O rebanho localizado em Sao Carlos era formado por ovelhas deslanadas da raca Santa Ines ou sem raca definida. As matrizes foram criadas de forma intensiva em area de 3,5 hectares. Durante os primeiros dias pos-parto, as ovelhas foram mantidas em pequenos piquetes com acesso a baias coletivas. Aproximadamente duas semanas pos-parto, as ovelhas eram soltas junto com as crias novamente no sistema relacionado, ate o desmame.

As amostras de leite foram colhidas de todas as ovelhas paridas no inicio da lactacao (14 dias pos-parto) e no final do aleitamento (desmame dos cordeiros) (11).

Antes da colheita de amostras de leite visando a cultura microbiana foi realizado o California Mastitis Test (CMT) (12). As amostras de leite foram colhidas de mamas reagentes (uma a tres cruzes) e nao reagentes ao CMT. Posteriormente, aliquotas de leite foram colhidas assepticamente em tubos de ensaio esterilizados para os exames microbiologicos (13). Apos a limpeza do ostio papilar com alcool etilico 70% (v/v) foram colhidas amostras individuais de 2 a 5 mL de leite, em duplicatas, de cada metade mamaria.

As amostras de leite de cada metade mamaria foram semeadas em sangue ovino desfibrinado (5%), em duplicatas, na quantidade de 10 microlitros. Apos a incubacao em aerobiose a 37[degrees]C durante 24 a 72 horas, realizou-se a identificacao do microrganismos.

As colonias classificadas como cocos Gram-positivos, dispostos ou nao sobre a forma de cachos de uva foram submetidos a prova da catalase e da coagulase lenta em plasma de coelho (14). Os isolados catalase e coagulase positivos foram submetidos a prova para verificacao da producao de acetoina e utilizacao ou nao da maltose e trealose. As estirpes positivas nestas provas foram classificadas como Staphylococcus aureus (15, 16). As estirpes coagulase-negativas foram submetidas ao teste da oxidase e de resistencia a furazolidona, com o intuito de diferenciar os generos Staphylococcus e Micrococcus (17) e os isolados identificados como estafilococos coagulase negativa foram submetidos a testes de resistencia a novobiocina (15). Colonias pequenas, lisas, translucentes, circundadas ou nao por halo hemolitico, cuja coloracao revelou cocos Gram-positivos arranjados em cadeias e negativas a prova da catalase foram identificadas como pertencentes ao genero Streptococcus (13,17). As colonias circulares, brancas, cremes ou opacas em agar sangue, contendo bastonetes Grampositivos pleomorficos sob a forma de palicada e "letras chinesas" tipicas de actinomicetos, foram submetidas a prova da catalase e producao de hemolise para diferenciacao entre Corynebacterium spp. e Arcanobacterium pyogenes (10,16).

Os coliformes foram identificados como colonias grandes da cor cinza, reconhecidos como bastonetes Gram-negativos e semeados em Eosin Methylene Blue agar (EMB). Em EMB, os coliformes produziram colonias termentadoras de lactose negras ou que possuiam centros escuros com periferias transparentes incolores, enquanto as nao fermentadoras de lactose eram incolores (17).

Os microrganismos pertencentes ao genero Staphylococcus foram submetidos aos testes de sensibilidade in vitro a partir da tecnica padrao de difusao com discos (18), frente a 12 antimicrobianos: rifampicina (30p.g), cloranfenicol (10[micro]g), vancomicina (30[micro]g), clindamicina (2[micro]g), eritromicina (15[micro]g), penicilina (10 UI), oxacilina (1[micro]g), cefepima (30[micro]g), tetraciclina (30[micro]g), gentamicina (10[micro]g), ciprofloxacina (5[micro]g) e sulfametoxazol (25[micro]g), interpretados segundo o National Committee for Clinical Laboratory Satandards (19).

RESULTADOS E DISCUSSAO

Do total de 576 amostras de leite ovino cultivadas, 125 (21,7%) foram positivas nos exames microbiologicos, enquanto nas demais nao houve isolamento microbiano.

O CMT foi realizado em 441 metades mamarias, das quais 297 foram consideradas negativas ao teste. Em 144 amostras foram observadas reacoes com diferentes graus de positividade. Na Tabela 1 estao apresentados os resultados do CMT e dos isolamentos de microrganismos, de acordo com os escores do teste. Ocorreu o isolamento de microrganismos em 38 (12,8%) amostras de leite nao reagentes ao CMT. Dentre as metades mamarias com reacao positiva ao CMT (uma a tres cruzes), em 86 (59,7%) nao houve isolamento microbiologico, fato que destaca no presente estudo a quantidade de resultados falso-positivos do CMT, quando se considera o exame microbiologico como "padrao-ouro" no diagnostico.

Coutinho et al. (20) ao realizarem o CMT em 124 metades mamarias de 62 ovelhas da raca Santa Ines, verificaram resultados positivos em 39 metades mamarias. Porem, as analises microbiologicas do leite revelaram a presenca de microrganismos em 33 (84,6%) da amostragem. Em constraste, no presente estudo, dentre as 144 mamas positivas ao CMT, em somente 58 (40,3%) houve isolamentos de microrganismos. No entanto, o percentual total de mamas reagentes ao CMT (32,6%) nos animais amostrados foi superior ao encontrado por Bolsanello et al. (21), que obtiveram 4,4% de mamas ovinas reagentes ao CMT, dentre 482 amostras analisadas.

Estes achados reforcam que o CMT nao deve ser utilizado como unico recurso para diagnosticar animais com mastite subclinica em ovelhas com vistas a estabelecer medidas de controle para a doenca. Recomenda-se que o CMT seja realizado em conjunto com o exame microbiologico ou outro exame auxiliar.

Os microrganismos encontrados isoladamente ou em associacao, alem do total de amostras de leite negativas ao exame microbiologico estao descritos na Tabela 2. Os estafilococos coagulase negativa sensiveis a novobiocina foram os agentes etiologicos mais frequentes nas amostras de leite estudadas. Isoladamente foram encontrados em 11,1% do total das amostras de leite, alem de dois isolamentos em conjunto com outros microrganismos.

Nas amostras em que houve isolamento de microrganismos, estafdococos coagulase

negativa foram identificados em 68% e 70,4%, isoladamente ou em associacao com outros microrganismos, respectivamente. Estes resultados concordam com os verificados por Bolsanello et ai (21) que, ao investigarem a etiologia da mastite em rebanho de ovelhas da raca Bergamacia, relataram os estafilococos coagulase negativa como os agentes mais frequentes, correspondendo a 61,1% dos isolamentos, seguidos por Corynebacterium bovis (11,2%), Streptococcus spp. (3,1%), enterobacterias (2,9%) e Micrococcus spp. (1,4%).

O teste de resistencia a novobiocina e um criterio associado com a patogenicidade estafilococica. Isolados com sensibilidade a novobiocina sao descritos como responsaveis por alteracoes clinicas da mama, diferentemente dos resistentes a novobiocina, ainda por razoes desconhecidas. A maior ocorrencia dos microrganismos com sensibilidade a novobiocina tambem foi relatada por outros autores (10, 22).

Nas ovelhas amostradas, S. aureus foi a especie isolada em 21,1% das ovelhas. Em contraste, Al-Majali e Jawabreh (23) relataram este microrganismo como o mais prevalente em amostras de leite de ovelhas da raca Awassi com mastite subclinica, correspondendo a 39,0%) dos isolados. No presente estudo, coliformes foram mais frequentes que S. aureus em um dos rebanhos, talvez por condicoes particulares de ambiente que propiciaram um nivel mais elevado de ocorrencia.

Os estafilococos foram o grupo de microrganismos mais frequentemente isolados nos dois rebanhos. Desta forma, foram submetidos aos testes de sensibilidade in vitro frente a 12 principios ativos. A Tabela 3 sumariza o perfil de resistencia de estafilococos coagulase negativa, S. aureus e estafilococos coagulase positiva, isolados em casos de mastite subclinica nos rebanhos de ovinos de corte estudados.

Estafilococos coagulase negativa apresentaram os maiores percentuais de sensibilidade a rifampicina, ao sulfametoxazol e a vancomicina (98,8%, 98,8%o e 93,1%) respectivamente). Os maiores percentuais de resistencia das estirpes foram observados frente a penicilina, oxacilina e cefepima (28,8%, 22,1% e 19,5%. respectivamente). Coutinho et ai. (20) em estudo sobre a etiologia da mastite ovina e a sensibilidade dos microrganismos aos antimicrobianos relataram que 89,5% dos isolados foram sensiveis a oxacilina e nenhuma estirpe foi resistente a esse principio ativo. No presente estudo, as estirpes de estafilococos coagulase negativa que apresentaram resistencia a oxacilina foram isoladas apenas em um dos rebanhos e provas moleculares para a investigacao da presenca do gene estrutural mecA, um dos responsaveis por conferir esse tipo de resistencia em estafilococos serao realizadas futuramente nos isolados.

Entre os isolados de S. aureus nao foi encontrada resistencia aos principios ativos testados. Resultados semelhantes aos obtidos no presente estudo foram observados em isolados de S. aureus obtidos de leite ovino, nos quais evidenciou-se altos indices de sensibilidade a todos os principios ativos utilizados, com percentuais de resistencia de 6,3%, apenas para a penicilina e ampicilina (24).

Dentre as estirpes de estafilococos coagulase positiva, 100% foram sensiveis a rifampicina, sulfametoxazol, vancomicina, cloranfenicol, tetraciclina e eritromicina. Isolados resistentes foram encontrados frente a penicilina (42,9%), alem da resistencia a oxacilina, clindamicina, gentamicina e ao cefepime (28,6%).

O tratamento de casos de mastite em ovelhas em rebanhos destinados a producao de carne nao e uma pratica comum em medicina veterinaria. No entanto, a presenca de estirpes com sensibilidade intermediaria e resistentes reforca a necessidade de tratamentos serem preconizados com o respaldo do antibiograma.

CONCLUSOES

Os resultados obtidos revelaram que o genero Staphylococcus apresentou maior ocorrencia na etiologia infecciosa da mastite ovina nos rebanhos estudados, com predominio dos coagulase negativa. As diferencas observadas nos perfis de resistencia dos microrganismos revelam a importancia da realizacao de testes de sensibilidade antimicrobiana in vitro para a escolha do agente antimicrobiano mais adequado para o tratamento da mastite infecciosa, com vistas a otimizar a eficacia de cura e reduzir a pressao de selecao para estirpes multirresistentes.

Aprovado pelo Comite de Etica da Embrapa Pecuaria Sudeste em 15/12/2008.

Recebido em: 13/04/2010

Aceito em: 09/11/2010

REFERENCIAS

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(16.) Zafalon LF. Mastite subclinica bovina por Staphylococcus aureus: qualidade e quantidade de leite secretado por quartos tratados e nao tratados e relacao custo/beneficio do tratamento durante a lactacao [tese]. Jaboticabal: Faculdade de Ciencias Agrarias e Veterinarias, Universidade Estadual Paulista; 2003.

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(24.) Pengov A, Ceru S. Antimicrobial drug susceptibility of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine and ovine mammary glands. J Dairy Sci. 2003; 86: 3157-63.

Luiz Francisco Zafalon [1]

Katheryiie Benini Martins [2]

Willian Alexandre Ferreira Dias [3]

Cecilia Jose Verissimo [4]

Sergio Novita Esteves [1]

* Financiamento: Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo/ Fapesp--Processo no. 2007/56558-9

[1] Pesquisador, Embrapa Pecuaria Sudeste, Sao Carlos, SP;

[2] Bolsista--Iniciacao cientifica--Fapesp, Embrapa Pecuaria Sudeste, graduacao em Ciencias Biologicas--Centro Universitario Central Paulista, Sao Carlos, SP;

[3] Bolsista PIBIC/CNPq, Embrapa Pecuaria Sudeste, graduacao em Ciencias Biologicas--Centro Universitario Central Paulista, Sao Carlos, SP;

[4] Pesquisadora, Instituto de Zootecnia, Nova Odessa, SP. Endereco e autor para correspondencia: Luiz Francisco Zafalon--Embrapa Pecuaria Sudeste--Rodovia Washington Luis, Km 234, Caixa Postal 339, CEP 13560-970, Sao Carlos, SP, Email: zafalon@cppse.embrapa.br
Tabela 1. Graus de intensidade ao CMT e resultados das
analises microbiologicas em leite de ovinos de corte
em rebanhos do estado de Sao Paulo.

Resultados        Mamas           Mamas        Total
de CMT (a)    positivas (b)   negativas (c)   de mamas

Negativo           38              259          297
Uma cruz           10              40            50
Duas cruzes        20              21            41
Tres cruzes        28              25            53

Total              96              345          441

(a) Intensidade da reacao tres cruzes > duas cruzes > uma cruz.
(b) Mamas positivas na analise micro biologica.
(c) Mamas negativas na analise microbio logica.

Tabela 2. Isolamento microbiologico em amostras de leite
de metades mamarias ovinas em rebanhos do estado de Sao Paulo.

                                Rebanho A     Rebanho B      Total

Microrganismos                  N      %      N      %      N      %

ECNSN (1)                      54    12,0    10     7,9    64    11,1
ECNRN (2)                      14     3,1     7     5,5    21     3,6
Staphylococcus aureus           8     1,8     4     3,2    12     2,1
Coliformes                      9     2,0     1     0,8    10     1,7
ECP (2)                         5     1,1     2     1,5     7     1,2
Streptococcus spp.              4     0,9     1     0,8     5     0,9
Corynebacterium spp.            2     0,4     0     0,0     2     0,3
Micrococcus spp                 1     0,2     0     0,0     1     0,2
ECNSN e Coliformes              1     0,2     0     0,0     1     0,2
ECNSN e Corynebacterium spp.    1     0,2     0     0,0     1     0,2
ECNRN e Coliformes              0     0,0     1     0,8     1     0,2
Sem isolamento                 350   78,0    101   79,5    451   78,3

Total                          449   100,0   127   100,0   576   100,0

(1) Estafilococos coagulase negativa sensivel a novobiocina.

(2) Estafilococos coagulase positiva resistente a novobiocina

Tabela 3. Percentuais de sensibilidade in vitro de microrganismos
do genero Staphylococcus isolados em casos de mastite subclinica
ovina.

                                 Microrganismos

                    Estafilococos Coagulase     Staphylococcus
Principios ativos           Negativa               aureus

                    S (1)   I (2)   R (3)     S      I      R

Rifampicina         98,8     1,1     --     100,0    --    --
Sulfametoxazol      98,8     --      1,2    100,0    --    --
Vancomicina (4)     93,1     --      --     83,3     --    --
Cloranfenicol       96,6     3,4     --     100,0    --    --
Gentamicina         91,9     1,2     6,8    100,0    --    --
Tetraciclina        92,0     5,7     2,3    91,6    8,4    --
Clindamicina        87,3     5,7     7,0    100,0    --    --
Ciprofloxacina      83,9    14,9     1,2    50,0    50,0   --
Cefepima            74,7     5,8    19,5    91,6    8,4    --
Oxacilina           77,9     --     22,1    100,0    --    --
Penicilina          71,2     --     28,8    100,0    --    --
Eritromicina        57,5    39,0     3,5    50,0    50,0   --

                        Microrganismos

                    Estafilococos Coagulase
Principios ativos            Positiva

                      S      I       R

Rifampicina         100,0    --     --
Sulfamctoxazol      100,0    --     --
Vancomicina (4)     100,0    --     --
Cloranfenicol       100,0    --     --
Gentamicina         71,4     --    28,6
Tetraciclina        100.0    --     --
Clindamicina        71,4     --    28,6
Ciprofloxacina      71,4    28,6    --
Cefepima            71,4     --    28,6
Oxacilina           71,4     --    28,6
Penicilina          57,1     --    42,9
Eritromicina        100,0    --     --

(1) Sensivel ao principio ativo testado.

(2) Sensibilidade intermediaria ao principio ativo testado.

(3) Resistente ao principio ativo testado.

(4) Amostras resistentes a vancomicina nao inseridas, pois
devem ser submetidas a confirmacao da resistencia
apresentada por tecnica laboratorial adicional.
COPYRIGHT 2010 Universidade Estadual Paulista. Facultade de Medicina Veterinaria e Zootecnia
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Author:Zafalon, Luiz Francisco; Martins, Katheryne Benini; Dias, Willian Alexandre Ferreira; Verissimo, Cec
Publication:Veterinaria e Zootecnia
Date:Dec 1, 2010
Words:3217
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