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Induccion eficiente de brotes adventicios en cotiledones de Pinus maximartinezii Rzedowski.

Introduccion

Pinus maximartinezii es una de las 12 especies conocidas de pinos pinoneros americanos, es originaria de Mexico y su distribucion geografica esta sumamente restringida, ya que se le encuentra solo en un diminuto sector del estado de Zacatecas. Este reducto ecologico cuenta con una superficie aproximada de 400 ha y la poblacion se estima entre 2000 y 2500 arboles maduros (Donahue y Mar-Lopez, 1995; Lopez-Mata, 2001).

La reproduccion de la especie es dificil debido a que practicamente todas sus semillas son utilizadas para consumo humano o para el comercio local; ademas de verse afectada por el sobrepastoreo, los incendios forestales inducidos y los cambios en el uso del suelo. El tamano limitado de la poblacion, su baja tasa de propagacion y la dificultad para proteger el territorio en que este pinonero se distribuye, lo situan dentro del conjunto de las especies en peligro de extincion, de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana, NOM-059-ECOL-2001 (Anonimo, 2002).

Ante tal panorama resulta necesario buscar una tecnologia que permita obtener individuos en grandes cantidades y en menor tiempo que el requerido por los metodos convencionales. El cultivo de tejidos puede ser una alternativa que, aun cuando tenga su principio en la semilla misma, permita hacer de esta un sistema mas eficiente de propagacion.

La reproduccion in vitro de pinaceas como Pinus sylvestris (Lelu et al., 1999), Pinus pinea (Gonzalez et al., 1998), Pinus banksiana (Pelletier y Laliberte, 2000), Picea glauca (Ashihara et al., 2001) y Pinus virginiana (Tang et al., 2004) se ha llevado a cabo utilizando embriones u organos de plantulas, como los cotiledones. El uso de estos ultimos representa ventajas sobre el cultivo de embriones, entre las cuales esta el incremento de la superficie de tejido en contacto con el medio nutritivo y la obtencion de mayor numero de explantes por semilla empleada, considerando que en la mayoria de los pinos esta tiene al menos ocho cotiledones (Saborio et al., 1997).

Aunque existen varios trabajos que describen protocolos de propagacion in vitro de distintas especies de Pinus (P. halepensis, P. canariensis, P. ayacahuite, P. pinea, P. heldreichi, P. tadea) (Lambardi et al., 1991; Martinez-Pulido et al., 1994; Saborio et al., 1997; Gonzalez et al., 1998; Stojicic et al., 1999; Tang y Guo, 2001; Sul y Korban, 2004), solo se conoce uno referente al cultivo de tejidos en Pinus maximartinezii (Villalobos-Amador et al., 2002). En este, los autores utilizaron embriones maduros como explante para inducir brotes adventicios; sin embargo, la tasa de multiplicacion obtenida fue baja (14.6 brotes por embrion). Por lo anterior, la presente investigacion tuvo como objetivo desarrollar un protocolo para diferenciar in vitro brotes adventicios de P. maximartinezii, que basado en el uso de los cotiledones como explantes, permitiera mejorar tanto la respuesta morfogenetica como el numero de vastagos obtenidos mediante el cultivo de embriones.

MATERIAL Y METODOS

Material biologico

Se utilizaron semillas maduras de Pinus maximartinezii, con un ano de haber sido cosechadas y almacenadas a temperatura ambiente, provenientes de polinizacion abierta, colectadas en el estado de Zacatecas, Mexico.

Medios de cultivo

La composicion de los medios de cultivo usados en la presente investigacion se describe en el Cuadro 1. Todos ellos fueron suplementados con 0.7% (p/v) de agar-agar. El pH se ajusto a 5.7 [+ o -] 0.1 y la esterilizacion se realizo en autoclave a 1.05 kg [cm.sup.-2] y 121 [grados]C, durante 15 min.

Desinfeccion y germinacion de las semillas

Con el objeto de obtener plantulas en condiciones asepticas, que permitieran la mejor respuesta de los explantes in vitro, se probaron dos metodos de desinfeccion-germinacion:

a) Desinfeccion con cloro y germinacion en medio de cultivo: se elimino la testa de 50 semillas en forma mecanica, para posteriormente sumergirlas en agua corriente por 24 horas; despues, se desinfectaron con una solucion de blanqueador domestico (1.8% v/v de cloro activo) durante 20 min, y se les aplicaron tres enjuagues con agua destilada esterilizada. Las semillas se mantuvieron a 4 [grados]C durante 48 h (estratificacion), dandoles luego una segunda desinfeccion con cloro a 1.8% durante 20 min, seguida de tres ultimos enjuagues con agua destilada esterilizada. En condiciones asepticas los embriones se disecaron y se colocaron horizontalmente en cajas de Petri con el medio 4 (SH con 5.6 mg [L.sup.-1] de BA), en el que permanecieron durante siete dias.

b) Desinfeccion y germinacion en peroxido de hidrogeno: cincuenta semillas se escarificaron, con ayuda de una lija, por la parte micropilar y se colocaron en un matraz Erlenmeyer que contenia una solucion de peroxido de hidrogeno a 3% (v/v), el cual se cubrio con papel aluminio. La solucion se renovo cada dos dias hasta la emergencia de la radicula (siete dias).

Una vez que las semillas provenientes de ambos tipos de tratamiento germinaron, se les disecaron los cotiledones y se colocaron en cajas de Petri con el medio 4.

Seleccion de explantes

Se probaron embriones completos germinados en medio de cultivo y cotiledones provenientes de estos, asi como de semillas que germinaron en peroxido de hidrogeno a 3% (v/v). Los explantes fueron disecados y colocados en cajas de Petri con medio 4.

SH, Schenk y Hildebrandt (1972), modificado por Reilly y Washer (1977); GD, Gresshoff y Doy (1972), modificado por Reilly y Washer (1977); BA, [N.sup.6]- benciladenina; ANA, acido [alfa]-naftalenacetico; AIB, acido indolbutirico.

Efecto de la benciladenina en la induccion de los brotes adventicios

Los cotiledones obtenidos de las semillas que germinaron en peroxido de hidrogeno se colocaron en forma horizontal en el medio de cultivo, de los cuales 200 se pusieron en cajas de Petri con los medios 3, 4, 5 y 6 (SH adicionado con 2.2, 5.6, 11.2 y 16.8 mg [L.sup.-1] de BA, respectivamente). Se conto el numero de los que formaron brotes a las nueve semanas y la cantidad de estos que se diferenciaron en cada cotiledon despues de 14 semanas de iniciado el experimento.

Desarrollo de los brotes

Una vez que los brotes adventicios se formaron en la superficie de los cotiledones, estos ultimos se transfirieron a cajas de Petri con medio 2 (SH sin reguladores del crecimiento). Cuatro semanas despues, los explantes fueron divididos en 3 a 5 partes y se cultivaron en frascos de 250 ml de capacidad, con 30 ml de este mismo medio. Los cotiledones con yemas adventicias se trasladaron al mismo medio fresco cada cuatro semanas. Cuando los vastagos alcanzaron una longitud aproximada de 0.6 cm, se separaron del explante inicial y se colocaron individualmente en tubos de ensaye de cristal de 80 x 20 mm, con 15 ml de medio 1 (SH a 50%).

Enraizamiento

Cuarenta y cinco brotes de 2.0 a 2.5 cm de longitud se cultivaron individualmente en tubos de ensaye (80 x 20 mm) con 15 ml del medio Gresshoff y Doy (GD) con 0.0 a 2.0 mg [L.sup.-1] de acido [alfa]-naftalenacetico (ANA) y 0.05 a 5.0 mg [L.sup.-1] de acido indolbutirico (AIB) (medios 7, 8, 9, 10 y 11) (Cuadro 1). Cada 10 dias, durante 30 jornadas, 15 de estos se transfirieron al medio GD sin reguladores (medio 12), para promover el crecimiento de raices.

Condiciones de incubacion de los cultivos

Todos los cultivos fueron incubados en un cuarto de ambiente controlado a 27 [+ o -] 2 [grados]C y fotoperiodo de 16 horas (lamparas de luz blanca fria fluorescente, con intensidad luminica de 25 [micron]mol [m.sup.-2] [s.sup.-1]).

Diseno experimental y analisis estadistico

En la prueba de germinacion se empleo un diseno experimental completamente al azar, con dos tratamientos (medio de cultivo y peroxido de hidrogeno) y dos repeticiones, utilizando para cada una de ellas un conjunto de 50 semillas. Las variables de respuesta consideradas fueron: el porcentaje de semillas que germinaron y el numero de estas que mostraron contaminacion.

Para evaluar el comportamiento de los dos tipos de explante (embriones y cotiledones) se uso una disposicion similar, con dos repeticiones de 25 entes cada una. El efecto de la BA en la induccion de brotes adventicios se estudio utilizando un procedimiento experimental analogo, con cuatro concentraciones de este regulador de crecimiento (2.2, 5.6, 11.2 y 16.8 mg [L.sup.-1]), aplicadas a traves de los medios 3, 4, 5 y 6, respectivamente (Cuadro 1). Se registro el porcentaje de individuos que emitieron brotes a las nueve semanas de haber iniciado el cultivo; para esta variable se establecieron diez repeticiones y la unidad de estudio se integro con un grupo de 20 explantes. Adicionalmente, se registro el numero de yemas adventicias producidas por explante a las 14 semanas de establecer el cultivo; en este caso se consideraron 13 repeticiones, siendo la unidad de estudio cada cotiledon proveniente de una muestra de aquellos que emitieron brotes. Todos los valores que se registraron en porcentaje se sometieron a una transformacion logaritmica de base 10, previo al analisis de varianza, y se utilizo como prueba de comparacion de medias la diferencia minima significativa (DMS, 0.05), expresando los promedios en las unidades originales. Los datos se analizaron mediante el Sistema de Analisis Estadistico (Anonimo, 1999).

RESULTADOS Y DISCUSION

Desinfeccion y germinacion de semillas

Un serio problema en este estudio fue el alto indice (80%) de afectacion microbiana de las semillas, el cual se supero cuando se les retiro la testa y se sumergieron en dos ocasiones en la solucion de hipoclorito de sodio a 1.8% (v/v), o bien cuando se les dispuso a germinar en presencia de peroxido de hidrogeno a 3% (v/v), obteniendo en ambos casos 100 % de ellas libres de infeccion.

Noventa y seis por ciento de los embriones obtenidos de las semillas desinfectadas con hipoclorito de sodio y colocados en medio de cultivo al momento de ser disecados, germinaron despues de siete dias, adquiriendo una coloracion verde que no fue homogenea para toda la estructura, sino solo para la parte que no se encontraba en contacto con el medio de cultivo (50%); el resto del embrion permanecio blanco.

El tratamiento con peroxido de hidrogeno es un metodo utilizado para acelerar la germinacion (Takacs, 1964); adicionalmente, Barnett (1977) encontro que este permitia reducir o eliminar la microflora de las semillas de especies forestales. Tales observaciones se corroboraron con el metodo empleado en este estudio en el tratamiento de las semillas de P. maximartinezii, al resultar sanas durante la germinacion y cuando sus cotiledones fueron disecados y establecidos en un medio de cultivo en condiciones asepticas.

Por otra parte, el tratamiento de las semillas con peroxido de hidrogeno permitio la germinacion (emergencia de la radicula) de 70% de estas despues del septimo dia, momento en el cual los embriones presentaron diferentes tonalidades. La discrepancia en color se asocio con la del largo de los cotiledones y la del tamano de la radicula, el blanco correspondio a cotiledones y radicula de menor talla (6 y 3 mm, respectivamente) y el verde intenso a los de mayor longitud (10 y 6 mm, en forma analoga).

A pesar de las diferencias observadas en terminos numericos en los porcentajes de germinacion registrados para los dos metodos probados, estas no fueron estadisticamente significativas, lo que implica que fueron originadas preponderantemente por variacion aleatoria mas que por aquella atribuible a los tratamientos; sin embargo, todos los cotiledones de las semillas que lograron germinar en peroxido adquirieron color verde; por ello se considero a este ultimo como el mejor metodo de germinacion y fue el que se empleo en los siguientes experimentos.

Seleccion de los explantes

Los embriones que germinaron en medio de cultivo (medio 4) crecieron y adquirieron coloracion verde a los siete dias, pero conforme transcurrio el tiempo sus hipocotilos y cotiledones se hincharon hasta convertirse en una masa amorfa de tejido, de la cual no se diferenciaron brotes adventicios. Despues de ocho semanas se tornaron de color cafe y murieron.

El efecto negativo causado por la presencia de BA (5.6 mg [L.sup.-1]) (medio 4) en los embriones de P. maximartinezii expuestos a este regulador, inmediatamente despues de su diseccion, concuerda con lo observado por Saborio et al. (1997), quienes cultivaron los de P. ayacahuite al momento de ser extraidos del megagametofito, en un medio que contenia BA (2.2 mg [L.sup.-1]). Los mencionados autores obtuvieron menos brotes adventicios en esta condicion que en un medio carente de BA durante los primeros dias de cultivo. No obstante, tal comportamiento contrasta con lo registrado por Villalobos-Amador et al. (2002), quienes cultivaron embriones de P. maximartinezii recien disecados en un medio con BA (3.9 mg [L.sup.-1]) y lograron la generacion de yemas adventicias.

La falta de respuesta morfogenetica de los embriones de P. maximartinezii a los tratamientos probados en la presente investigacion podria deberse no solo al efecto de la BA, sino al contenido de sales del medio SH, diferente al del MS (Murashige y Skoog, 1962), empleado por Villalobos-Amador et al. (2002), asi como al manejo (estratificacion) de las semillas antes de disecar y hacer crecer sus embriones en estas condiciones.

Los explantes de cotiledon cultivados en el medio de induccion (medio 4), tanto los que provenian de la germinacion en peroxido como en medio de cultivo, se alargaron y engrosaron despues de nueve dias; sin embargo, algunos de los obtenidos por el segundo metodo se observaron suculentos y rugosos, volviendose a la vez translucidos, y conforme transcurrio el tiempo se tornaron obscuros y murieron. Los explantes que estuvieron en contacto con el medio durante la germinacion no mostraron respuesta morfogenetica, y solo algunos (2%) de los que se mantuvieron alejados de el desarrollaron brotes. En contraste, 32% de los cotiledones obtenidos de semillas que se desarrollaron en peroxido logro diferenciar yemas adventicias.

El analisis estadistico de los resultados indico que de los distintos tipos de explante probados, los cotiledones de semillas que habian germinado en peroxido mostraron la mejor respuesta a las condiciones de cultivo ensayadas, por lo que fueron usados para estudiar el efecto de la BA en la morfogenesis.

Algunos aspectos que confieren a los cotiledones caracteristicas favorables como explante (Aitken et al., 1981; Saborio et al., 1997) son: a) la capacidad para establecer mejor contacto con el medio de cultivo debido a su morfologia y a que todos los cotiledones de un embrion quedan expuestos al medio nutritivo y no solo 50% de ellos, como ocurre cuando se usan embriones completos; b) la induccion de brotes adventicios no experimenta fase de callo; c) la distribucion de las yemas adventicias y su crecimiento es mas homogeneo; d) la tasa de multiplicacion se magnifica, particularmente en especies que, como P. maximartinezii, cuentan con un alto numero de cotiledones por semilla.

Efecto de la benciladenina en la diferenciacion de brotes adventicios

Los cotiledones cultivados en las distintas concentraciones de BA probadas (medios 3, 4, 5 y 6) formaron brotes adventicios. El analisis de varianza mostro diferencias altamente significativas entre los niveles de concentracion usados (Cuadro 2). Asi, 16.8 mg [L.sup.-1] indujeron el mayor porcentaje de cotiledones que produjeron yemas adventicias (53.5) y el numero mas alto de estas por explante (29.1), mientras que los cotiledones cultivados en 2.2 mg [L.sup.-1] tuvieron la menor respuesta para ambas variables analizadas. Los resultados anteriores indican que la BA aplicada en forma exogena puede inducir la organogenesis en cotiledones de P. maximartinezii al igual que lo encontrado en otras coniferas como P. pinea, P. pinaster y P. ayacahuite (Capuana y Giannini, 1995; Calixto y Pais, 1997; Saborio et al., 1997; Sul y Korban, 2004).

Los cotiledones cultivados en la concentracion mas baja de BA (medio 3) formaron brotes, especialmente en la zona de corte y las puntas, mientras que el incremento de BA en el medio promovio que un mayor numero de celulas entrara al proceso organogenetico y con ello las yemas adventicias se distribuyeron de manera mas homogenea en la superficie de los explantes; en el caso de aquellos cultivados en la concentracion de BA mas alta (medio 6) practicamente todo el cotiledon logro desarrollar vastagos. Un comportamiento similar lo observaron Biondi y Thorpe (1982) en cotiledones de P. radiata y Martinez-Pulido et al. (1992) en P. canariensis al usar diferentes concentraciones de BA.

Cabe senalar que aun la concentracion mas baja de BA (2.2 mg [L.sup.-1]) (medio 3) usada permitio triplicar (7 cotiledones de una semilla formaron 7.2 brotes cada uno) (Cuadro 2) la respuesta obtenida por Villalobos-Amador et al. (2002) (14.6 brotes por semilla) al utilizar embriones como explante. De hecho, considerando que la semilla de P. maximartinezii posee 20.5 cotiledones en promedio y que 53% de estos formaron brotes cuando se cultivaron en la concentracion mas alta de BA empleada (medio 6), seria posible obtener hasta 314 yemas adventicias por semilla en 14 semanas. Dicha tasa de induccion de brotes adventicios no se habia dado a conocer antes para ninguna especie de Pinus, ya que para P. echinata, P. viginia, P. bankisiana, P. heldreichi y P. tadea se habian obtenido 39, 91, 14, 16 y 32 brotes por semilla, respectivamente (Jang y Tainter, 1991; Harry y Thorpe, 1994; Stojicic et al., 1999; Tang y Guo, 2001).

Diferenciacion y desarrollo de los brotes

Durante los primeros siete dias en presencia de BA, los cotiledones adquirieron un color verde mas intenso e incrementaron en un tercio su longitud inicial (10 mm) (Fig. 1A). A los 14 dias en cultivo alcanzaron el doble de su longitud y volumen, y a los 21 fue posible observar tejido meristematico en su superficie (protuberancias) (Fig. 1B), a partir del cual se diferenciaron primordios de brote dos semanas mas tarde (Fig. 1C), mismas que dieron lugar a vastagos cuando se les cultivo en un medio sin BA (medio 2) (Fig. 1D).

[FIGURA 1 OMITTED]

Cabe senalar que la transferencia de los explantes al medio sin BA no fue suficiente para el desarrollo de las yemas, ya que solo algunas lograron crecer en estas condiciones, siendo necesario dividir el cotiledon para promover el crecimiento de un mayor numero; asi, mientras menor fue la cantidad de brotes unidos al explante, estos alcanzaron mayor longitud en menos tiempo.

Por otro lado, el tamano de los brotes al momento de aislarlos del explante y hacerlos crecer individualmente fue importante, ya que los muy pequenos no continuaron su crecimiento, en cambio los que median 6 mm o mas, tuvieron mayor indice de supervivencia (Fig. 1D y 1E).

En P. maximartinezii no se observo una diferencia clara en el crecimiento de los brotes inducidos en los distintos niveles de BA y solo al emplear la dosis mas baja (2.2 mg [L.sup.-1]), estos crecieron un poco mas rapido. Lo anterior pudo deberse a que los cotiledones cultivados en esta concentracion generaron menor numero de ellos y, por lo tanto, hubo menos competencia por espacio y nutrientes en relacion a los diferenciados en explantes con mayor cantidad de los mismos. Dicha respuesta coincide con lo observado por Von Arnold y Eriksson (1981) en yemas adventicias de P. contorta inducidas con concentraciones altas de BA (22 mg [L.sup.-1]), las cuales se desarrollaban mas lentamente que las formadas en aquellas mas bajas (0.2 mg [L.sup.-1]).

Por otro lado, los brotes diferenciados en la seccion del cotiledon que estuvo en contacto con el medio de cultivo por lo general crecieron hacia el interior del mismo, siendo comun que adquirieran un color verde y se volvieran translucidos y suculentos (hiperhidratacion), caracteristicas que no mostraban los que se formaron en la parte del explante opuesta al agar nutritivo. Brotes similares se generaron en cotiledones de P. ayacahuite expuestos a BA (Saborio et al., 1997). La apariencia hiperhidratada se ha asociado con la composicion quimica del agente gelificante, el dano causado a los brotes y la posicion de estos respecto al medio en las fases iniciales de la diferenciacion (Nairn et al., 1995; Saborio et al., 1997).

Enraizamiento

Aunque los brotes adventicios de algunas especies forestales como P. banksiana y P. pinea desarrollan su sistema radical sin aplicacion exogena de auxinas (Harry y Thorpe, 1994; Gonzalez et al., 1998), o responden positivamente a los tratamientos con estos reguladores de crecimiento, como es el caso de P. nigra (Lopez et al., 1996), P. pinaster (Calixto y Pais, 1997) y P. heldreichii (Stojicic et al., 1999); otros, como los de P. pinceana (Villalobos-Amador et al., 2002), forman raices en baja proporcion (7%) aun despues de tratarlos con niveles altos de auxinas (39 mg [L.sup.- 1]).

En P. maximartinezii, a pesar de haber probado varios tratamientos para estimular la formacion de raices, unicamente el medio que contenia 3 mg [L.sup.-1] de AIB (medio 10) logro inducir esta respuesta en 3% de los brotes (Fig. 1F). Por otra parte, el empleo de ANA solo o en combinacion con AIB promovio la formacion de callo en la zona del vastago que se encontraba en contacto con el medio de cultivo. Esta masa de celulas indiferenciadas se hizo mas evidente cuando los brotes se expusieron a estas auxinas por tiempos prolongados, como lo indican Villalobos-Amador et al. (2002), y en ocasiones su crecimiento fue tal que se extendio a las hojas basales.

Los resultados obtenidos confirman lo observado por Villalobos-Amador et al. (2002), quienes informan que los brotes adventicios de P. maximartinezii (diferenciados a partir de embriones), mostraron baja eficiencia de enraizamiento. Dichos autores probaron cinco distintas concentraciones y combinaciones de fitorreguladores (BA , AIB y ANA) y solo lograron inducir raices en 13% de los brotes despues de mantenerlos durante 4 h en presencia de 39 mg [L.sup.-1] de AIB y 9.6 mg [L.sup.-1] de BA .

Se ha propuesto que la capacidad de enraizamiento esta relacionada con el tipo de citocinina usada para la induccion de yemas adventicias. Al respecto, Webb y Street (1977) observaron que los brotes de Pinus contorta y Picea sitchensis formaban mas raices cuando empleaban para su diferenciacion 2-iP (2-isopenteniladenina) o cinetina (6-furfurilaminopurina), que cuando se utilizaba BA. Tambien encontraron que las citocininas con capacidad alta para promover la formacion de yemas, inhibian la generacion de raices.

Los resultados del presente trabajo permiten vislumbrar al cultivo de tejidos como una herramienta valiosa en la propagacion de P. maximartinezii, ya que esta tecnologia hace de la semilla una forma de propagacion mas eficiente, aspecto relevante si se considera que la sobrecosecha y el comercio de sus semillas son algunos factores que amenazan la supervivencia de esta especie.

El protocolo aqui usado muestra que un manejo distinto al empleado por otros autores (Villalobos-Amador et al., 2002), tanto de las condiciones de germinacion de las semillas (en peroxido), como de los niveles de los reguladores de crecimiento utilizados para la induccion (BA), asi como del uso de cotiledones como explante, puede generar una forma alternativa de propagacion in vitro de P. maximartinezii, que permita incrementar la tasa de multiplicacion de las semillas de este taxon. Dicha aptitud podria reducir el riesgo de extincion al que se enfrenta tal pinonero, dado que la tasa reproductiva es uno de los parametros mas importantes que contribuyen a que una especie se establezca exitosamente en un nicho ecologico.

Conclusiones

El protocolo desarrollado es eficiente para la diferenciacion de brotes adventicios de Pinus maximartinezii en relacion con lo reportado hasta ahora en la literatura.

El uso de cotiledones como explante supera significativamente la respuesta obtenida con embriones. Los brotes adventicios obtenidos pueden, aunque en baja proporcion, formar raices y con ello dar lugar a plantas nuevas.

La propagacion in vitro podria formar parte de un programa de conservacion de esta especie, debido a la alta tasa de multiplicacion que se obtiene con la aplicacion del presente protocolo.

Recibido en noviembre de 2007.

Aceptado en julio de 2009.

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Alejandrina Robledo Paz (1), Victor Manuel Villalobos Arambula (2) y Amalio Santacruz Varela (1)

(1) Colegio de Postgraduados, Posgrado en Recursos Geneticos y Productividad, Campus Montecillo. km 36.5 carretera Mexico-Texcoco, 56230 Texcoco, Estado de Mexico, Mexico. arobledo@colpos.mx, asvarela@colpos.mx.

(2) Secretaria de Agricultura, Ganaderia, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacion. Avenida Municipio Libre num. 377. Colonia Santa Cruz Atoyac, 03310 Mexico, D.F. vvilla@sagarpa.gob.mx.
Cuadro 1. Composicion de los medios utilizados para la formacion
de brotes adventicios de P. maximartinezii a partir de cotiledones.

                                   Reguladores de
        Sales y                     crecimiento
Medio   vitaminas   Sacarosa (%)   (mg [L.sup.-1])

1        50% SH         2.0
2          SH           3.0
3          SH           3.0            BA, 2.2
4          SH           3.0            BA, 5.6
5          SH           3.0            BA, 11.2
6          SH           3.0            BA, 16.8
7          GD           2.0            ANA, 0.5
                                       AIB, 0.05
8          GD           2.0            ANA, 0.5
                                       AIB, 1.0
9          GD           2.0            ANA, 1.0
                                       AIB, 2.0
10         GD           2.0            AIB, 3.0
11         GD                          AIB, 5.0
12         GD

Cuadro 2. Porcentajes de explantes de Pinus martinezu
que diferenciaron brotes (a las 9 semanas) y el numero
de estos por explante (a las 14 semanas) en cuatro
medios de cultivo.

Medio de cultivo   Explantes con    Num. de brotes
                     brotes (%)      por explante

3                      34.5 c            7.2 c
4                      44.5 b           14.3 b
5                      44.5 b           17.0 b
6                      53.5a            29.l a
DMS (0.05)              7.28             5.40

Promedios con diferente letra en las columnas
son estadisticamente diferentes (DMS, 0.05).
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Title Annotation:Texto en Portuguese
Author:Robledo Paz, Alejandrina; Villalobos Arambula, Victor Manuel; Santacruz Varela, Amalio
Publication:Acta Botanica Mexicana
Date:Oct 1, 2009
Words:5492
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