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Induccion de la reaccion acrosomica en espermatozoides de raton mediante solubilizados de zona pelucida de alpaca (Lama pacos L.).

Induction of the acrosomal reaction in mouse spermatozoa by the solution of pellucid zone from alpaca (Lama pacos L.)

Resumen

La acrosina, es uno de los componentes principales del acrosoma, presenta actividad similar a la tripsina, y es liberado luego de la reaccion acrosomica (RA). El objetivo del presente trabajo fue estudiar la induccion de la RA en espermatozoides de raton con zonas pelucidas homologas y heterologas. Espermatozoides de raton capacitados por 2 horas en medio IVF suplementado con albumina, heparina y suero sintetico a 37 [grados]C y 5% C[O.sub.2] fueron incubados en ausencia de Zona Pelucida (ZP) o en presencia de solubilizados de ZP aisladas de raton (0,78 mg/ml) y alpaca (0,78 mg/ml y 2,35 mg/ml). La RA se evaluo mediante inmunocitoquimica con anticuerpo monoclonal anti-acrosina humana C5F10 a intervalos de 1 hora durante 4 horas. Los resultados obtenidos en espermatozoides de raton evidencian un incremento signi. cativo (p< 0,05) de la reaccion acrosomica inducida con ZP homologa y heterologa.

Palabras claves: Capacitacion espermatica, reaccion acrosomica, zona pelucida.

Abstract

Acrosin is one of the principal components in the acrosome, has trypsin-like activity and is secreted after the Acrosome Reaction (RA). The aim of this study was to study the induction of the acrosomal reaction in mouse sperms with homologous- Pellucid Zone and heterologous- Pellucid Zone. Mouse sperms were capacitated by two hours in IVF medium, supplemented with albumin, heparin and synthetic serum to 37 [grados]C and 5% C[O.sub.2], and before they were incubated in absence of ZP and in present of solubilized ZP from mouse (0,78 mg/ml) and alpaca (0,78 mg/ml y 2,35 mg/ml). The RA was evaluated through immunocytochemistry with monoclonal antibodies anti-human acrosin C5F10 within intervals of 1 hour during four hours. The results show a signi. cant increase (p<0,05) in acrosome reaction induced with homologous-ZP and heterologous-ZP.

Keywords: sperm capacitation, acrosome reaction, pellucid zone.

Introduccion

El acrosoma es una gran vesicula secretora, ubicada en la region apical de la cabeza de los espermatozoides. La reaccion acrosomica (RA) es una multiple fusion de la membrana externa del acrosoma y la membrana plasmatica en la region anterior de la cabeza del espermatozoide, caracterizada por una extensiva fusion de vesiculas hibridas de estas membranas con la liberacion del contenido acrosomal y exposicion de la membrana acrosomal interna (Yanagimachi, 1994).

La capacitacion es de. nida como el tiempo que el espermatozoide debe residir en el tracto reproductor femenino antes de que adquiera la habilidad de fecundar al ovocito. Mientras que la capacitacion in vitro es el tiempo de incubacion de los espermatozoides en un medio de cultivo apropiado (Austin, 1951; Chang, 1951; Austin, 1952). La capacitacion in vitro implica una serie de procesos tales como el acoplamiento de los pasos de traduccion de senales que regulan el inicio de la reaccion acrosomica, fosforilacion de proteinas, modi. cacion de los patrones de movilidad del flagelo, desarrollo de la capacidad de fusionarse con el ovocito, hiperpolarizacion del potencial de membrana y la elevacion del pH y de los niveles de calcio intracelular.

La zona pelucida (ZP) es una matriz proteica extracelular que rodea al gameto femenino de los mamiferos, esta compuesta por tres distintas glicoproteinas ZP1, ZP2 y la ZP3 en ratones (Wassarman y Albertini, 1994; Wassarman, 1995) y se ha demostrado que el inductor natural de la reaccion acrosomica es ZP3, la cual induce la liberacion del contenido acrosomal; permitiendo el inicio de la segunda fase en la interaccion espermatozoide-ZP. Esta fase involucra una interaccion mas estable con la membrana acrosomal interna, y donde la glicoproteina ZP2 es la responsable (Bleil et al., 1988; Yanagimachi, 1994).

Materiales y metodos Muestras de Espermatozoides

Cinco ratones de la cepa Balb C de 8 semanas de edad alimentados con comida balanceada y agua ad libitum, mantenidos a fotoperiodo de 14 horas luz y 10 horas oscuridad fueron sacri. cados por dislocacion cervical, se les extrajo la cola del epididimo homogenizandolo en medio de cultivo de solucion salina balanceada de Earle suplementado con suero sustituto sintetico, BSA (Sigma Aldrich), piruvato de sodio, heparina 10 UI/ml, bicarbonato de sodio, estreptomicina 50 mg/L y penicilina 50 UI/ml.

Aislamiento de Zonas Pelucidas

Los ovarios fueron disectados en Buffer Fosfato Salino; las zonas pelucidas, reconocidas en el microscopio-estereoscopio, colectadas con la menor cantidad de volumen de PBS, transferidas a un tubo de microcentrifuga, centrifugadas a 16000 RPM por 15 minutos, eliminando el sobrenadante se procedio a solubilizar a 68 [grados]C por una hora, posteriormente se centrifugo a 16000 RPM por 15 minutos, cuidadosamente se extrajo el sobrenadante y se almaceno a -20 [grados]C (Miller et al., 1992).

Separacion y Capacitacion Espermatica

La seleccion de espermatozoides se realizo por swim up por 30 minutos en medio de cultivo IVF (Medicult), el proceso de capacitacion fue por un periodo de 2 horas a 37 [grados]C y 5% C[O.sub.2], de donde se recuperaron los espermatozoides capacitados desde la parte superior del tubo.

Induccion de la Reaccion Acrosomica

La reaccion acrosomica fue inducida en espermatozoides de raton capacitados, incubados con soluciones de zona pelucidas (ZP) aisladas de ovocitos de ratones y de alpacas hembras (Huancavelica-Peru) (Miller et al., 1992) durante 2 horas. Se cuantifico la concentracion de proteina de ZP aislada con la tecnica de Bradford (Fig. 1).

[FIGURA 1 OMITIR]

Evaluacion de la Reaccion Acrosomica

Se tomaron 20 [micron]L de espermatozoides capacitados de cada de muestra a intervalos de una hora y fijados en paraformaldehido 4% sobre laminas limpias. La muestra posteriormente es incubada en solucion de bloqueo (BSA 0,8%, IGSS 0,1%, suero sustituto 5%, Na[N.sub.3] 2 mM a pH 7,4) por 30 minutos; enfrentada la muestra al anticuerpo C5F10 (anticuerpo monoclonal anti-acrosina humana) en buffer de incubacion (BSA 0,8%, IGSS 0,1%, suero sustituto 1%, Na[N.sub.3] 2 mM) por 1 hora, posteriormente la muestra fue incubada con anticuerpo secundario (Inmunogold [TM]) en oscuridad por 12 horas a temperatura ambiente. Las muestras fueron lavadas con PBS despues de cada paso, post-fijadas en glutaraldehido 2%, ampli. cadas con plata y evaluadas a microscopio de luz, contabilizando los espermatozoides como no reaccionados cuando el acrosoma es refringente y como reaccionado cuando el mismo esta coloreado.

Estadistica

La comparacion estadistica de los parametros evaluados se realizo con prueba estadistica no parametrica Kruskal-Wallis con un nivel de signi. cancia p<0,05, todos los analisis se hicieron con el paquete estadistico MINITAB version 14.0.

Resultados

La muestra de espermatozoides obtenida de cola de epididimo de ratones Balb C muestra una concentracion promedio de 4,5 x [10.sup.8] espermatozoides/ml, luego de realizado el proceso de seleccion espermatica y capacitacion in vitro la motilidad espermatica fue del 95% y se trabajo con una muestra 10 veces diluida a la concentracion inicial.

La concentracion proteica total aislada desde 200 zonas pelucidas de raton y alpaca fueron de 0,78 mg/ml y 2,35 mg/ml respectivamente, realizandose una dilucion para comparar los niveles de reaccion acrosomica en los espermatozoides de raton con cada una de las especies.

La tabla 1 presenta los porcentajes de evaluacion del estado del acrosoma en espermatozoides de raton posterior a la incubacion con los solubilizados de ZP de raton y 2 diferentes concentraciones de proteinas para ZP de alpaca.

El estado del acrosoma fue evaluado de acuerdo a la presencia de un acrosoma refringente en un espermatozoide no reaccionado y region acrosomal coloreado de uno reaccionado como se muestra en la figura 2.

[FIGURA 2 OMITIR]

Discusion

Durante la incubacion para la capacitacion in vitro de los espermatozoides de raton se retira el colesterol de la membrana plasmatica del espermatozoide, debido a la capacidad de la albumina de aceptar moleculas de colesterol, lo que produce un incremento de la fluidez por remocion de componentes y reordenamiento de las proteinas de membrana (Cardona-Maya, 2005). Se ha establecido que zonas pelucidas de ovocitos no fertilizados de hamster inducen la reaccion acrosomica en espermatozoides capacitados de raton, humano y rata, mientras que la zona pelucida de estas especies no induce reaccion acrosomica en los espermatozoides de hamster (Uto et al., 1988). Para el caso de Alpaca-Raton los resultados obtenidos mediante inmunocitoquimica despues de la induccion de la RA son signi. cativos (p<0,05) y muestran que los solubilizados de ZP de raton inducen niveles mayores de reaccion acrosomica en los cuatro tiempos, mientras que ZP alpaca (2,35 mg/ml) muestra un alto incremento de induccion de RA al tiempo 2, respecto a la muestra ZP alpaca (0,78 mg/ml); demostrandose que en los solubilizados de alpaca se encuentra el inductor de la RA, que interactua con los receptores en la cabeza de los espermatozoides de raton e induce la reaccion acrosomica de manera especie-interespecifica.

Altas concentraciones de ZP3 de raton inducen reaccion acrosomica, mientras pequenos glicopeptidos de ZP3 se unen al espermatozoide inhibiendo su union al ovocito (Wassarman, 1988); estos resultados respaldan que los solubilizados concentrados de ZP de raton y de alpacas inducen reaccion acrosomica en espermatozoides de raton in vitro, demostrando que en los solubilizados de ZP de alpaca se encuentra un inductor de la reaccion acrosomica.

Las restricciones impuestas por la ZP no son absolutas in vitro (Wassarman y Litscher; 2001), cambios en la estructura de los oligosacaridos (composicion, secuencia, uniones y/o modificaciones) junto con los cambios en las proteinas de union en el espermatozoide deben ser tomados en cuenta para la union especie-especifica entre los gametos (Wassarman y Litscher, 1995), asi el espermatozoide de raton se une al ovocito de hamster in vitro (Moller et al., 1990), a ovocitos humanos y ovocitos de raton que expresan ZP3 recombinante humana (Rankin et al., 1998), y a ademas experimenta reaccion acrosomica in vitro con solubilizados de ZP de alpacas a concentraciones de 0,78 mg/ml y 2,35 mg/ml esto debido probablemente a similaridad en la secuencia de las glicoproteinas de ZP y en las modi. caciones post-traduccionales.

Agradecimientos

Este trabajo de investigacion esta enmarcado dentro del trabajo de tesis de maestria de Luis Guzman Masias y esta enmarcado dentro del proyecto: <<Molecular Analisis of Gametes Interaction in Alpaca Part II>> CSI No 051001022 financiado por la ICGEB

Literatura citada

Austin CR. 1951. Observations on the penetration of sperm into the mammalian egg. Aust J Sci Res 4 (series B), 581-596.

Austin CR. 1952. The capacitation of sperm. Nature 170: 326.

Bleil JD, Greve JM, Wassarman PM. 1988. Identi. cation of a secondary sperm receptor in the mouse egg zona pellucida: role in maintenance of binding of acrosome-reacted sperm to eggs. Develop Biol 128: 376-385.

Cardona-Maya W, Cadavid A. 2005. Evaluacion de la reaccion acrosomal en espermatozoides humanos inducida por los monosacaridos manosa y N-acetilgucosamina. Act. Urol. Esp. 29: 676-684.

Chang MC. 1951. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature 168: 697-698.

Miller C, Fayrer-Hosken R, Timmons T, Lee A, Caudle A, Dunbar B. 1992. Characterization of equine zona pellucida glycoproteins by polyacrylamide gel electrophoresis and immunological techniques. J. Reprod. Fert. 96, 815:825.

Moller C, Bleil R, Kinloch P, Wassarman PM. 1990. Structural and functional relationship between mouse and hamster zona pellucida glycoproteins. Dev. Biol. 137: 276-286.

Rankin T, Tong Z-B, Castle PE, Lee E, Gore-Langton R, Nelson LM, Dean J.1998. Human ZP3 restores fertility in Zp3-null mice without affecting order-specific sperm binding. Development. 125: 2415-2424.

Uto N, Yoshimatsu N, Lopata A, Yanagimachi R. 1988. Zona-induced acrosome reaction of hamster spermatozoa. J. Exp. Zool. 248: 113-120.

Wassarman PM, Albertini DF. 1994. The mammalian ovum. In The Physiology of Reproduction 2nd Edn pp 79-122 Eds E Knobil, JD Neill. Raven Press Ltd. New York.

Wassarman PM, Litscher ES. 1995. Sperm-egg recognition mechanisms in mammals. Curr. Top. Dev. Biol. 30:1-19

Wassarman PM, Litscher ES. 2001. Towards the molecular basis of sperm and egg interaction during mammalian fertilization. Cell Tissue Organs. 168:36-45.

Wassarman PM. 1988. Zona pellucida glycoproteins. Annu. Rev. Biochem. 57:415-442.

Luis Guzman, Susan Perez y Martha Valdivia

Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Ciencias Biologicas, Instituto de investigaciones de Ciencias Biologicas Antonio Raimondi. Email Luis Guzman: luis_guzman@ipbiomol.com
Tabla 1. Espermatozoides que experimentaron reaccion acrosomica en
ausencia y presencia de solubilizado de zona pelucida homologa y
heterologa.

               Hora 1                       Hora 2

Control        12,9%                        17,33%
(0 mg/ml)

ZP Raton       57,14% *                     54,17% *
(0,78 mg/ml)

ZP Alpaca      17,84% ([pounds sterling])   24,32% ([pounds sterling])
(0,78 mg/ml)

ZP Alpaca      16,07% ([pounds sterling])   41,86% ([yen])
(2,35 mg/ml)

               Hora 3                       Hora 4

Control        18,64%                       13,04%
(0 mg/ml)

ZP Raton       83,33% *                     79,79% *
(0,78 mg/ml)

ZP Alpaca      36,95% ([pounds sterling])   53,33% ([pounds sterling])
(0,78 mg/ml)

ZP Alpaca      42,62% ([yen])               62,5% ([yen])
(2,35 mg/ml)

*, ([pounds sterling]), ([yen]). Representan diferencia significativa
en cada hora evaluada respecto al control y entre los tratamientos
(p<0.05).
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Article Details
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Author:Guzman, Luis; Perez, Susan; Valdivia, Martha
Publication:Revista peruana de biologia
Date:Jul 1, 2007
Words:2372
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