Printer Friendly

Incidence of Southern Bean Mosaic Virus (SBMV) on common bean (Phaseolus vulgaris L.) in Aragua State, Venezuela, and partial molecular characterization of a viral isolate/Incidencia del virus Southern Bean Mosaic Virus (SBMV) en caraotas (Phaseolus vulgaris L.) en el estado Aragua, Venezuela, y caracterizacion molecular parcial de un aislamiento viral...

Introduccion

El frijol o caraota (Phaseolus vulgaris L.) es una de las leguminosas mas importantes en el mundo con cerca de 26 x [10.sup.6]ha plantadas, particularmente en America Latina, su centro de origen (Makkouk et al., 2003). En Venezuela, el cultivo de la caraota cubria unas 66300ha para el ano 1990, con una produccion anual estimada en 37200t. Segun datos del ultimo censo agricola, la superficie total destinada a este rubro disminuyo en 10020ha para el ano 2005, el cual constituye el registro mas bajo en la produccion (Anonimo, 2007). El origen del descenso no se ha determinado, pero podria atribuirse al efecto de enfermedades de origen viral. Estas causan severos danos a la produccion de caraotas, razon por la cual se les ha prestado mas atencion a los virus que a otros potenciales patogenos. Existen aproximadamente 30 virus bien caracterizados que infectan el cultivo, pertenecientes a los grupos Alfamovirus, Bromovirus, Comovirus, Cucumovirus, Begomovirus, Illarvirus, Luteovirus, Potyvirus, Sobemovirus, Tobamovirus, Necrovirus y Tospovirus (Matthews, 1982; Hall, 1991; Makkouk et al., 2003).

El Southern bean mosaic virus (SBMV) es un Sobemovirus que infecta una gran cantidad de leguminosas en Venezuela, y fue aislado de plantas de caraota en el ano 1987 (Mora et al., 1987). Es transmitido por los vectores Ceratoma trifurcata y Epilachana variestis de manera semipersistente, y puede transmitirse tambien a traves de semillas (Morales y Gamez, 1989). En el pais, se ha determinado que el virus puede ocasionar perdidas de hasta 50% en el cultivo, reduciendo la produccion de semillas en un 70% (Mora, 1993).

Debido a la importancia economica que tiene el SBMV en el rendimiento y produccion de caraotas, y a la relativamente escasa informacion sobre este virus en el pais, este estudio se llevo a cabo con la finalidad de de terminar la incidencia actual del virus en uno de los principales estados productores mediante un ensayo inmunoenzimatico (ELISA). No existen datos moleculares previos acerca de los aislamientos de SBMV en Venezuela, por lo que se describe la secuencia parcial del extremo 5' terminal de un aislamiento del virus mediante tecnicas de biologia molecular (RT-PCR). El conocimiento molecular del virus es de valiosa utilidad no solo para la confirmacion de la especie, sino para el establecimiento de metodos de diagnostico rapidos y para la caracterizacion de aislamientos virales para futuros estudios de busqueda de germoplasma resistente.

[FIGURE 1 OMITTED]

Materiales y Metodos

Los muestreos fueron llevados a cabo durante el 2009 en los principales municipios productores de caraota en el estado Aragua, Venezuela. (Figura 1, Tabla I). En total se tomaron 819 muestras de la hoja mas joven de plantas que mostraban sintomas de enfermedades de origen viral tales como mosaico, deformacion de la hoja, acortamiento intervenial, amarillamiento de las nervaduras, rugosidad y arrugamiento de las hojas. Las muestras fueron debida mente identificadas y colocadas en bolsas plasticas sobre hielo, y transportadas al laboratorio de Biotecnologia y Virologia vegetal del Instituto Veneolano de Investigaciones Cientificas.

Las muestras fueron analizadas mediante el ensayo de ELISA indirecta (Koening, 1981), utilizando anticuerpos especificos contra SBMV (American Type Culture Collection, PVS 37). La absorbancia a 405nm se registro utilizando el lector de ELISA automatico ELx800 (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT, EEUU). Las muestras con lecturas de absorbancia que excedian tres veces el valor de las muestras controles (extractos de plantas sanas), fueron consideradas positivas para la presencia de SBMV. Extractos de plantas enfermas fueron incluidos como controles positivos en la reaccion. No se analizo la presencia de otros virus.

Debido a la ausencia de estudios moleculares previos del SBMV en Venezuela, se realizo un ensayo de transcripcion reversa (RT) acoplada a la amplificacion en cadena de la polimerasa (PCR) en un solo paso para amplificar parte del extremo 5' terminal de SMBV a partir de material vegetal de una planta que resulto positiva para el virus por ELISA. El ARN total fue extraido de una muestra positiva para ELISA a partir de 0,1g de tejido, mediante el uso del estuche de extraccion para ARN RNeasy Plant Mini Kit[R] (Quiagen, Hilder, Alemania), de acuerdo al manual de la casa comercial; resuspendiendose posteriormente 20[micro]l de agua ultrapura (Invitrogen, Carlsbad, CA, EEUU). La reaccion de RT-PCR se llevo a cabo utilizando un estuche comercial que incluye las enzimas SuperScript[R] III One-Step RTPCR System y Platinum[R] Taq DNA Polymerase (Invitrogen), de acuerdo al protocolo de la casa comercial. Para la amplificacion se utilizaron los cebadores disenados para el segmento 5' terminal del genoma viral (Espinha et al., 2004). Los productos amplificados fueron examinados mediante geles de agarosa 1%. Los amplicones fueron purificados utilizando el sistema Gel Extraction Kit (Qiagen), y se clonaron en el vector pGEM-T easy (Promega, Madison, WI, EEUU) de acuerdo a las recomendaciones de la casa comercial. Los plasmidos recombinantes se replicaron y purificaron utilizando el estuche Qiaprep Spin Miniprep kit (Qiagen). Tres clones independientes fueron secuenciados por la empresa Macrogen, Korea, utilizando los cebadores M13. Los alineamientos multiples de las secuencias fueron generadas mediante el programa CLUSTALW (Chenna et al., 2003).

Resultados

Incidencia relativa de SBMV en Aragua

Se determino la presencia del virus SBMV en plantas de caraota colectadas en 2009 en estado Aragua, Venezuela, por el metodo de ELISA. La incidencia relativa del virus SBMV se muestra en la Tabla I. Los resultados muestran que el virus se distribuye en todas los municipios examinados, alcanzando un 31,3% de incidencia. Los municipios con altas tasas de infeccion fueron Girardot (43,87%), San Casimiro (42,85%), Santiago Marino (47,05%) y Santos Michele na (43,18%); mientras que tasas de infeccion menores, fueron registradas en Urdaneta (15%), Jose Angel Lamas (15%) y Libertador (16,66%).

[FIGURE 2 OMITTED]

Caracterizacion molecular parcial de SBMV

Fragmentos de ADN de 539pb fueron amplificados a partir de la muestra vegetal positiva para el virus por ELISA. La secuencia nucleotidica obtenida se registro en Genbank con el No GU903316.3. Al comparar dicha secuencia con las depositadas en el Genbank, se encontraron maximas identidades a nivel nucleotidico con los aislamientos SBMVB (Bean strain, GenBank: J02355.1), SBMV-S (Arkansas, EEUU, Genbank: AF055888.1) y SBMV-B (Arkansas, EEUU, Genbank: AF055887.1). Ademas, se encontraron identidades menores de la secuencia con los Sobemovirus Sesbania mosaic virus (SeMV, AY004291.2) y Southern cowpea mosaic virus SCPMV (M23021.1), con valores de 88 y 71% respectivamente.

El analisis de la secuencia mostro un extremo 5' terminal no codificante (UTR), en el cual se encontro un segmento parcialmente complementario al ARN ribosomal 18S, y a continuacion una primera pauta abierta de lectura (ORF1) que se solapa en 33 nt con el extremo 5' de un segundo ORF (ORF2; Figura 2), tal como se habia descrito previamente (Espinha et al., 2004). La Tabla II muestra como la secuencia nucleotidica y aminoacidica deducida del ORF1, presenta una identidad de 96,4 y 96,6% respectivamente, comparada con SBMV aislado de Arkansas ([SBMV.sup.ARK]; Lee y Anderson, 1998). Igualmente, se encontro una alta homologia con los aislados SBMV-B y SBMV-S. Los valores de identidad son algo menores al compararlos con el aislado de Brasil SBMV-SP (Sao Paulo) y mucho menores al compararlos con SeMV y SCPMV, otras especies del genero Sobemovirus. La comparacion con las secuencias del GenBank indica que el ORF1 de SBMV-Ve codificaria para una putativa proteina de movimiento que contiene 148 nucleotidos, con un aminoacido mas que SBMV-SP y los mismos que SMB V-B y SBMV-ARK.

Discusion

La ausencia de un programa eficiente de certificacion de semillas de caraota libres de virus en Venezuela podria explicar la presencia del virus SBMV en casi todos los municipios del estado Aragua, uno de los mayores productores de caraota en el pais.

Se requieren muestreos periodicos y continuos, con el fin de evaluar la dinamica de la incidencia de los virus que infectan el cultivo, y de determinar los factores epidemiologicos responsables de su diseminacion. Los datos de este estudio determinan una alta incidencia de SBMV en el estado Aragua. El SBMV es altamente infectivo y se transmite muy eficientemente a traves de semillas, contacto entre las plantas, insectos vectores y a traves del suelo infectado (Hall, 1991), por lo que se debe considerar mecanismos de control para el virus, con la finalidad de evitar las perdidas economicas asociadas a la enfermedad.

Para la efectiva implementacion de estrategias de manejo integrado y control del SBMV en el pais, es necesario caracterizar la composicion genetica de la poblacion viral circulante, y contar con una herramienta de diagnostico rapida y efectiva. En tal sentido, se ha establecido un metodo molecular (RT-PCR) en un solo paso que permite el analisis de un gran numero de muestras. La identidad aminoacidica del aislamiento SBMV-Ve con SBMV-B ARK podria sugerir que el virus pudo ser introducido al pais por la via de semillas enfermas. Sin embargo, es necesario caracterizar el extremo 3' de los aislados de SMB V venezolanos para estudiar la diversidad genetica del virus en el pais y comparar su filogenia. Experimentos tendientes a amplificar el gen de la proteina de capside (del extremo 3'terminal) de algunos de los aislamientos colectados en esta investigacion, estan siendo llevados a cabo.

Recibido: 30/09/2011. Modificado: 11/09/2012. Aceptado: 13/09/2012.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Banco Interamericano de Desarrollo (BID) y al Fondo Nacional de Ciencia y Tecnologia (FONACIT) (Proyecto BID-FONACIT No 2004000368) y al Instituto Venezolano de Investigaciones Cientificas (IVIC-Proyecto N[degrees] 428) por el financiamiento de este estudio.

REFERENCIAS

Anonimo (2007) Estudio Prospectivo para el Fortalecimiento del Sector Biotecnologico como Apoyo a la Seguridad Alimentaria del Pais. Ministerio del Poder Popular para la Ciencia y la Tecnologia. Caracas, Venezuela. 33 pp.

Chenna R, Sugawara H, Koite T, Lopez R, Gibson TJ, Higgins DG, Thompson JD (2003) Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucl. Ac. Res 31: 3497-3500.

Espinha L, Gaspar J, Ward R, Ruller R, Carmargo L (2004) Caracterizacao da regiao 5'-terminal de um isolado brasileiro do Southern bean mosaic virus. Fitopatol. Bras. 29: 328-331.

Hall R (1991) Compendium of Bean Diseases. American Phytopathological Society. St Paul, MN, EEUU. 102 pp.

Koening R (1981) Indirect ELISA methods from the broad specificity detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 55: 53-62

Lee L, Anderson J (1998) Nucleotide sequence of a resistance breaking mutant of Southern bean mosaic virus. Arch. Virol. 143: 2189-2201.

Makkouk K, Kumari S, Hughes J, Muniyappa V, Kulkarni N (2003) Other legumes. En Loebenstein G, Thottaphilly G (Eds.) Virus and Virus-Like Diseases of Major Crops in Developing Countries. Kluwer. Dordrecht, Holanda. pp. 447-476.

Matthews R (1982) Classification and nomenclature of viruses. Forth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Intervirology 17: 1-199.

Mora O, Trujillo G, Borges O, Cuello R (1987). Mosaico sureno de la caraota (Southern bean mosaic virus) afectando Phaseolus vulgaris L. en Venezuela. En X Seminario Nacional de Fitopatologia. Maracay, Venezuela. p. 29.

Mora O (1993) Efecto del virus del mosaico sureno de la caraota (Phaseolus vulgaris L.) en componentes del rendimiento de la variedad "UCV-Manuare". IV Reuniao Nacional de Pesquisa de Feijao. Londrina PR, Brasil. p. 113.

Morales F, Gamez R (1989) Beetle transmitted viruses. En Schwarts H, Pastor Corrales M (Eds.) Bean Production Problems in the Tropics. 2a ed. CIAT. Cali, Colombia. pp. 363-378.

Edgloris Marys. Ph.D. en Biologia, Instituto Venezolano de Investigaciones Cientificas (IVIC). Investigadora, IVIC, Venezuela. Direccion: Laboratorio de Biotecnologia y Viro logia Vegetal, Centro de Microbiologia y Biologia Celular, IVIC. Apartado Postal 20632, Caracas 1020-A, Venezuela. e-mail: emarys@ivic.gob.ve

Thaly Fernandez-Rodriguez. M.Sc. en Biologia, IVIC. Estudiante de Doctorado. AlPlantaInstitute for Plant Research, Alemania.

Alexander Mejias. Licenciado en Biologia, Universidad Central de Venezuela. Profesional Asociado a la Investigacion, IVIC, Venezuela.
TABLA I
OCURRENCIA DE LA INFECCION POR SBMV
EN CARAOTAS EN DIFERENTES MUNICIPIOS
DEL ESTADO ARAGUA

Municipios                 No        [SBMV.sup.+]   Infeccion (%)
                      muestras (n)

Camatagua                  81            32             39,5
Girardot                   98            43             43,87
Jose Angel Lamas           20             3              15
Jose Felix Ribas           80            25             31,25
Jose Rafael Revenga        52            11             21,15
Libertador                 48             8             16,66
San Casimiro               77            33             42,85
San Sebastian              65            22             33,84
Santiago Marino           102            48             47,05
Santos Michelena           44            19             43,18
Tovar                      76            24             31,57
Urdaneta                   20             3              15
Zamora                     56            15             26,78

TABLA II
PORCENTAJE DE IDENTIDAD NUCLEOTIDICA (nt)
Y AMINOACIDICA (AA) DEL FRAGMENTO
DEL GENOMA SECUENCIADO DEL AISLADO
SBMV-VE CON VIRUS RELACIONADOS

Aislado                         ORF1

                   5'-UTR    nt     aa

SMBV-[B.sup.ARK]    96,7    96,4   96,6
SBMV-B              96,7    97,1   96,6
SBMV-S              96,7    96,6   96,6
SBMV-SP             89,1    80,9   83,0
SeMV                87,6    52,1   34,5
SCPMV               70,7    43,0   20,3
COPYRIGHT 2012 Interciencia Association
No portion of this article can be reproduced without the express written permission from the copyright holder.
Copyright 2012 Gale, Cengage Learning. All rights reserved.

Article Details
Printer friendly Cite/link Email Feedback
Author:Marys, Edgloris; Fernandez-Rodriguez, Thaly; Mejias, Alexander
Publication:Interciencia
Date:Sep 1, 2012
Words:2111
Previous Article:Reduction and timing of fungicide application in the management of scab in plum trees/Reducao e epocas de aplicacoes de fungicidas para manejo da...
Next Article:Caribbean landscapes and their biodiversity/Paisajes caribenos y su diodiversidad/Paisagens do caribe e sua biodiversidade.
Topics:

Terms of use | Privacy policy | Copyright © 2019 Farlex, Inc. | Feedback | For webmasters