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Improvement of survival and immune response in Litopenaeus vannamei infected with White Spot Syndrome Virus and fed diets enriched with carotene.

Optimizacion de la supervivencia y respuesta inmune de Litopenaeus vannamei alimentado con dietas ricas en carotenos e infectado con el Sindrome de Mancha Blanca

INTRODUCCION

El virus de mancha blanca o WSSV (por sus siglas en ingles) es el virus de mayor virulencia reportado en la industria camaronicola (Wu et al., 2005; Liu et al., 2007; Jiang, 2011). Los organismos infectados presentan manchas blancas de 0,5-3 mm de diametro en el exoesqueleto, letargo, coloracion rojiza en uropodos, telson, pereiopodos y pleopodos, con mortalidades masivas en los primeros 30 dias de cultivo (Sanchez-Paz, 2010). WSSV fue reportado por primera vez en Mexico en 1999, afectando al estado de Sonora, donde en 2010 se determinaron perdidas economicas importantes y en el ano 2013 con la llegada del sindrome de la muerte temprana (EMS) se perdio el 50% de la produccion total de camaron (COSAES, 2013). WSSV posee la capacidad para infectar al menos 93 especies, en su mayoria crustaceos decapodos (Andrade, 2011; Jiang, 2011; MaBadhul et al., 2012). Ademas, es dificil de controlar ya que se transmite de manera horizontal y vertical (Liu et al., 2007).

Los camarones peneidos poseen un sistema inmune innato que los protege de microorganismos daninos (Li & Xiang, 2013), presentar dos tipos de respuesta: celular y humoral, actuando en conjunto para eliminar agentes patogenos (Rendon & Balcazar, 2003). Este sistema inmune sin capacidad de memoria, esta mediado por los hemocitos que poseen capacidad citotoxica y comunicacion intercelular que le facilita las funciones de: reconocimiento, coagulacion, fagocitosis, melanizacion, formacion de nodulos y encapsulacion, asi mismo, los camarones cuentan tambien con la presencia de varios componentes plasmaticos, como un sistema profenoloxidasa y la cascada de coagulacion que favorece la destruccion de agentes patogenos (Vargas-Albores et al., 1998; Yeh et al., 2009; Campa-Cordova et al., 2010; Fagutao et al., 2011). Actualmente, el interes en la prevencion de enfermedades a traves de la inmunoestimulacion ha aumentado para hacer frente a los problemas virales, ya que los compuestos inmunoestimulantes alertan al sistema inmune innato de los organismos provocando una respuesta (Rendon & Balcazar, 2003). La ventaja de los inmunoestimulantes radica en que no generan resistencias ni habituacion (Berger, 2000), por lo que no retardan el crecimiento y pueden usarse en forma continua, facilitando su dosificacion en las dietas.

En crustaceos, los carotenoides actuan como antioxidantes y precursores de la vitamina A, ademas, incrementan la resistencia a enfermedades, mejoran su tasa de reproduccion y aumentan la ganancia de peso (Tapia-Salazar et al., 2008). Dentro de los carotenoides, los P-carotenos son los de mayor importancia, por encontrarse en mayor cantidad y son utilizados en la acuacultura como pigmentos, antioxidantes y fuente de vitamina A (Pisal & Lele, 2005; Del Campo et al., 2007). Los [beta]-carotenos son acumulados y almacenados dentro de los cloroplastos en Dunaliella sp. cuando es cultivada con deficiencia de nitrogeno y es el pigmento responsable de su coloracion (Oren, 2005; Fimbres-Olivarria, 2011). El uso de P-carotenos en la dieta incrementan la resistencia del camaron blanco

Litopenaus vannamei (Boone, 1931) a infecciones experimentales con WSSV (Medina-Felix et al. 2014), Ademas, la adicion de carotenos a la dieta mejora los parametros de produccion y la pigmentacion de L. vannamei y de camaron azul Litopenaeus stylirostris (Stimpson, 1874) (Martinez-Cordova et al., 2002). Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue evaluar la respuesta del sistema inmune de Litopenaeus vannamei alimentado con dietas ricas en Dunaliella sp. con altas concentraciones de [beta]-caroteno frente a una infeccion con el Virus de Mancha Blanca.

MATERIALES Y METODOS

Dunaliella sp. se obtuvo del cepario del Departamento de Investigaciones Cientificas y Tecnologicas de la Universidad de Sonora, donde se utilizo el medio F/8 para su cultivo (medio basado en el medio F/2 de Guillard & Ryther, 1962); que contiene una reduccion en la cantidad de nitratos de 75%. Dunaliella sp. crecio en un sistema escalonado, empezando con tubo de ensayo de 10 mL, pasando a matraz de 250 mL, posteriormente a matraz de 1 L y finalmente a recipientes de 20 L. Una vez obtenida la concentracion celular por mililitro maxima se cosecho el cultivo para su floculacion con 0,15 g [L.sup.-1] de sulfato de aluminio, obtenido el concentrado de Dunaliella sp. se ultracongelo a -80[degrees]C para su liofilizacion con el Telstar LyoQuest[R] y obtener la harina de Dunaliella sp.

Para conocer la concentracion de P-carotenos en Dunaliella sp. se pesaron 0,03 g de harina y se anadieron 10 mL de acetona al 90%. Esta mezcla se mantuvo por 24 h en la oscuridad para medirla por espectrofotometria a 453 nm (CARY 100 BIO[R] espectrofotometro UV-visible), utilizando una curva de P-caroteno como estandar (5,3 mg de [beta]-caroteno en 25 mL). Con este procedimiento se ajusto una concentracion de 0,42 mg [mL.sup.-1] de P-caroteno en la microalga. La dieta control y las dietas con el 1 y 2% de Dunaliella sp. se elaboraron con los ingredientes indicados en la Tabla 1. Estos nutrimentos se mezclaron y pasaron en un extrusor de alimento (Torrey[R], modelo JR), pasando por la criba Torrey[R] CI-12-1/8 para hacer el pellet, despues se seco en el horno a 45[degrees]C por 24 h.

Diseno experimental

Se utilizaron juveniles de Litopenaeus vannamei con un peso promedio de 6 g provenientes de la granja acuicola Ojai, ubicada en Bahia de Kino, Sonora, Mexico (27[degrees]53'59.58"N, 110[degrees]37'3.67"W). Se evaluaron los siguientes tratamientos incluidos en el alimento: a) 1% de biomasa de Dunaliella sp. (T1), b) 2% de Dunaliella sp. (T2), c) control (camarones sin alimentacion con Dunaliella sp. infectados con WSSV), d) blanco (camarones sin alimentacions con Dunaliella sp. y sin infeccion con WSSV), cada uno de los tratamientos fue realizado por triplicado, usando acuarios de 40 L con 20 L de agua de mar (salinidad de 35) donde se colocaron 2 camarones/L, con temperatura controlada de 28-29[degrees]C., aireacion continua y recambio del 60% de agua cada tres dia. Los organismos se alimentaron con las dietas experimentales con base al 5% de su biomasa con dos raciones diarias durante 30 dias previos a la infeccion con WSSV. Los organismos se infectaron por alimentacion forzada utilizando una jeringa para insulina de 27 G x 37 mm y una sonda de venoclisis de 22 G x 32 mm se administraron 100 [micro]L de inoculo de WSSV. Las muestras de hemolinfa se recolectaron del quinto par de pereiopodos con una jeringa para insulina (27 G x 37 mm) a las 0, 24, 48, 72, 120 y 144 h post-infeccion (hpi).

Para confirmar la ausencia del virus previo a la infeccion de L. vannamei, se efectuo un analisis por qPCR, utilizando la sondaVP28 del virus WSSV, segun Moser et al. (2012), mediante el kit iQ[TM] SYBER[R] GREEN Supermix y el par de primers VP28F. 5'-CTGCTGTGATTGCTGTATTT y VP28R 5'-CAGT GCCAGAGTAGGTGAC. Las condiciones de amplificacion y deteccion del gen de WSSV (Medina-Felix et al., 2014).

El inoculo obtenido de camarones infectados con WSSV, tomando porciones de musculo y macerando en solucion salina a una relacion 1:6, el macerado se centrifugo a 9000 G/5 min y el sobrenadante se filtro con una membrana de 0,2 micras y se almaceno a-80[degrees]C.

Determinacion de actividad del sistema inmune Lisozima

Se colocaron 50 [micro]L de hemolinfa en una microplaca y se agregaron 150 [micro]L de suspension de Micrococcus sp. (Sigma, 5 mg [mL.sup.-1] en solucion de fosfatos 0,05 M, pH 7,0) leyendo a una absorbancia de 405 nm (Abs. de muestra a 1h). Se incubo por 1 hora a 37[degrees]C y se leyo nuevamente (Abs. de muestra a 0 h). Calculos: Abs. muestra 1 h-Abs. muestra 0 h = lisis.

Aglutinacion de hemocitos de camaron

Se utilizaron 25 [micro]L de suspension de eritrocitos humanos al 2% fueron colocados en ocho pozos de una microplaca, anadiendo 25 [micro]L de plasma de camaron. En el pozo numero 1, se mezclo y se tomaron 25 [micro]L de la mezcla para pasarse al pozo 2, donde se mezclo y repitio para el pozo 3 hasta llegar al pozo 7. En el pozo 8 se agregaron 25 [micro]L de solucion salina esteril (0,85%) como blanco, se incubo por 1 h y se leyo aglutinacion segun dilucion. La aglutinacion de hemocitos de camaron se midio en concentracion de aglutinina/mg [mL.sup.-1] de proteina.

Actividad de a-2-macroglobulina (A2M)

Se colocaron 10 [micro]L de hemocitos en una microplaca y 10 [micro]L de solucion de tripsina (1 mg [mL.sup.-1]) incubando por 10 min a 37[degrees]C, luego se agregaron 120 [micro]L de inhibidor de tripsina (2 mg [mL.sup.-1]) y se incubo la mezcla por 10 min a 37[degrees]C. Posteriormente, se adicionaron 100 [micro]L del sustrato BAPNA (Aa-benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride) (1 mg [mL.sup.-1]) para volver a incubar por 1 h y leer absorbancia a 415 nm. La actividad especifica de A2M fue calculada aplicando la siguiente formula:

* A- 2- M = absorbancia x factor de dilucion/tiempo de incubacion.

* Factor de dilucion = (Abs. muestra/Abs. estandar) x concentracion estandar

Actividad especifica de fenoloxidasa (FO)

Se colocaron 10 [micro]L de plasma de camaron en una microplaca y 250 [micro]L de L-DOPA (3 mg [mL.sup.-1]), se incubo la mezcla por 20 min para leer a 490 nm. Los valores de absorbancia obtenidos se normalizan con los valores de proteina.

Actividad especifica de profenoloxidasa (PFO)

Se agrego 10 [micro]L de plasma de camaron en una microplaca mas 10 [micro]L de tripsina y 250 [micro]L de L-DOPA (3 mg [mL.sup.-1]), se dejaron incubar por 20 min y se leyo la absorbancia a 490 nm. Los valores obtenidos se normalizaron con los valores de proteina. Para la medicion de proteina se centrifugo la hemolinfa a 9000 G/5 min y se separo el plasma. Se coloco 10 [micro]L de plasma en una microplaca mas 250 [micro]L de reactivo Randox[R] para proteina y se leyo a 550 nm en el lector Synergy (Bio-Tek Instruments) (Sanchez-Paz et al., 2007).

Analisis estadistico

Se realizo un analisis de ANOVA de dos vias y pruebas de Tukey para la actividad del sistema inmune, los resultados de la actividad del sistema inmune fueron normalizados con los resultados de proteina.

RESULTADOS

Supervivencia

La supervivencia mayor se encontro en la dieta con 1% de Dunaliella sp., seguida de la dieta con 2%, ambas sobre el 80%; mientras que el tratamiento control (infectado) presento un 56% de supervivencia. No se registro mortalidad en el tratamiento blanco (sin infeccion) (Tabla 2).

Actividad de lisozima

Al comparar entre tratamientos no se encontraron diferencias significativas (Tabla 3). Sin embargo, se observo que los camarones alimentados con 1% de Dunaliella sp. (T1), incrementaron significativamente la actividad de lisozima en el plasma a las 24 y 72 hpi (horas post-infeccion) (Fig. 1a). En el control se observo una mayor actividad de lisozima. Algunas variaciones se encontraron a traves del tiempo post-infeccion (Fig. 1), observandose que los niveles se mantuvieron fluctuantes y despues de 120 hpi no se encontro actividad de lisozima.

Aglutinacion de hemocitos de camaron

Entre tratamientos no se encontraron diferencias estadisticas significativas (P > 0,05) con relacion a la aglutinacion de hemocitos, observandose aglutinaciones ligeramente mayores en el tratamiento con 1% de Dunaliella sp. (Tabla 3). En la figura 1b se muestra la actividad de aglutinina, registrandose tres incrementos a 0, 24 y 144 hpi en los camarones alimentados previamente con 1% de Dunaliella sp. contenida en el alimento. Los camarones alimentados con 2% de Dunaliella sp. incrementaron su actividad aglutinante a 0, 24 y 48 hpi con respecto a los demas tratamientos, mientras que el control registro un incremento a las 0 y 48 hpi respecto al blanco.

Actividad especifica de [alpha]-2-macroglobulina (A2M)

En la actividad de A2M (Fig. 1c) se observo un incremento a las 24 hpi en el tratamiento con 2% Dunaliella sp. comparado con los demas tratamientos. A las 72 h se registro un incremento de actividad A2M en los camarones alimentados con 1% de Dunaliella sp. y a las 120 hpi en los camarones alimentados con 2% Dunaliella sp., mientras que a las 144 h se registraron valores basales en todos los tratamientos. Se observo para todos los tratamientos, a excepcion del blanco a las 24 hpi, que el valor de A2M aumento hasta siete veces con relacion al valor inicial (antes de la infeccion).

Actividad especifica de fenoloxidasa (FO)

La actividad fenoloxidasa se incremento significati-vamente en juveniles alimentados con 2% Dunaliella sp. a las 24 y 48 hpi respecto al blanco, alcanzando valores basales a las 144 hpi. los camarones alimentados con 1% registraron un ligero incremento en la actividad de FO a las 72 hpi. Despues de una disminucion registrada en el control a las 0 h, se observaron dos incrementos en la actividad enzimatica a las 24 y 72 hpi (Fig. 1d).

Actividad especifica de profenoloxidasa (PFO)

En la actividad especifica de profenoloxidasa, se observo un incremento a las 120 hpi en los camarones alimentados con la dieta al 2% de Dunaliella sp. y control con respecto al blanco. Asi mismo, los camarones del grupo control (infectado) presentaron valores elevados comparados con los otros tratamientos a 24, 48 y 120 hpi (Fig. 1e).

DISCUSION

Es evidente que la administracion de una dieta rica en carotenoides tiene un efecto protector en los camarones con una mejora en el crecimiento, reduccion en la tasa de mortalidad y mejor rendimiento, por lo tanto la administracion de carotenoides es esencial para el bienestar del cultivo (Arredondo-Figueroa et al., 2013). En estudios realizados por Medina-Felix et al. (2014) se encontro que cuando se aplica una dieta rica en antioxidantes se obtiene una respuesta favorable por parte del camaron blanco aumentando su supervivencia en un 80%.

La lisozima en los crustaceos es un componente fundamental para el sistema inmune, ya que actua en la respuesta de defensa contra una amplia variedad de patogenos (De la Re-Vega et al., 2004). Aunque no se encontraron diferencias significativas entre tratamientos, se observaron fluctuaciones constantes en la actividad de lisozimas a lo largo de la infeccion con WSSV, Mai & Wang (2010) realizaron un estudio para determinar la accion de las lisozimas en el sistema inmune innato de L. stylirostris y encontraron que cuando se inyecta intramuscularmente 8 [micro]g de lisozim a camarones e infectados con WSSV, aumenta la supervivencia al virus del 70 al 80%.

La aglutinina conocida como LPSBP (LPS Binding Protein), es una proteina cuya importancia radica en su capacidad de aglutinar bacterias y unirse a los hemocitos para estimular la fagocitosis, asi mismo, de lisar a los hemocitos activando el sistema profenoloxidasa y de coagulacion (Vargas et al., 1996; Rendon & Balcazar, 2003). Sritunyalucksana et al. (1999), infectaron hemocitos de Penaeus monodon (Fabricius, 1798) con YHV (virus de cabeza amarilla) y detectaron una disminucion de la actividad de aglutinacion en los hemocitos durante de la infeccion, siendo concordante con lo encontrado en este trabajo.

La A2M funciona como inhibidor de proteasas, al actuar como opsonina para marcar y unirse a las proteasas, formando un complejo llamado [alpha]-2-macroglobulina -proteasa, de tal manera que permite su endocitosis y degradacion proteolitica (Armstrong, 2010; Figueroa-Pizano, 2013). Estas proteasas, participan en el sistema profenoloxidasa, que ayuda a regular la produccion de especies reactivas de oxigeno que se generan por la oxidacion de fenoles. Por lo tanto, cuando la A2M disminuye, produce un desbalance en el sistema profenoloxidasa, provocando una produccion excesiva de radicales libres. Estas caracteristicas permiten a la A2M jugar un papel importante en la defensa inmune de los camarones, ya que es una proteina capaz de unirse y neutralizar diversas gamas de proteasas que funcionan como factores de virulencia (Armstrong, 2010). Ademas, juega un papel esencial en el sistema profenoloxidasa, ya que al ser activada a su forma fenoloxidasa por la serina proteasa, la A2M y los inhibidores de tripsina que se encuentran fuera de los hemocitos en el plasma, eliminan a la serina activando el sistema profeno-loxidasa (Sung et al., 1998). Figueroa-Pizano (2013) reporto para el camaron blanco infectado con BNHP (Bacteria de la necrosis hepatopancreatica) una disminucion en los valores de A2M conforme avanzo la infeccion, lo cual fue similar a lo encontrado en esta investigacion.

La FO se encuentra inactiva en el interior de los granulos de los hemocitos en forma de profenoloxidasa (PFO) y es liberada en presencia de un antigeno para ser activada con la ayuda de calcio (Figueroa-Pizano, 2013), siendo esta la enzima terminal del sistema profenoloxidasa (Sung et al., 1998; Sarathi et al., 2007), sin embargo, el mecanismo de activacion del sistema PFO se desconoce (Sarathi et al., 2007). Subashini et al. (2012) evaluaron la eficiencia de una bacteria del genero Vibrio como inmunoestimulante en Marsupenaeus japonicus (Bate, 1888) en contra de WSSV y encontraron mayor actividad de PFO en los tratamientos con bacteria que en los tratamientos control, lo que indico la accion de la PFO en presencia del virus. Sarathi et al. (2007) observaron en las primeras 48 hpi. un aumento en la actividad de PFO en Fenneropenaeus indicus (Milne-Edwards, 1837) infectados con WSSV, comparados con el grupo control a las 72 hpi. En este trabajo el aumento en la PFO podria atribuirse a la estimulacion de los carotenos provistos por las dietas.

La FO es la enzima mas importante y reconocida del proceso de melanizacion que se da en los camarones como un sistema de defensa. Figueroa-Pizano (2013) encontro que organismos infectados con BNHP tienen menor actividad que el control negativo, pero en los dias despues de la infeccion empieza a disminuir. La FO produce hidroxilacion de fenoles y oxidacion de o-fenoles a quinonas, necesarios para la melanizacion (Andrade, 2011). Sarathi et al. (2007) encontraron estimulacion del sistema inmune generado por Vibrio alginolyticus (Miyamoto et al., 1961) lo que provoco un aumento en la actividad de FO. Niveles elevados de FO surgen como un ineficiente mecanismo de compensacion por mantener la resistencia a la infeccion, esta podria ser la razon por la cual aumento la concentracion de FO en el presente trabajo.

CONCLUSIONES

La inclusion de Dunaliella sp. a la dieta de L vannamei tiene un efecto positivo en la supervivencia, con un 83% en los camarones alimentados durante 30 dias con 1% de microalga, 81% en los juveniles alimentados con 2% y el grupo control (no tratado e infectado) con el 56%. La actividad del sistema inmune de L. vannamei se activo por la inclusion de dos concentraciones de Dunaliella sp. en el alimento de camarones, obteniendo incrementos significativos previo a la infeccion en la actividad enzimatica de lisozima, aglutinina y fenoloxidasa. Durante la infeccion, se incremento significativamente respecto al grupo blanco (no tratado ni infectado), la actividad de lisozima, aglutinina, [alpha]-2-macroglobulina y fenoloxidasa en los camarones alimentados con 1% de la microalga. Los juveniles alimentados con 2% de Dunaliella sp. registraron incrementos significativos respecto al grupo control en la actividad de lisozima, aglutinina, fenoloxidasa y profenoloxidasa. El presente estudio mostro que la inclusion del Dunaliella sp. en el alimento al 1 o 2%, mejoro la respuesta del sistema inmune y la resistencia a infecciones experimentales con WSSV en juveniles de camaron blanco.

DOI:10.3856/vol44-issue2-fulltext-11

Received: 2 December 2014; Accepted: 15 January 2016

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Jose Antonio Lopez-Elias (1), Diana Medina-Felix (2), Angel Isidro Campa-Cordova (2) Luis Rafael Martinez-Cordova (1), Jorge Hernandez-Lopez (3) Jose Fernando Mendoza-Cano (3) & Martha Elisa Rivas-Vega (4)

(1) Universidad de Sonora, Hermosillo, Sonora, Mexico

(2) CIBNOR, La Paz, Baja California, Mexico

(3) CIBNOR, Hermosillo, Sonora, Mexico

(4) Universidad Estatal de Sonora, Unidad Academica Navojoa, Hermosillo, Mexico

Corresponding author: Diana Medina-Felix (dfelix@[micro]g.cibnor.mx)

Corresponding editor: Erich Rudolph

Caption: Figura 1. Comportamiento de la respuesta inmune en Litopenaeus vannamei por dia y por tratamiento. a) Lisozimas, b) aglutinina, c) [alpha]-2-macroglobulina (A2M), d) fenoloxidasa (FO), e) profenoloxidasa (PFO). HPI: Horas post-infeccion.
Tabla 1. Ingredientes del alimento utilizado en los
experimentos en g [kg.sup.-1] (Medina-Felix et al., 2014).

Ingrediente                 Control     1%      2%

Harina integral de trigo      423      423     423
Pasta de soya                 199      194     189
Harina de sardina             260      255     250
Harina de microalga            0        10      20
Aceite de pescado             40        40      40
Lecitina de soya              15        15      15
Alginato de sodio             20        20      20
Premezcla de vitaminas        18        18      18
Fosfato bibasico de sodio     12        12      12
Colesterol                     5        5       5
Premezcla de minerales         5        5       5
Cloruro de colina 62%          2        2       2
Vitamina C 35%                0,9      0,9     0,9
BHT (Butilhidroxitolueno)    0,04      0,04    0,04

Tabla 2. Porcentaje de sobrevivencia en los diferentes tratamientos.
hpi: horas post-infeccion.

Tratamiento                       Sobrevivencia (%) 144 hpi

Blanco (sin infeccion)                       100
Control (infectado)                          56
Dieta con 1% de Dunaliella sp.               83
Dieta con 2% de Dunaliella sp.               81

Tabla 3. Actividad especifica y desviacion estandar de componentes
del sistema inmune en Litopenaeus vannamei en los tratamientos y
control.

Tratamiento     Aglutinina       Fenoloxidasa     Profenoloxidasa

Blanco        [0,00365.sup.A]   [0,00074.sup.A]   [0,09687.sup.A]
                 (0,00132)         (0,00019)         (0,01765)
Control       [0,00391.sup.A]   [0,00071.sup.A]   [0,06592.sup.A]
                 (0,00097)         (0,00014)         (0,01458)
1%            [0,00534.sup.A]   [0,00086.sup.A]   [0,07209.sup.A]
                 (0,00081)         (0,00011)         (0,01338)
2%            [0,00487.sup.A]   [0,00096.sup.A]   [0,08350.sup.A]
                 (0,00077)         (0,00011)         (0,01359)

Tratamiento      Tripsina         [alpha]-2-         Lisozimas
                                Macroglobulina

Blanco        [0,00638.sup.A]   [0,00444.sup.A]   [0,00079.sup.A]
                 (0,00138)         (0,00102)         (0,00027)
Control       [0,00792.sup.A]   [0,00554.sup.A]   [0,00140.sup.A]
                 (0,00101)         (0,00074)         (0,00021)
1%            [0,00744.sup.A    [0,00527.sup.A]   [0,00125.sup.A]
                 (0,00084)         (0,00061)         (0,00022)
2%            [0,00974.sup.A]   [0,00723.sup.A]   [0,00077.sup.A]
                 (0,00080)         (0,00059)         (0,00023)
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Title Annotation:Research Article
Author:Lopez-Elias, Jose Antonio; Medina-Felix, Diana; Campa-Cordova, Angel Isidro; Martinez-Cordova, Luis
Publication:Latin American Journal of Aquatic Research
Article Type:Ensayo
Date:May 1, 2016
Words:4855
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