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Implementacion y estandarizacion de un metodo para la determinacion de carnitina en plasma como herramienta diagnostica de enfermedades hereditarias.

Implementation and standarization of a method for carnitine quantitation in plasma as a diagnostic tool of inherited diseases

Introduccion

El campo de los errores innatos del metabolismo (EIM) crece permanentemente como resultado de muchos reportes relacionados con alteraciones en diferentes vias metabolicas, ayudando el avance en investigacion y tecnologia desarrollados en esta area.

Los errores innatos del metabolismo usualmente son el resultado de defectos enzimaticos o de cofactores, la mayoria de los cuales son de caracter autosomico recesivo, dando como resultado, la acumulacion de metabolitos anormales, pudiendo ser estos detectables en los fluidos biologicos de los pacientes afectados.

El diagnostico diferencial de los EIM puede ser dificil, aun en presencia de la mas avanzada tecnologia en bioquimica genetica, cuyo objetivo es identificar la causa del EIM la cual podria ser temporal (adquirida) o permanente (hereditaria).

La determinacion de los niveles de acilcarnitinas por espectrometria secuencial de masas o en tandem (TMS), usando sangre seca en papel, para el diagnostico de los EIM de la degradacion de acidos grasos y las acidemias organicas, asi como el tamizaje selectivo para este tipo de desordenes ha sido descrito (1,2,3,4,5). La alteracion en la [beta]-oxidacion mitocondrial es seguida por una acumulacion de acilcarnitinas representativas del tipo de defecto enzimatico en esa via metabolica. Sin embargo, la produccion de estas acilcarnitinas depende de la disponibilidad de carnitina libre en la mitocondria, lo que conlleva a que posibles alteraciones en el perfil de acilcarnitinas no sean detectables, si la celula no cuenta con el aporte suficiente de carnitina.

Se hace necesario conocer la ocurrencia y distribucion de la carnitina libre y la acilcarnitinas en sangre como un indicador de condiciones metabolicas inusuales. Por lo tanto, el diagnostico y manejo de estas enfermedades metabolicas requiere el conocimiento de las concentraciones de estos compuestos.

El ensayo radioenzimatico (REA) (6) es conocido como el metodo estandar para la determinacion de carnitina. Este procedimiento determina la carnitina libre enzimaticamente, mediante su conversion a acetilcarnitina radiomarcada. La carnitina total es medida despues de realizar hidrolisis alcalina de las acilcarnitinas de la muestra, lo que conlleva a que solo quede carnitina en la misma, es decir, la carnitina total. La concentracion de acilcarnitinas es entonces calculada como la diferencia entre la carnitina total y la carnitina libre.

El presente trabajo muestra un metodo preciso y confiable para la determinacion de la carnitina libre y total en muestras de plasma seco en papel de filtro mediante ESI/MS/MS.

Materiales y metodos

Todos los reactivos utilizados fueron grado analitico. La L-carnitina fue obtenida de Sigma UK. El isotopo estable [sup.2][H.sub.3]-Carnitina fue adquirido de Cambridge isotope laboratories UK.

Metodos

Preparacion de tarjetas de papel de filtro para la determinacion de carnitina libre y total

Muestras de un adulto voluntario normal fueron obtenidas mediante venopuntura y centrifugadas (2300gx5min) para separar el plasma.

Un volumen de estandar interno de 20 [micron]l (300 [micron]mol/l [sup.2][H.sub.3]-Carnitina en 50% metanol: agua) fueron adicionados a 180 [micron]l de plasma. La solucion fue mezclada, y se dejo en reposo durante 15 min, para posteriormente dejar caer gotas de la misma sobre papel de filtro ((No. 903, 1.88 mm Schleicher & Schuell). Las muestras se dejaron secar a temperatura ambiente durante una hora.

Para la determinacion de la carnitina total 16 [micron]l de KOH 4 mol/l fueron adicionados a 100 [micron]l de la mezcla plasma-estandar interno, despues de mezclar y centrifugar, (3000g x 1min), las muestras fueron incubadas a 45[grados]C en un bano con agitacion durante 60 min para hidrolizar las acilcarnitinas. Despues de mezclar y centifugar por segunda vez, se dejaron caer gotas sobre papel de filtro y se repitio el proceso de secado.

Preparacion de plasma libre de carnitina endogena

Las muestras de plasma normal contienen carnitina endogena, la cual interfire en la preparacion de curvas estandar que comiencen desde un valor de 0 [micron]mol/l. Para obtenerlas se han dializado muestras de plasma.

Bolsas de membrana de dialisis conteniendo 1 ml de plasma fueron colocadas en solucion buffer fosfato isotonica (50 mM, pH 7.4) (250 ml PBS/1 ml muestra) durante 24 horas a 4[grados]C con agitacion suave. La solucion de PBS fue cambiada cada 6 horas.

Analisis de muestras de plasma mediante espectrometria secuencial de masas en bandejas de 96 pozos (microtitre plates)

Las manchas de plasma fueron recortadas del papel de filtro en circulos (6.35 mm o 0.25 pulgadas de diametro para cada uno, que corresponden a 12 [micron]l de plasma) y se deposito un circulo en cada pozo. A cada uno fue adicionado metanol puro (500 [micron]l). Las bandejas fueron colocadas en agitador orbital (750 rpm) durante 30 min y luego sonicadas durante 15 min. Posteriormente fueron agitadas nuevamente durante dos horas. Se sonicaron por 30 min y el papel de filtro fue removido de cada pozo. El sobrenadante resultante fue evaporado bajo gas nitrogeno a 45[grados]C hasta secarse y 50 [micron]l de HCl butanolico 1 mol/l fueron adicionados a cada muestra (cada pozo) e incubados a 60[grados]C durante 15 min (derivatizacion). Las muestras fueron evaporadas inmediatamente bajo nitrogeno y redisueltas en 100| l (cada una) de acetonitrilo al 70% en agua para ser inyectadas al espectrometro de masas. El estandar interno fue usado para la cuantificacion de L-carnitina al analizar la relacion entre las senales.

Analisis de muestras de plasma por espectrometria secuencial de masas

Todos los analisis fueron realizados en un equipo Quattro II, triple quadrupole tandem mass spectrometer (Micromass UK), equipado con una fuente de ionizacion en espray (ESI), y un sistema de analisis datos micro mass MassLynx. La introduccion de las muestras a la fuente se hizo mediante el dispositivo automatico Jasco AS980 acoplado a una bomba Jasco PU980 HPLC.

Los butilesteres de carnitina pasan el analizador 1, chocan con nitrogeno (se fragmentan), y uno de los fragmentos caracteristicos (m/z = 103), pasa al analizador 2 el cual es programado para detectar m/z = 103. Este es registrado por el detector mientras el m/z que ha pasado el analizador 1 es grabado.

Analisis estadistico

La prueba t-student fue usada para buscar diferencias estadisticas, y para buscar la similitud entre los dos metodos finales de medicion clinica comparados, una prueba de Bland-Altman fue utilizada 7.

Linearidad para concentraciones ascendentes de carnitina libre y analisis de la funcion de scan para medir carnitina libre y total

Para evaluar la linearidad de la intensidad del ion con relacion a la concentracion de carnitina, muestras de plasma dializadas durante de 24 horas fueron enriquecidas con L-carnitina a concentraciones de 5, 10, 20, 40, 60, 80, y 100 [micron]mol/l, preparando luego tarjetas en papel de filtro, y haciendo la extraccion y analisis como se indico anteriormente, utilizando un programa para analisis de los iones precursores de m/z 85 y m/z 103 derivatizando y sin derivatizar.

Resultados

Los valores del coeficiente de relacion de las curvas estandar de 0 a 100 [micron]mol/l de carnitina libre usando dos funciones de scan con y sin derivatizacion fueron todos cercanos a un valor de 1 y la mejor correlacion observada fue para m/z 85 en muestras derivatizadas. Para analizar una posible diferencia entre ellas, los resultados de esta funcion fueron comparados con las otras utilizadas mediante la prueba t-student. No se encontro diferencia significativa entre ellas.

Eleccion de una funcion de scan para medir carnitina libre y total

La precision de la medida de carnitina libre fue evaluada mediante el procesamiento de 95 muestras almacenadas y comparando sus valores con los establecidos mediante REA. Los especimenes fueron analizados con y sin derivatizacion usando dos funciones de scan (precursores de m/z 85 y m/z 103). Algunos cambios fueron detectados trabajando con estas muestras reales cuando se analizaron sin derivatizar. Fue dificil obtener un espectro claro debido al alto nivel de ruido quimico e interferencias de picos desconocidos (por ejemplo m/z 167). Esto se redujo considerablemente despues de derivatizar las muestras (figura 1). Cuando se compararon con los valores obtenidos por REA, se obtuvo un Pearson de 0.55 en muestras sin derivatizar y un valor de 0.89 en las derivatizadas. El analisis de las relaciones 218/promedio de ruido y 221/promedio de ruido fue realizado. El valor promedio mas alto fue obtenido usando precursores de m/z 103 con derivatizacion y el mas bajo, con precursores de m/z 85 sin derivatizar. Para ahondar en el analisis de la precision al medir carnitina libre y total mediante este nuevo metodo, 312 muestras de plasma recibidas para analisis de rutina fueron procesadas en paralelo para carnitina libre y total mediante REA y TMS (precursores de m/z 103 con derivatizacion). Los analisis de estos resultados mostraron una correlacion entre los dos metodos para carnitina libre y total de y = 0.96x + 0.45 and y = 0.95x - 0.69 respectivamente.

[FIGURA 1 OMITIR]

La distribucion de la media versus la diferencia de valores pareados (analisis de Bland-Altman) se muestra en las figuras 2 y 3 para carnitina libre y total respectivamente. Estos datos muestran una buena correlacion entre los dos metodos para carnitina libre y total con relacion a los rangos de concentracion estudiados.

Un ensayo intra-dia e interdia para el nuevo metodo fue practicado, usando una muestra de plasma con un valor de carnitina libre obtenido por REA de 41.8 [micron]mol/l y los datos se muestran en la tabla 1.

Discusion

La importancia de ESI/MS/MS para el diagnostico de los errores congenitos del metabolismo y sus utilidades en la confirmacion de errores diagnosticos, ha sido demostrada previamente 8. El presente trabajo fue realizado tratando de evaluar y mejorar la reproducibilidad, sensibilidad, y especificidad para medir carnitina en plasma mediante esta tecnica.

La literatura cientifica reporta diferentes metodos para medir L-carnitina, pero el ensayo radio-enzimatico ha sido considerado como el metodo estandar para tal fin. Previamente se describio un metodo para medir este parametro mediante FAB/MS/MS (9), pero fue encontrado limitado para su uso con muestras de plasma debido a problemas de calibracion del estandar interno, siendo recomendado para su uso con muestra de orina. Otros reportes usando ESI/MS/MS para la determinacion de carnitina libre y acilcarnitinas en plasma y suero han sido publicados. (10, 11)

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

Estos autores han usado diferentes metodos de extraccion, por ejemplo, una mezcla de metanol, agua, y 6mol/l HCl (400:100:0.5 v/v/v), en vez del metanol puro que usamos nosotros. Sin embargo, ellos han analizado las muestras de carnitina sin derivatizacion, utilizando el precursor m/z 85 en un rango de m/z 160-210, y haciendo la comparacion de su metodo con el metodo espectrofotometrico, basado en reacciones enzimaticas, obteniendo buena correlacion entre ellos.

Como puede apreciarse en nuestro caso, para la carnitina y su estandar interno, la derivatizacion incrementa sus masas moleculares relativas mediante la seleccion de un derivado que adiciona una masa considerable a las muestras, pero no a las impurezas, siendo removidos por lo tanto, de la region que contiene compuestos que interfieren con el analisis, lo que se manifiesta en un aumento en la especificidad del mismo. La comparacion que hacemos entre el ensayo radio-enzimatico y ESI/MS/MS utilizando la prueba de Bland-Altman hace enfasis en la busqueda de una posible diferencia significativa entre los metodos, en vez de analizar sus similitudes, ya que esto ultimo podria dar interpretaciones erroneas.

Para el metodo que desarrollamos, la diferencia no es significativa y la mayoria de los valores pueden ser encontrados dentro de limites aceptables para la prueba estadistica, mostrando un buen acuerdo entre estos dos metodos de medicion clinica.

Los resultados obtenidos por nosotros muestran una nueva tecnica, efectiva para la medicion de carnitina libre y total en plasma, como una buena alternativa para reemplazar una tecnica tradicional que consume mucho tiempo y materiales de laboratorio, y por lo tanto puede ser valiosa en el diagnostico de alteraciones en el ciclo de la carnitina, en especial en el caso de las alteraciones de la B-oxidacion mitocondrial de los acidos grasos.

Literatura citada

(1.) MILLINGTON DS, KODO N, NORWOOD DL, ROE CR. Tandem Mass Spectrometry: A New Method for Acylcarnitine Profiling with Potential for Neonatal Screening for Inborn Errors of Metabolism. J Inher Metab Dis. 1990; 13:321-324.

(2.) VAN HOVE JL, ZHANG W, KAHLER SG, ROE CR, CHEN YT, TERADA N, CHACE DH, IAFOLLA AK, DING JH, MILLINGTON DS. Medium chain acyl CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency: diagnosis by acylcarnitine analysis in Blood. Am J Hum Gen. 1993;52;5:958-966.

(3.) RASHED MS, OZAND PT, BENNET MJ, BARNARD JJ, GOVINDARAZA DR, RINALDO P. Inborn errors of metabolism diagnosed in sudden death cases by acylcarnitine analysis of postmorten bile. Clinical Chemistry, 1995;4:1109-1114.

(4.) RASHED MS, BUCKNALL MP, LITTLE D. Screening blood spots for inborn errors of metabolism by electrospray tandem mass spectrometry with a microplate batch process and a computer algorithm for automated flagging of abnormal profiles. Clin Chem. 1997;43:1129-1141.

(5.) CHACE H, HILLMAN SL, VANHOVE JLK & NAYLOR EW. Rapid diagnosis of MCAD deficiency: Quantitative analysis of octanoilcarnitine and other acylcarnitine in newborn blood spots by tamdem mass spectrometry. Clin Chem. 1997;43:2106-2113

(6.) CEDERBLAND G, LINDSTEDT S. A method for the determination of carnitine in the picomole range. Clin Chem Acta, 1972;37:235-243.

(7.) BLAND JM, ALTMAN DG. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet. 1986;I:307-310.

(8.) OSORIO-OROZCO JH & POURFARZAM M. Diagnostic error of mental retardation of neurometabolic origin confirmed by mass sequential spectrometry. Rev Neurol. 2000; 30:728-730.

(9.) KODO N, MILLINGTON DS, NORWOOD DL, ROE CR. Quantative assay of free and total carnitine u sin g tandem mass spectrometry. Clin Chim Acta.1989;186:383-390.

(10.) VREKEN P, VAN LINT AEM, BOOTSMA AH, OVERMARS H, WANDERS RJA, VAN GENNIP AH. Quantitative plasma acylcarnitine analysis using electrospray tandem mass spectrometry for the diagnosis of organic acidaemias and fatty acid oxidation defects. J Inher Metab Dis,. 1999; 22:302-306.

(11.) STEVENS RD, HILLMAN SL, WORTHY S, SANDERS D, MILLINGTON DS. Assay for free and total carnitine in human plasma using tandem mass spectrometry. Clin Chem. 2000; 46:727-729.

JOSE HENRY OSONO, Universidad de Caldas, Laboratorio de Patologia Molecular. Departamento de Ciencias Basicas de la Salud, Manizales, Colombia.

MORTEZA POURFARZAM, Spence Biochemical Genetics Unit, Royal Victoria Infirmary. Newcastle upon Tyne. England.

Correspondencia: Universidad de Caldas, Departamento de Ciencias Basicas de la Salud. Calle 65 No. 26-10. Manizales.

e.mail: jose.osorio_o@ucaldas.edu.co

Remitido para publicacion: 15-04-2008. Aprobado para publicacion: 15-06-2008
Tabla 1. Medidas de carnitina libre usando ESI/MS/MS.
Ensayo intradia e Interdias (umol/l)

Ensayo                  Min   Max    Promedio   SD    CV

Intradia
(n = 20)                40    44.4   43.1       1.0   2.3
Interdias (entredias)
(n = 20)                41    45     44         1.9   4.3

Abreviaturas: SD, desviacion estandar; CV, coeficiente
de variacion.
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Title Annotation:Articulo de Investigacion
Author:Osorio, Jose Henry; Pourfarzam, Morteza
Publication:Archivos de Medicina
Date:Dec 1, 2008
Words:2714
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