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Immunolocalization of Sonic Hedgehog in Embryo-Fetal Mouse (Mus musculus) Development/ Inmunolocalizacion de Sonic Hedgehog en el Desarrollo Embrio-Fetal de Ratones (Mus musculus).

INTRODUCCION

Durante el desarrollo embrionario ocurren una serie de procesos fundamentales para la formacion de estructuras ordenadas, reguladas por morfogenos. Estas son moleculas organicas producidas y secretadas por un grupo de celulas embrionarias, las cuales son capaces de difundir y actuar sobre otras celulas o tejidos a distancia al unirse a receptores de membrana, gatillando respuestas celulares dependientes de la concentracion del morfogeno (Rojas et al., 2014). Con ello, diferentes celulas que se ubican a distintas distancias del centro morfogenetico inductor responderan heterogeneamente, con lo cual las celulas adquieren la informacion positional precisa (Briscoe & Small, 2015).

Se describen dos procesos para la formacion del gradiente de concentracion morfogenetico. Por un lado, el morfogeno es producido por una fuente localizada y es capaz de difundir celula a celula por medio de difusion simple, endocitosis o proteoglicanos, disminuyendo su concentracion a medida que se aleja de su centro inductor (Rojas et al.). Otra opcion es que el morfogeno presente una concentracion uniforme, la cual es contrarrestada por un inhibidor producido en otro centro inductor capaz de inhibir la union del morfogeno a su receptor celular de forma proporcional a su concentracion (Zagorski et al., 2017).

Dentro de las familias de proteinas que pueden actuar como morfogenos, se encuentra la familia Hedgehog (Hh), compuesta de tres proteinas: Indian Hedgehog (Ihh), Desert hedgehog (Dhh) y Sonic hedgehog (Shh) (hadden, 2014). Esta ultima es un proteina con una region N-terminal altamente conservada y una C-terminal mas variable. En la superficie de la celula blanco se une al receptor Patched (Ptch), el cual corresponde a una proteina de 12 dominios transmembrana. Este tiene una directa relacion con la proteina transmembrana Smoothened (Smo), receptor de 7 dominios transmembrana. Ptch es capaz de inhibir la actividad de senalizacion de Smo. Sin embargo, cuando Shh se une a Ptch, se interrumpe esta inhibicion, permitiendo que la via de senalizacion intracelular active proteinas Gli capaces de actuar como factores de transcripcion, translocar al nucleo celular y estimular la transcripcion de genes diana a Shh (Ngan et al., 2013; Wu et al., 2017).

Como morfogeno, Shh tiene un rol central en el desarrollo de diversas estructuras y organos durante el periodo embrionario, fetal y post-natal. Se ha demostrado que actua como molecula senalizadora en multiples estructuras embrionarias, como en la notocorda y placa del piso del tubo neural, regulando la formacion del sistema nervioso central y formacion de ejes corporales (Meyers & Martin, 1999; Cohen et al., 2013); diferenciacion del mesodermo paraxial (Murashima et al., 2014; Kremnyov et al., 2018); diferenciacion del epitelio de revestimiento respiratorio e intestinal (van den Brink, 2007; Kugler et al., 2015); crecimiento de los procesos palatinos en el desarrollo de la cavidad oral y zona de actividad polarizante durante el desarrollo de miembros (Cobourne & Green, 2012; Tickle & Barker, 2013); esbozos de foliculos pilosos (Athar et al., 2006); crecimiento del tuberculo genital (Miyagawa et al., 2011); desarrollo del patron arquitectonico celular de la retina (Furimsky & Wallace, 2006); entre otros.

Para el normal desarrollo de estas estructuras, es necesario que se exprese en diferentes etapas de la ontogenia, como tambien en distintos grupos celulares. Es por ello que el objetivo del estudio fue determinar la inmunolocalizacion de Shh en las etapas embrionarias y fetales en ratones Mus musculus BALB/c.

MATERIAL Y METODO

Se utilizaron 10 ratones hembras jovenes (Mus musculus) BALB/c, las que se dividieron en 2 grupos de 5 gestantes cada uno (grupos 1 y 2). Estas se colocaron en jaulas con machos reproductivamente sanos y jovenes. A las 12 h se verifico la presencia de tapon mucoso a nivel vaginal, lo que significa que hubo copula, considerandose como el dia post-coital (dpc) 0,5.

A los 12,5 dpc, 5 ratones gestantes se anestesiaron y eutanasiaron con solucion de eutanasia xilacina en dosis 1,1 a 2,2 mg/kg y ketamina en dosis de 10 a 20 mg/kg, extrayendose los embriones, conformando el grupo donde se evidencia el termino del desarrollo embrionario (grupo embrionario). Posteriormente, con la misma metodica se eutanasiaron a los 17,5 dpc a las restantes, donde se obtuvieron los fetos correspondientes al grupo de desarrollo fetal (grupo fetal).

Se realizo tecnica inmunohistoquimica con anticuerpo policlonal anti-Shh (Santa Cruz Biotechnology, H-160, conejo). Los embriones y fetos fueron fijados en solucion formalina tamponada en PBS e incluidos en paraplast. Se obtuvieron cortes transversales de 5 pm en microtomo Leica (RM2255) en direccion cefalo-caudal, los cuales se adhirieron a portaobjetos con carga positiva (Citoglas). Fueron adheridos 4 cortes por portaobjeto. La recuperacion antigenica fue realizada en vaporera por 40 min, con los cortes sumergidos en solucion desenmascarante de antigenos (Vector Labs, H-3301). Se realizo bloqueo de peroxidasa endogena con peroxido de hidrogeno en metanol y bloqueo inespecifico de proteinas con PBS+BSA al 3 %. Para la incubacion con el anticuerpo primario antiShh se uso una dilucion 1:100 en PBS. Para la deteccion del anticuerpo primario se incubo con polimero conjugado con anticuerpo anti conejo y HRP durante 15 min (SuperPicture[TM], Thermo Fisher, 878963). Como sustrato para la HRP se uso diaminobencidina (DAB, Vector Labs, SK-4100) durante 1-2 min.

El control negativo estuvo dado por el desarrollo de la tecnica inmunohistoquimica completa, pero sin considerar la incubacion con el anticuerpo primario. Como control positivo se considero la notocorda.

Los cortes transversales seriados fueron fotografiados en un microscopio Leica (DM750) con camara digital HD Leica (ICC50 HD), analizados si resultaron marcados positivamente y fueron descritos morfologicamente.

RESULTADOS

A los 12,5 dpc, en muestras mas cefalicas se evidencio inmunotincion positiva a Shh en la formacion de la retina neural y en el desarrollo del nervio optico. A nivel de sistema nervioso central, la inmunoexpresion se observo en placa del piso del tubo neural y en notocorda. En cortes transversales a nivel toracico, este morfogeno se inmunolocalizo en epitelio de revestimiento esofagico, bronquios grandes y bronquios segmentarios. En el desarrollo de miembros superiores, la inmunotincion se observo en los primordios precartilaginosos de radio y ulna, no asi en humero. A nivel abdominal, se localizo en epitelios de revestimiento en estomago e intestino delgado. En muestras mas caudales, la positividad a Shh se observo en epitelio uretral y vejiga, como tambien en la condensacion precartilaginosa previo al desarrollo de femur (Fig. 1).

En el grupo de fetos de 17,5 dpc, fue posible observar la inmunotincion en las capas marginal y ganglionar de la retina. En cortes transversales a nivel toracico, se evidencio en epidermis como tambien en el desarrollo en los esbozos de los bulbos capilares. A nivel abdominal se observo en glandulas fundicas en el cuerpo estomacal y en el desarrollo de vellosidades intestinales a nivel duodenal (Fig. 2).

DISCUSION

Shh actua en diferentes periodos del desarrollo gestacional, siendo clave en la diferenciacion de diversas estructuras. Nuestros resultados indican que en la etapa embrionaria se inmunolocaliza en la formacion del sistema nervioso, desarrollo de las vias visuales, en la organogenesis relacionada con los epitelios de revestimiento a nivel respiratorio, esofagico, estomacal, intestinal y urinario, como tambien en el desarrollo de miembros, encontrandose la expresion de este morfogeno en estas areas. Sin embargo, en el periodo fetal su inmunoexpresion cambia a zonas de mayor especializacion y diferenciacion como en capas internas de la retina, desarrollo de foliculos pilosos, glandulas estomacales y vellosidades intestinales.

Durante el proceso de neurulacion, es necesaria la expresion de Shh. El mecanismo planteado es que la notocorda libera Shh, siendo capaz de estimular a las celulas de la placa neural a formar la placa del piso del tubo neural. Luego, estas celulas de la placa del piso elaboraran Shh, el cual potenciado por el elaborado en la notocorda, inducira a las celulas de la porcion ventral del tubo neural a diferenciarse en el linaje neuronal motor y glial, determinando seis dominios de patrones de expresion genica (Yu et al, 2013; Conei et al., 2016). A su vez, tambien posee un papel fundamental en el cierre del tubo neural (Patterson et al, 2009).

La inmunomarcacion de Shh en nervio optico y retina neural se debe a que esta proteina contribuye a la separacion del campo ocular y formar las vesiculas opticas de forma bilateral y simetricas, el cual es secretado por celulas de la placa neural (Furimsky & Wallace). Posteriormente, se encarga de controlar la proliferacion, diferenciacion y organizacion celular a nivel de retina y en el desarrollo axonal de las celulas nerviosas hasta el tectum optico, siendo su senalizacion contrastada por Wnt (Aviles et al., 2013).

En el caso del desarrollo de miembros y huesos, Shh es capaz de regular los patrones de diferenciacion y crecimiento en el proceso de osificacion endocondral, en el cual las celulas mesenquimales se condensan y se diferencian en condrocitos, los cuales forman centros de osificacion en donde estos son reemplazados por osteoblastos (Yang et al., 2015). En los inicios del desarrollo de los miembros, Shh se expresa en la zona de actividad polarizante, actuando como morfogeno estableciendo el eje anteroposterior (Tickle & Barker).

La inmunolocalizacion en el desarrollo del epitelio respiratorio, Shh comienza su expresion en los extremos de la yema respiratoria, teniendo un patron graduado a lo largo de las etapas pseudoglandular y canalicular, siendo mas bajo a lo largo de la yema respiratoria y mas elevado en extremos distales. En el periodo sacular, su expresion global va disminuyendo gradualmente hasta el nacimiento (Miller et al., 2001; Kugler et al.).

Durante el desarrollo del sistema digestivo, en etapas iniciales Shh se expresa en el endodermo del intestino anterior, para posteriormente expandirse hacia el endodermo ubicado a nivel de intestino posterior, tambien teniendo funciones en paralelo importantes para el establecimiento del eje derecha-izquierda. En el desarrollo esofagico, Shh se expresa a todo su largo y es vital en la formacion del tabique traqueoesofagico, el cual separa las vias respiratorias de la digestiva, induciendo a la capa mesodermica a su formacion (Ioannides et al., 2003). En el desarrollo del estomago, Shh se expresa en el epitelio gastrico en formacion hasta su porcion posterior, donde disminuye y predomina Ihh (van den Brink). En el desarrollo glandular se ha visto que juega un rol fundamental, ya que el crecimiento glandular se incrementa en ratones Shh -/-, lo que produce hiperplasia de la mucosa del estomago glandular, siendo inhibida por la expresion de FGF-10 secretado por el mesenquima adyacente, restringiendo su formacion y ramificacion (SpencerDene et al., 2006).

En la formacion de intestino es necesario Shh e Ihh. En el caso de Shh, su expresion aumenta en la formacion de duodeno. Se ha evidenciado que en el duodeno de ratones Shh -/-, las vellosidades aparecen obstruyen el lumen duodenal, lo que indica que Shh restringe el crecimiento de vellosidades en el duodeno (Madison et al., 2005).

En la expresion de Shh en el epitelio urinario, esta proteina es clave en la interaccion epitelio-mesenquimatica que involucra el desarrollo de la porcion muscular, ya que se requiere urotelio vesical para inducir la diferenciacion del mesenquima vesical a musculo liso, como tambien se expresa a lo largo de ureteres y uretra (Jenkins et al., 2007;

DeSouza et al., 2013). En la formacion de otros epitelios, como la piel y foliculos pilosos, Shh es fundamental en el desarrollo y proliferacion de las celulas precursoras de queratinocitos (Athar et al.). Tambien su senalizacion en la piel controla el crecimiento y la morfogenesis del foliculo piloso, siendo fundamental en la coordinacion de la transicion epitelio-mesenquima (Ellis et al., 2003).

Todo lo anterior se relaciona con la accion morfogenetica de Shh, debido a que distintos grupos celulares que se encuentran a diferentes distancias del centro morfogenetico, responden de manera diferente, dependiendo del estadio del desarrollo ontogenico (Cohen et al., 2014). Asi, no todas las celulas responderan de la misma manera frente al estimulo, siendo la concentracion del morfogeno la encargada de entregar a las celulas la informacion posicional en relacion a la fuente de la senal, gatillando respuestas celulares diferentes y correctamente interrelacionadas en el espacio y el estadio de desarrollo (Rojas et al.).

Para que esto se produzca, este morfogeno debe ser expresado en el lugar y momentos del desarrollo precisos, generando una respuesta dosis-dependiente a traves de su gradiente de concentracion (Zagorski et al.).

CONCLUSIONES

Para que las celulas originen estructuras ordenadas y coherentes, es fundamental la formacion de patrones, asi como la adquisicion de informacion posicional. Esto se relaciona con la expresion de morfogenos en etapas criticas. Todo esto nos permitira obtener una mayor comprension de los mecanismos biologicos del desarrollo que estan alterados en los defectos de nacimiento.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Athar, M.; Tang, X.; Lee, J. L.; Kopelovich, L. & Kim, A. L. Hedgehog signalling in skin development and cancer. Exp. Dermatol., 15(9) :66777, 2006.

Aviles, E. C.; Wilson, N. H. & Stoeckli, E. T. Sonic hedgehog and Wnt: antagonists in morphogenesis but collaborators in axon guidance. Front. Cell. Neurosci., 7:86, 2013.

Briscoe, J. & Small, S. Morphogen rules: design principles of gradientmediated embryo patterning. Development, 142(23) :3996-4009, 2015. Cobourne, M. T. & Green, J. B. Hedgehog signalling in development of the secondary palate. Front. Oral Biol., 16:52-9, 2012.

Cohen, M.; Briscoe, J. & Blassberg, R. Morphogen interpretation: the transcriptional logic of neural tube patterning. Curr. Opin. Genet. Dev., 23(4) :423-8, 2013.

Cohen, M.; Page, K. M.; Perez-Carrasco, R.; Barnes, C. P & Briscoe, J. A theoretical framework for the regulation of Shh morphogen-controlled gene expression. Development, 141(20) :3868-78, 2014.

Conei, V. D.; Soler, G. B.; Saint-Pierre, C. G. & Rojas, R. M. Role of vitamin E in neural tube of mouse (Mus musculus) embryos and fetuses treated with valproic acid: Immunohistochemical study of Sonic Hedgehog. Int. J. Morphol., 34(3):1044-50, 2016.

DeSouza, K. R.; Saha, M.; Carpenter, A. R.; Scott, M. & McHugh, K. M. Analysis of the Sonic Hedgehog signaling pathway in normal and abnormal bladder development. PLoS One, 8(1):e53675, 2013.

Ellis, T.; Smyth, I.; Riley, E.; Bowles, J.; Adolphe, C.; Rothnagel, J. A.; Wicking, C. & Wainwright, B. J. Overexpression of Sonic Hedgehog suppresses embryonic hair follicle morphogenesis. Dev. Biol., 263(2):203-15, 2003.

Furimsky, M. & Wallace, V. A. Complementary Gli activity mediates early patterning of the mouse visual system. Dev. Dyn., 235(3):594-605, 2006. Hadden, M. K. Hedgehog pathway agonism: therapeutic potential and smallmolecule development. ChemMedChem., 9(1):27-37, 2014.

Ioannides, A. S.; Henderson, D. J.; Spitz, L. & Copp, A. J. Role of Sonic hedgehog in the development of the trachea and oesophagus. J. Pediatr. Surg., 38(1):29-36, 2003.

Jenkins, D.; Winyard, P J. & Woolf, A. S. Immunohistochemical analysis of Sonic hedgehog signalling in normal human urinary tract development. J. Anat., 211(5):620-9, 2007.

Kremnyov, S.; Henningfeld, K.; Viebahn, C. & Tsikolia, N. Divergent axial morphogenesis and early Shh expression in vertebrate prospective floor plate. Evodevo, 9:4, 2018.

Kugler, M. C.; Joyner, A. L.; Loomis, C. A. & Munger, J. S. Sonic hedgehog signaling in the lung. From development to disease. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 52(1):1-13, 2015.

Madison, B. B.; Braunstein, K.; Kuizon, E.; Portman, K.; Qiao, X. T. & Gumucio, D. L. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal cryptvillus axis. Development, 132(2):279-89, 2005.

Meyers, E. N. & Martin, G. R. Differences in left-right axis pathways in mouse and chick: functions of FGF8 and SHH. Science, 285(5426):4036, 1999.

Miller, L. A.; Wert, S. E. & Whitsett, J. A. Immunolocalization of sonic hedgehog (Shh) in developing mouse lung. J. Histochem. Cytochem., 49(12) :1593-604, 2001.

Miyagawa, S.; Matsumaru, D.; Murashima, A.; Omori, A.; Satoh, Y.; Haraguchi, R.; Motoyama, J.; Iguchi, T.; Nakagata N.; Hui, C. C. & Yamada, G. The role of sonic hedgehog-Gli2 pathway in the masculinization of external genitalia. Endocrinology, 152(7):2894-903, 2011.

Murashima, A.; Akita, H.; Okazawa, M.; Kishigami, S.; Nakagata, N.; Nishinakamura, R. & Yamada, G. Midline-derived Shh regulates mesonephric tubule formation through the paraxial mesoderm. Dev. Biol., 386(1):216-26, 2014.

Ngan, E. S.; Kim, K. H. & Hui, C. C. Sonic Hedgehog signaling and VACTERL association. Mol. Syndromol., 4(1-2):32-45, 2013. Patterson, V. L.; Damrau, C.; Paudyal, A.; Reeve, B.; Grimes, D. T.; Stewart, M. E.; Williams, D. J.; Siggers, P; Greenfield, A. & Murdoch, J. N. Mouse hitchhiker mutants have spina bifida, dorso-ventral patterning defects and polydactyly: identification of Tulp3 as a novel negative regulator of the Sonic hedgehog pathway. Hum. Mol. Genet., 18(10):1719-39, 2009.

Rojas, M.; Signore, I. A. & Mejias, R. Morphogens during embryonic development of vertebrates. Int. J. Morphol., 32(1):319-26, 2014. Spencer-Dene, B.; Sala, F. G.; Bellusci, S.; Gschmeissner, S.; Stamp, G. & Dickson, C. Stomach development is dependent on fibroblast growth factor 10/fibroblast growth factor receptor 2b-mediated signaling. Gastroenterology, 130(4):1233-44, 2006.

Tickle, C. & Barker, H. The Sonic hedgehog gradient in the developing limb.

Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol., 2(2):275-90, 2013. van den Brinck, G. R. Hedgehog signaling in development and homeostasis of the gastrointestinal tract. Physiol. Rev., 87(4) :1343-75, 2007.

Wu, F.; Zhang, Y; Sun, B.; McMahon, A. P & Wang, Y. Hedgehog signaling: From basic biology to cancer therapy. Cell Chem. Biol., 24(3):252-80, 2017.

Yang, J.; Andre, P; Ye, L. & Yang, Y Z. The Hedgehog signalling pathway in bone formation. Int. J. Oral Sci., 7(2):73-9, 2015.

Yu, K.; McGlynn, S. & Matise, M. P. Floor plate-derived sonic hedgehog regulates glial and ependymal cell fates in the developing spinal cord. Development, 140(7):1594-604, 2013.

Zagorski, M.; Tabata, Y.; Brandenberg, N.; Lutolf, M. P; Tkacik, G.; Bollenbach, T.; Briscoe, J. & Kicheva, A. Decoding of position in the developing neural tube from antiparallel morphogen gradients. Science, 356(6345) :1379-83, 2017.

Direccion de Correspondencia

Daniel Conei

Doctorado en Ciencias Morfologicas

Facultad de Medicina

Universidad de La Frontera

Avenida Francisco Salazar # 01145

Temuco

CHILE

E-mail: d.conei01@ufromail.cl

Recibido : 11-01-2018

Aceptado: 24-03-2018

Daniel Conei (1,2,3); Gustavo Saint-Pierre (1); Roberto Fierro (3); Mariano del Sol (2,4) & Mariana Rojas Rauco (1)

(1) Laboratorio de Embriologia Comparada, Programa de Anatomia y Biologia del Desarrollo, Instituto de Ciencias Biomedicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

(2) Programa de Doctorado en Ciencias Morfologicas, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

(3) Departamento de Ciencias Morfologicas, Facultad de Ciencia, Universidad San Sebastian, Puerto Montt, Chile.

(4) Centro de Excelencia en Estudios Morfologicos y Quirurgicos (CEMyQ), Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

Caption: Fig. 1. Grupo Embrionario de 12,5 dpc. En A, capa neural de la retina (R) y tallo optico del nervio optico (flecha). En B, placa del piso del tubo neural (F) y notocorda (flecha). En C, esofago (O), bronquios principal y segmentarios (flechas). En D, flechas indica condensacion precartilaginosa de humero, radio y ulna. En E, estomago (S) y epitelio intestinal (flechas). Barra 200 [micro]m. En F, epitelio duodenal (flecha). Barra 100 [micro]m. En G y H, condensacion precartilaginosa de femur. Barra 200 y 100 [micro]m. En I, epitelio vesical (B) y uretra (flecha). Barra 200 [micro]m.

Caption: Fig. 2. Grupo fetal de 17,5 dpc. En A, globo ocular. Barra 200 pm. En B, capas ganglionar y marginal de la retina. En C, epidermis (E) y foliculo piloso en desarrollo (flecha). En D, epitelio bronquiolar (flechas). En E, vellosidades duodenales (flechas). En F, mucosa gastrica en cuerpo del estomago, region de glandulas fundicas (flechas). Barra 100 [micro]m.
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Author:Conei, Daniel; Saint-Pierre, Gustavo; Fierro, Roberto; del Sol, Mariano; Rauco, Mariana Rojas
Publication:International Journal of Morphology
Date:Jun 1, 2018
Words:3190
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