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Identification of the mcyA gene in natural blooms of Radiocystis fernandoi from a tributary of the Rosana reservoir, Brazil./Identificacao do gene mcyA em floracoes naturais de Radiocystis fernandoi, em um tributario do reservatorio de Rosana, Brasil.

Introducao

As floracoes das algas sao resultado de interacoes entre fatores fisicos, quimicos e bioticos, caracterizadas por um crescimento explosivo, autolimitante e de curta duracao dos microrganismos de uma ou poucas especies, frequentemente produzindo coloracoes visiveis nos corpos d'agua (TORGAN, 1989).

O genero colonial Radiocystis, descrito por Skuja (1948) pertence a familia Synechoccaceae, conforme o sistema de classificacao de Komarek e Anagnostidis (1999). Radiocystis fernandoi Komarek & KomarkovaLegnerova e uma especie planctonica de ocorrencia tropical. Esta especie foi descrita baseado em material de um reservatorio mesotrofico localizado no Estado de Sao Paulo, Brasil. Tambem foi encontrada no rio do Corvo, tributario de Reservatorio de Rosana (rio Paranapanema), durante o outono de 2007. Komarek (2003) tambem registrou sua ocorrencia na Indonesia, Sri Lanka e Africa do Sul.

As cianobacterias sao conhecidamente responsaveis por floracoes em ambientes de agua doce e produtoras de cianotoxinas (CARMICHAEL, 1994), o que pode afetar a biota aquatica e terrestre (SIVONSEN; JONES, 1999). A toxina mais importante produzida pelas cianobacterias e a microcistina. A microcistina e uma hepatotoxina sintetizada por um grupo de dez genes denominados de genes da microcistina sintetase ou mcy (A-J), com 55.000 pares de bases (pb). Os genes mcyA e mcyD estao diretamente ligados na biossintese da microcistina (TILLETT et al., 2000).

As hepatotoxinas tem efeito na inibicao das fosfatases e representam um serio risco de intoxicacao humana, agindo na promocao de tumores hepaticos, como demonstrado por Falconer et al. (1994). A presenca de cianobacterias produtoras de microcistina em corpos de agua e de relevante importancia para a saude publica.

Algumas especies de cianobacterias sao identificadas como produtoras de microcistinas. As especies produtoras sao comumente encontradas na natureza em suas variedades produtora e naoprodutora. Nao se sabe ao certo quais os mecanismos geneticos e ambientais responsaveis pelo controle da producao da microcistina, entretanto, sabe-se que em uma mesma especie, podem existir variedades que apresentam os genes para a producao da microcistina e, portanto, passivel de produzir tal toxina, dependendo exclusivamente da ativacao ou nao desses genes, e variedades que nao apresentam esses genes, e nao sao capazes de produzir microcistinas.

Nao ha como identificar se uma floracao de cianobacteria e produtora ou nao de microcistina, apenas por caracteres morfologicos, sendo necessaria a analise da presenca de toxina na agua. A amplificacao dos genes mcy via PCR (polymerase chain reaction) e uma forma alternativa para a identificacao de variedades de cianobacterias com genotipo para producao de microcistina, Esse tipo de abordagem que relaciona a presenca dos genes mcys com a producao de toxinas por cianobacterias, vem sendo utilizado em diversos generos, tais como: Microcystis (KURMAYER et al., 2003; VIA-ORDORIKA et al., 2004), Planktothrix (KURMAYER et al., 2004), Leptolyngbya (RICHARDSON et al., 2007), Geitlerinema (RICHARDSON et al., 2007), Anabaena (KAEBERNICK et al., 2002), Nostoc (HISBERGUES et al., 2003), inclusive em amostras nao cultivadas (OUAHID et al., 2005). A caracterizacao de variedades de cianobacterias toxicas a partir de PCR apresenta resultados compativeis aos obtidos com analises quimicas de deteccao de toxinas na agua, tais como HPLC (High-Pressure Liquid Chromatography), MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation TimeOf-Light Mass Spectrometry) e ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Varios autores demonstraram a correlacao entre presenca dos genes mcys e deteccao de microcistina na agua (BAKER et al., 2002; BOARU et al., 2006; KURMAYER et al., 2004; HISBERGUES et al., 2003; MANKIEWICZBOCZEK et al., 2006; VIA-ORDORIKA et al., 2004).

A amplificacao do gene mcyA via PCR permite a identificacao de algas toxicas antes da liberacao de toxinas na agua. Isso a torna vantajosa em relacao as tecnicas que utilizam como diagnostico a presenca de toxinas na agua, alem disso, e uma tecnica rapida, barata e facilmente realizada em laboratorios de biologia molecular.

Assim, a proposta deste trabalho foi utilizar a amplificacao do gene mcyA, como marcador molecular, para confirmar a hipotese de que as floracoes de cianobacterias presentes no rio do Corvo e de uma variedade com genotipo para a producao de microcistina, assegurando que floracoes posteriores possam ser controladas, minimizando os efeitos toxicos para a biota aquatica.

Material e metodos

Foram coletadas, no rio do Corvo, afluente do reservatorio de Rosana, localizado no Estado do Parana, entre as coordenadas 22[degrees]36'S e 52[degrees]50'W, duas amostras com aproximadamente 150 mL de agua da subsuperficie da coluna d'agua, no mes de maio de 2007, quando apresentou floracao de cianobacteria. Uma aliquota de cada amostra foi fixada para analise taxonomica, com solucao de Transeau. As caracteristicas morfometricas foram analisadas e classificadas de acordo com Komarek e Anagnostidis (1999), e outra aliquota foi mantida em geladeira ate a extracao do DNA.

Para a extracao do DNA total, 2,0 mL de cada amostra foram centrifugados a 10.000 rpm por 10 min. em eppendorf para concentracao das celulas no fundo do tubo. Foram adicionados a cada tubo 500 [micro]L de tampao de extracao (Tris-HCl 1M, pH 8,0; EDTA 0,5M, pH 8,0; [beta]-mercaptoetanol 140 mM, NaCl 5M, CTAB 5% e Sarcosyl 10%) e lisozima (1 mg m[L.sup.-1]). As amostras foram encubadas em banho-maria a 37[degrees]C por 30 min. e adicionado proteinase K (50 [micro]g m[L.sup.-1]) seguido por mais 2h em banho-maria a 60[degrees]C. Os restos celulares foram isolados do DNA por lavagem com fenol/cloroformio. O DNA purificado foi precipitado com solucao salina mais etanol durante 12h. Em seguida, o DNA foi lavado com etanol para retirar o excesso de sal e submetido a tratamento com RNAse em banho-maria a 37[degrees]C por 2h. A quantificacao do DNA extraido foi realizada a partir de comparacao com DNA do fago [lambda] de concentracoes de 25, 50 e 100 ng, em gel de agarose 1%.

O par de "primers" PCPF (5'GGCTGCTTGTTTACGCGACA-3') e PCaR (5'CCA-GTACCACCAGCAACTAA-3') (NEILAN et al., 1995) foi utilizado na amplificacao do espacador intergenico das subunidades [alpha] e [beta] do operon da ficocianina (PC-IGS), como controle positivo para a presenca de DNA de cianobacteria na amostra. O par de "primers" mcyA-Cd1R (5'AAAAGT GTTTTATTAGCGGCTCAT-3') e mcyA-Cd1F (5'-AAAATTAAAAGCCGTAT CAAA-3') (HISBERGUES et al., 2003) foi utilizado na amplificacao parcial do gene mcyA. A reacao de PCR foi realizada seguindo as especificacoes propostas por Prioli et al. (2002) e consistiu dos seguintes passos: 95[degrees]C por 10 min., 35 ciclos de 95[degrees]C por 90 s, 56[degrees]C por 30 s e 72[degrees]C por 50 s e um passo final de 72[degrees]C por 7 min. Apos a reacao de PCR, os fragmentos amplificados foram separados e visualizados em gel de agarose 1,5%, corados com brometo de etideo.

Resultados e discussao

As analises taxonomicas demonstraram que as floracoes de cianobacteria foram compostas basicamente por exemplares da especie Radiocystis fernandoi (KOMAREK; KOMARKOVALEGNEROVA, 1993) (Figura 1). Borges et al., 2008 tambem observaram floracoes desta especie no rio do Corvo, no ano de 2003. Os especimes de Radiocystis fernandoi sao descritos taxonomicamente como colonias subesfericas; celulas ovais ou esfericas com 5-8,5 [micro]m de diametro, agrupadas irregularmente no centro da colonia e radiando em todas as direcoes para regiao periferica; conteudo celular com visiveis aerotopos; apresenta divisao sucessiva em apenas um plano.

A quantidade e qualidade dos DNAs extraidos foram suficientes para a realizacao das reacoes de PCR subsequentes. Os resultados da eletroforese em gel de agarose 1,5% estao representados na Figura 2. Com base na comparacao com o padrao Ladder 100 pb (Gibco BRL), pode-se constatar um fragmento de aproximadamente 650 pb para todas as amostras referentes a amplificacao do espacador intergenico das subunidades [alpha] e [beta] do operon da ficocianina (PC-IGS) (Figura 2A). Esse resultado confirmou a presenca de DNA de cianobacteria nas amostras coletadas no rio do Corvo. A amplificacao parcial do gene mcyA produziu um fragmento de aproximadamente 300 pb para as duas amostras (Figura 2B), indicando que, as floracoes de R. fernandoi analisadas, no rio do Corvo no mes de maio de 2007, possuem genotipo para a producao de microcistina.

[FIGURE 1 OMITTED]

Os generos Microcystis, Anabaen[alpha] e [beta]lanktothrix sao indiscutivelmente os generos produtores de microcistina mais comuns dentre as cianobacterias (HISBERGUES et al., 2003). O potencial toxico de R. fernandoi tambem ja foi evidenciado a partir de analises de microcistinas em populacoes de um reservatorio no Estado do Para (VIEIRA et al., 2003) e por Lombardo et al. (2006), que identificou tres classes de toxinas produzidas por R. fernandoi. Estudos recentes tem demonstrado a presenca de floracoes de R. fernandoi em reservatorios de agua no Brasil.

A presenca de gene mcy tambem foi evidenciada em R. fernandoi. Anjos et al. (2006) demonstraram a presenca do gene mcyB em populacoes de R. fernandoi em um reservatorio do Estado de Sao Paulo. Seus resultados foram complementados com a deteccao de toxina na agua por meio de analises quimicas (HPLC e LC-MS). Entretanto, o presente trabalho e o primeiro a constatar a presenca do gene mcyA para Radiocystis fernandoi.

[FIGURE 2 OMITTED]

A presenca do gene mcyA esta correlacionada com a producao de microcistinas (TILLETT et al., 2000). Varios estudos anteriores demonstraram existir forte correlacao entre a presenca dos genes mcy e a producao de microcistina (BAKER et al., 2002; BOARU et al., 2006; EL HERRY et al., 2008; HISBERGUES et al., 2003; VIA-ORDORIKA et al., 2004). Em alguns casos, a presenca do gene nao revelou producao de microcistina, provavelmente pelo fato de apresentar o genotipo inativo para a microcistina por algum fator ambiental, como por exemplo, luminosidade (KURMAYER et al., 2004). Porem, estes casos sao muito raros e nao devem limitar a aplicacao desse metodo no monitoramento de cianobacterias hepatotoxicas (HISBERGUES et al., 2003). Portanto, apesar de nao ter sido realizada analises quimicas para a presenca de microcistina na agua, a identificacao do gene mcyA nas floracoes de R. fernandoi no rio do Corvo e uma indicacao indireta de que essas populacoes produzem, ou poderao vir a produzir microcistina em algum momento de seu ciclo de vida.

Duas implicacoes importantes surgem dos resultados deste estudo. Primeira, a utilizacao de uma metodologia de diagnostico com resposta rapida para a identificacao de uma especie de cianobacteria potencialmente toxica, Radiocystis fernandoi em floracoes naturais, a partir de tecnica convencional de PCR. Outra implicacao e pertinente a saude publica, esta abordagem permite a identificacao da presenca de cianobacterias possivelmente toxicas em reservatorios d'agua antes mesmo da liberacao de toxinas na agua. Este tipo de abordagem pode ser utilizado em programas de monitoramento permanente em corpos d'agua, para que nao haja problemas relacionados a ingestao de agua ou alimentos contaminados.

Medidas mitigadoras podem ser adotadas antes do agravamento das condicoes ambientais do sistema. Trabalhos recentes demonstraram que alguns fatores ambientais podem estar envolvidos no potencial toxico das cianobacterias. Yoshida et al. (2007) demonstraram haver aumento no numero de populacoes de Microcystis que possuem o gene mcyA, quando ha aumento na concentracao de nitrato. Dessa forma, deve-se realizar medidas mitigadoras para manter as concentracoes de nitrato em niveis mais baixos em ambientes que foram detectadas especies de cianobacterias que possuem o gene mcyA.

A tecnica utilizada neste trabalho se apresentou eficiente na rapida identificacao de cianobacterias produtoras de toxinas. A aplicacao de ferramentas moleculares no diagnostico de cianobacterias toxicas e limitada atualmente, pela disponibilidade de pessoas qualificadas no campo da biologia molecular e nas companhias de abastecimento de agua. Este fato poderia ser solucionado pela maior integracao entre estas companhias e as universidades publicas.

Conlcusao

Apesar dos resultados encontrados nao serem confirmatorios de presenca de toxina na agua, eles devem ser interpretados como potencial perigo de intoxicacao as populacoes ribeirinhas. A grande vantagem de utilizar a tecnica de PCR e a possibilidade de prevencao da proliferacao de cianobacterias potencialmente toxicas antes mesmo da liberacao de toxina na agua. O monitoramento da qualidade da agua com analise quimica de deteccao de cianotoxinas deve ser feitas a fim de impedir possiveis intoxicacoes.

DOI: 10.4025/actascibiolsci.v33i3.6802

Received on April 1, 2009.

Accepted on August 13, 2009.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Nupelia (Nucleo de Pesquisas em Limnologia, Ictiologia e Aquicultura); ao PEA (Programa de Pos-graduacao em Ecologia de Ambientes Aquaticos Continentais) da Universidade Estadual de Maringa, pelo apoio logistico; ao CNPq/CT-Hidro, pela concessao da bolsa de doutorado a primeira autora.

Irauza Arroteia Fonseca, Thiago Cintra Maniglia, Liliana Rodrigues, Alberto Jose Prioli e Sonia Maria Alves Pinto

Prioli

Universidade Estadual de Maringa, Av. Colombo, 5790, 87020-900, Maringa, Parana, Brasil. *Autorpara correspondencia.

E-mail: irauzaf@hotmail.com

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Author:Fonseca, Irauza Arroteia; Maniglia, Thiago Cintra; Rodrigues, Liliana; Prioli, Alberto Jose; Prioli,
Publication:Acta Scientiarum. Biological Sciences (UEM)
Date:Jul 1, 2011
Words:3033
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