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Identificacion de polimorfismos en RXam2, un gen candidato de resistencia a la bacteriosis vascular de yuca.

Identification of polymorphisms in RXam2 a cassava bacterial blight resistance gene candidate

Introduccion

El sistema inmune de las plantas puede dividirse en dos niveles. El primer nivel conocido como PTI (PAMP Trigger Immunity) se basa en la capacidad de reconocimiento de PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns) y depende de receptores vegetales denominados PRRs (Pathogen Recognition Receptors) (Zipfel, 2009). Este reconocimiento activa una senalizacion que culmina con la reprogramacion de la expresion de genes y en muchos casos con una respuesta hipersensible que evita la colonizacion del patogeno a tejidos no infectados (Chisholm et al., 2006). Los patogenos desarrollaron proteinas efectoras que al ser inyectadas al interior de las celulas de la planta suprimen la PTI. Las plantas, a su vez desarrollaron las proteinas de resistencia (R) que permiten el reconocimiento de las proteinas efectoras para activar el segundo nivel de inmunidad que se conoce como ETI (Effector Triggered Immunity) (Chisholm et al., 2006). Las proteinas R identificadas en diferentes especies de plantas poseen una alta similitud estructural entre si, a pesar de estar implicadas en el reconocimiento de patogenos tan distintos como virus, bacterias, hongos o nematodos (Jones y Dangl, 2006). El grupo de proteinas de resistencia mas comun presenta en la region central un dominio de union a nucleotido (NBS, Nucleotide-Binding Site), en el extremo C-terminal un dominio de repeticiones ricas en leucinas (LRR, Leucine Rich Repeat) y en la region N-terminal ya sea un dominio de tipo "coiled-coil" (CC), o dominios con similitud a las proteinas Toll de Drosophila y a las interleukinas IL-1 de mamiferos (dominios TIR) (Hammond-Kosack y Kanyuka, 2007).

La yuca es uno de los cultivos mas importantes en las regiones tropicales, subtropicales y subsaharianas del mundo; es cultivada en mas de 90 paises y constituye la base de la alimentacion para cerca de 1000 millones de personas en el mundo (Ceballos, 2002). La bacteriosis vascular es causada por la bacteria Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam), un patogeno foliar y vascular (Lopez et al., 2006). Las perdidas causadas por la bacteriosis pueden alcanzar el 80 o 100% de la cosecha (Lopez et al., 2006). Hasta el momento no se ha clonado ningun gen de resistencia en yuca a esta enfermedad aunque importantes esfuerzos se han llevado a cabo con este fin (Lopez et al., 2003; Lopez et al., 2007). Mediante la estrategia de genes candidatos se pudo identificar una secuencia de tipo NBS que colocaliza con un QTL que explica el 61.6% de la resistencia a la cepa CIO151 de Xam (Lopez et al., 2007). Como una manera de obtener una validacion funcional de la importancia de este gen de resistencia se planea estudiar los polimorfismos presentes en este gen para asociarlos con el fenotipo resistencia/susceptibilidad en diferentes variedades de yuca.

Materiales y metodos

Material vegetal y extraccion de ADN

Plantas de yuca in vitro de las variedades SG10735, MCOL2246 y TMS60444 fueron obtenidas a traves del banco de germoplasma de yuca del CIAT (Centro internacional de agricultura tropical). Las plantas fueron propagadas in vitro, endurecidas en suelo y mantenidas en invernadero a 28[grados]C/21[grados]C (dia/noche), con fotoperiodo de 12 horas luz, 12 horas oscuridad. Hojas jovenes fueron colectadas y maceradas en nitrogeno liquido para extraer el ADN genomico de acuerdo al protocolo descrito por Dellaporta et al. (1983). El ADN genomico se empleo como molde para realizar las amplificaciones del fragmento del gen RXam2.

Amplificacion, clonacion y secuenciacion

A partir de la secuencia disponible del gen RXam2 se disenaron los cebadores RXam2-V.F y RXam2-V.R 5'-CTTAAACAGAACTCAATTTT-3' y 5'-GGAATTCATAGTTTTTTGGA-3', respectivamente. Los cebadores permiten amplificar 508 pb curso arriba del inicio de la transcripcion del gen RXam2 asi como la region que codifica el extremo N-terminal de la proteina que incluye la region correspondiente aldominio NBS. La region de 508 pb se ha denominado como promotora aunque puede comprender una parte del 5'UTR (figura 1). Cada reaccion de PCR se llevo a cabo en un volumen final de 50 p:l que contenia 0.2 [micron]M de cada cebador, 0.2 pM de dNTPs, 2 mM de MgS[O.sub.4], 1X de buffer de PCR y una unidad de enzima DNA polimerasa (Proofreading Hifidelity, Invitrogen). Las reacciones de PCR se efectuaron en un termociclador MyCycler[TM] BioRad[R] utilizando los siguientes ciclos de temperatura: apertura inicial a 94[grados]C por 2 minutos, 35 ciclos de amplificacion de 30 segundos de apertura a 94[grados]C, 30 segundos de anillamiento a 51.6[grados]C y 2 minutos de extension a 68[grados]C, con un ciclo final de extension a 72[grados]C por 5 minutos agregando en este ultimo ciclo 1 U de polimerasa Dream taq (Fermentas), para adicionar la T en los extremos de los amplicones. El producto de la amplificacion se verifico por electroforesis en gel de agarosa al 1.2% tenido con bromuro de etidio en buffer TAE 0.5X.

A partir del producto de PCR se realizo la elucion con el kit Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega, Madison, WI, USA). Cada amplicon eluido se clono en el vector pGEM-T-easy (Promega, Madison, WI, USA) siguiendo las instrucciones de la casa comercial. A continuacion, cada producto de clonacion fue transformado en celulas electrocompetentes de Escherichia coli DH5[alfa] por electroporacion con el electroporador MicroPulserTM BioRad[R] siguiendo las condiciones de voltaje, resistencia y capacitancia recomendadas por la casa comercial. Las celulas se incubaron una hora a 37[grados]C en 1ml de medio 2XYT con agitacion constante. Las bacterias se sembraron en medio LB solido con seleccion para ampicilina a 100 [micron]g/[micron]l y se incubaron a 37[grados]C toda la noche. Se confirmo la presencia del inserto en algunos de los clones positivos, elegidos al azar, mediante PCR de colonia. A partir de los clones positivos se realizo el aislamiento del ADN plasmidico empleando el kit Wizard Plus SV Miniprep (Promega, Madison, WI, USA) utilizando 5 ml de un cultivo en medio LB liquido con ampicilina 100 [micron]g/[micron]l. Finalmente el producto del ADN plasmidico fue secuenciado empleando los cebadores del vector y/o del gen RXam2 en un centro de servicios certificados.

[FIGURA 1 OMITIR]

Resultados y discusion

Amplificacion y secuenciacion

Como parte de un estudio preliminar encaminado a identificar las regiones mas polimorficas del gen RXam2, se amplifico una region parcial del gen en tres variedades distintas de yuca. Las variedades seleccionadas fueron SG10735, TMS60444 y MCOL2246, las cuales presentan un fenotipo resistente, susceptible y desconocido a la cepa de Xam CIO151, respectivamente. Se logro obtener suficiente cantidad de ADN de las tres variedades para poder continuar con el proceso de amplificacion del gen RXam2.

Dado que la yuca es una planta con alta heterocigocidad y tetraploide es posible que dentro de un solo individuo se puedan presentar hasta cuatro alelos para un gen particular (Fregene et al., 1997). Con el fin de identificar todos los posibles alelos se procedio a amplificar y secuenciar directamente el producto de PCR de regiones seleccionadas en dos variedades. Sin embargo, por la naturaleza genetica de la yuca, las secuencias fueron de baja calidad no pudiendo identificar verdaderos SNPs (Single Nucleotide Polymorphims) (datos no mostrados). Como alternativa se procedio a clonar el producto de PCR de cada uno de los fragmentos y secuenciar el mayor numero de clones posibles obtenidos. De esta manera se lograron obtener secuencias de buena calidad para las tres variedades. Para las variedades TMS60444 y MCOL2246 se obtuvo informacion de secuencias para cinco clones y uno para la variedad SG10735.

El genoma de la yuca fue recientemente liberado (octubre 2009) (www.phytozome.com) lo que permitio identificar la secuencia completa del gen RXam2. Sin embargo, recientemente se libero una nueva version (diciembre de 2010). Basados en los datos de la primera version se pudo identificar que el gen RXam2 hacia parte del scaffold 10489, cubria la posicion 36359-40412 y el gen denominado cassava 20457. m1. La anotacion bioinformatica predecia dos intrones (376-441 pb, 3474-4029 pb). Sin embargo, en la nueva version, el gen aparece en el scaffold 07610 con el codon de inicio en la posicion 91289 y el de parada en la posicion 95332 y se anoto con un solo intron (3491-3985 pb) (figura 1, tabla 1). Se decidio realizar el analisis de polimorfismos bajo los dos modelos genicos predichos para calcular el porcentaje de cambios en las regiones codificantes y no codificantes.

Polimorfismos intravarietales

En la tabla 2 se incluyen los datos de la presencia de SNPs e inserciones/deleciones (indels) intravarietales. Para la variedad SG107-35 no se pudieron determinar los SNPs intravarietales debido a que solo se pudo obtener una secuencia de buena calidad para uno de los clones obtenidos. Varios intentos se realizaron para obtener clones de SG107-35, pero los clones resultantes no correspondian al gen, no presentaban el tamano esperado o las secuencias fueron de baja calidad. La variedad con mas SNPs intravarietales fue TMS60444, que registro 31 en comparacion con 5 SNPs detectados en la variedad MCOL2246. Los datos no permiten determinar el numero de alelos para cada variedad, pero el hecho de encontrar menos SNPs en la variedad MCOL2246 sugiere un nivel de ploidia menor con respecto a TMS60444, lo cual concuerda con observaciones hechas a traves de SSRs que han demostrado que sobre algunas regiones del genoma de yuca se presentan dos alelos sugiriendose un proceso de diploidizacion en yuca (Mba et al., 2001), el cual puede ser diferencial entre variedades de yuca. La mayoria de polimorfismos identificados en TMS60444 se ubicaron en la region promotora (tabla 2, figura 2) y pocas diferencias se observaron al comparar los dos modelos genicos predichos segun la primera y segunda version del genoma de yuca (tabla 2).

Polimorfismos entre variedades

Considerando la poca diferencia en los dos modelos genicos, para la comparacion entre variedades se considero unicamente el modelo genico predicho segun la segunda version del genoma de yuca. Cuando se compara el numero de polimorfismos entre variedades se observa que en general el numero es bastante similar (tabla 3). El numero total de SNPs entre variedades fue de 44, 23 y 34 entre MCOL2246-TMS60444, MCOL2246-SG107-35 y TMS60444-SG107-35, respectivamente. Los porcentajes de transiciones en estas comparaciones fueron 68.2%, 69.5% y 64.7% mientras que los porcentajes obtenidos para transversiones fueron 22.7%, 26.1% y 23.5 % respectivamente, e indican valores muy homogeneos en los tres casos (tabla 3). Cuando se compara el nivel de polimorfismos de estas variedades con la secuencia del genoma de referencia, la cual es una linea autofecundada generada a partir de la variedad MCOL1505, se observa que el menor numero de polimorfismos se presenta con la variedad MCOL2246, sugiriendo una relacion evolutiva mas cercana (tabla 3). Los porcentajes de transiciones (87.5%, 64.3% y 53.5%) tambien fueron mayores que los de transversiones (12.5%, 26.1% y 26.1% para MCOL2246, TMS6044 y SG107-35 vs. el genoma de referencia, respectivamente). Un mayor porcentaje de transiciones ha sido previamente reportado en un estudio de SNPs en un amplio grupo de genes de yuca (Lopez et al., 2005).

En general se observa que un porcentaje mayor de SNPs, tanto intravarietales como entre variedades (37.5% - 64.7%), fueron identificados en la region promotora del gen (tabla 3, figura 2 y 3). La region definida como promotor puede incluir el 5'UTR del gen, pero solo estudios de 5'RACE o analisis de ESTs permitiran definir precisamente el tamano de esta region. En este estudio el numero de indels fue relativamente

bajo y este tipo de polimorfismo solo se identifico en la region promotora (tabla 3). El mayor numero de polimorfismos (SNPs e indels) identificados en el promotor sugiere que esta region esta sometida a menores presiones selectivas y puede mutar sin comprometer la funcion del gen. Sin embargo, polimorfismos en esta region pueden comprometer la expresion del gen y conferir susceptibilidad a las plantas como se ha demostrado en arroz y pimenton para los genes Xa27 y Bs3 respectivamente (Gu et al., 2005; Romer et al., 2007). Resultara valioso determinar en consecuencia el fenotipo de resistencia/susceptibilidad para estas variedades asi como el perfil de expresion en respuesta a Xam.

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

Conclusiones

Se identificaron polimorfismos de tipo SNPs e indel en tres variedades de yuca en una region parcial del gen candidato de resistencia RXam2. Los polimorfismos pudieron ser divididos en intravarietales y entre variedades. El mayor porcentaje de polimorfismos se encuentra ubicado en la region promotora. No obstante, se identifico tambien un importante numero de polimorfismos en la region codificante, por lo cual se hace necesario, en futuros estudios, la secuenciacion de las dos regiones genicas.

Agradecimientos

Este proyecto fue financiado por la DIB (Division de Investigacion de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogota).

Recibido: abril 7 de 2011 Aprobado: noviembre 10 de 2011

Referencias bibliograficas

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Elizabeth Contreras BSc. Estudiante de Maestria. Grupo Manihot Biotec. Departamento de Biologia. Universidad Nacional de Colombia, sede Bogota.

Camilo Lopez, BSc. MSc. PhD. Profesor Asociado. Grupo Manihot Biotec. Departamento de Biologia. Universidad Nacional de Colombia, sede Bogota. celopezc@unal.edu.co
Tabla 1. Identificacion del gen RXam2 en el sitio web del genoma de
yuca (www.phytozome.com) en las dos versiones del genoma

                        Primera anotacion      Segunda anotacion

Identificador            cassava20457.m1      cassava 4.1_031234m
Scaffold                10489: 36359-40412     07610: 91289-95332
Secuencia Genomica           4054 pb                4044 pb
Secuencia CDS                3432 pb                3599 pb
Intrones                        2                      1
Ubicacion intrones        376-441= 66pb        3491-3985pb=495pb
                        3474-4029 = 556pb
Secuencia Peptidica          1144 aa                1182 aa
Dominios proteicos           NBS-LRR                NBS-LRR

Tabla 2. Identificacion de polimorfismos intravarietales en el gen
RXam2.

                                    MCOL2246

                              Region codificante

Tipo de SNP         Promotor    1.er modelo    2. Modelo
                                   genico        genico
                                 (intron +      (1 exon)
                                   exon)

Transicion              1          0 + 4           4
Transversion            0            0             0
Indel                   0            0             0
Total por region        1            4             4

Total                                5

                                    TMS60444

                               Region codificante

Tipo de SNP         Promotor    1. er modelo   2. Modelo
                                   genico        genico
                                 (intron +      (1 exon)
                                   exon)

Transicion             12          8 + 1           9
Transversion            5          1 + 1           1
Indel                   4            0             0
Total por region       21          9 + 1           10

Total                                31

Tabla 3. Identificacion de polimorfismos entre variedades en el gen
RXam2.

                                        Transiciones     Transversiones
Variedades de yuca     Region
comparadas             secuenciada    Numero      %     Numero      %

MCOL2246 vs. genoma    Promotor            2      25         1    12.5
  de referencia        Codificante         5    62.5         0       0
TMS6044 vs. genoma     Promotor           15    35.7         8      19
  de referencia        Codificante        12    28.6         3     7.1
SG107-35 vs. genoma    Promotor            7    31.8         5    22.7
  de referencia        Codificante         5    22.7         4    18.2
TMS60444 vs.           Promotor           15    34.1         7    15.9
  MCOL2246             Codificante        15    34.1         3     6.8
TMS60444 vs.           Promotor           12    35.3         6    17.6
  SG107-35             Codificante        10    29.4         2     5.9
MCOL2246 vs.           Promotor            9    39.1         2     8.7
  SG107-35             Codificante         7    30.4         4    17.4

                                            Indels           Total
Variedades de yuca     Region
comparadas             secuenciada    Numero      %     Total     %

MCOL2246 vs. genoma    Promotor            0       0       3    37.5
  de referencia        Codificante         0       0       5    62.5
TMS6044 vs. genoma     Promotor            4     9.5      27    64.2
  de referencia        Codificante         0       0      15    35.7
SG107-35 vs. genoma    Promotor            1     4.5      13      59
  de referencia        Codificante         0       0       9    40.9
TMS60444 vs.           Promotor            4     9.1      26    59.1
  MCOL2246             Codificante         0       0      18    40.9
TMS60444 vs.           Promotor            4    11.8      22    64.7
  SG107-35             Codificante         0       0      12    35.3
MCOL2246 vs.           Promotor            1     4.4      12    52.2
  SG107-35             Codificante         0       0      11    47.8
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Title Annotation:ARTICULO DE INVESTIGACION
Author:Contreras, Elizabeth; Lopez, Camilo
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Dec 1, 2011
Words:3186
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