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Identificacion de bacterias del genero vibrio asociadas a zonas productoras de moluscos bivalvos, estado Sucre, Venezuela.

Identification of Bacteria of the Genus Vibrio Associated to Zones of Bivalve Mollusks Extraction, Sucre State, Venezuela

INTRODUCCION

Desde principios del siglo pasado, numerosas investigaciones sobre microorganismos asociados a bivalvos se han publicado alrededor del mundo, debido a que algunos de estos pueden ser patogenos. La mayoria de los estudios publicados se enfocan en miembros de la familia Vibrionaceae [5, 45, 50]. Los vibrios fueron uno de los primeros grupos bacterianos en ser reconocidos y descritos taxonomicamente en la naturaleza por Pacini en 1854 [35].

Diversos estudios han demostrado que los vibrios se encuentran en altas densidades en el ecosistema marino y han sido extensamente estudiados en los sistemas costeros por su importancia medioambiental e incidencia en la extraccion de moluscos [35, 53]. La distribucion y dinamica de estas poblaciones estan influenciadas por gradientes medioambientales como temperatura, salinidad, disponibilidad de nutrientes y factores biologicos como, depredacion y abundancia de dinoflagelados y hospedadores. En los ultimos anos se ha incrementado el interes sobre la investigacion de vibrios en los sistemas marinos costeros [20].

Los moluscos en general poseen una alimentacion por filtracion. Este sistema de nutricion permite que se acumule una gran cantidad de microorganismos y otros elementos presentes en el ambiente donde los bivalvos se desarrollan. El consumo de bivalvos bajo estas condiciones ha sido la causa de un gran numero de casos de enfermedades entericas, por supuesto, este riesgo se potencializa durante la comercializacion y las operaciones de manejo [21, 41, 45]. Estos pueden estar implicados en la transmision del colera y otras enfermedades gastrointestinales, relacionado a la costumbre de ingerirlos directamente en su concha, crudos o cocidos deficientemente [17].

Las especies de Vibrio varian considerablemente en patogenicidad y aun estan indefinidas las causas de su aparicion y epidemiologia. Esto es relevante debido a que ocasionan numerosos episodios patologicos, casos de mortalidad y grandes perdidas economicas y alteraciones sociales en la poblacion dedicada a industrias extractivas y procesadoras de productos del mar [5, 30]. Los vibrios en la naturaleza, pueden estar en un estado inactivo o no ser capaces de crecer en los medios selectivos empleados, no obstante se ha evidenciado que las bacterias en estado de viables no cultivables (VBNC) pueden tambien causar enfermedades [12, 21]. Las especies de Vibrios patogenos para humanos en la actualidad esta limitada solo a 12, que son clinicamente significativas: V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. mimicus, V. hollisae, V. fluvialis, V. furnissii, V. vulnificus, V. alginolyticus, V. damsela, V. metschnikovii, V. cincinnatiensis y V. harveyi [42]. Las infecciones causadas por estos organismos estan usualmente asociadas a la ingestion de moluscos contaminados; los sintomas que manifiesta el paciente van desde gastroenteritis, infeccion a la piel, septicemia, llegando a la mortalidad en el caso de pacientes inmunocomprometidos o con bajas defensas [14, 49].

[FIGURA 1 OMITIR]

En Venezuela, es poco lo que se ha investigado sobre la presencia del genero Vibrio, a pesar de tener a lo largo de casi todo el ano una temperatura en el agua adecuada para la multiplicacion del microorganismo. El objetivo de este trabajo fue identificar especies del genero Vibrio en areas destinadas para la cria y explotacion de moluscos bivalvos, aportando informacion sobre dichas especies principalmente de las que pueden constituir un riesgo a la salud humana.

MATERIALES Y METODOS

Recoleccion y procesamiento de las muestras

Para la realizacion del presente estudio se colectaron 192 muestras de moluscos bivalvos procedentes de los bancos naturales Punta Patilla (mejillon: Perna spp.), Bahia Iglesia (mejillon: Perna spp.), Isla Lobos-Chacopata (pepitonas: Arca zebra) y Bahia Guiria (guacuco: Tivela mactroides), en el estado Sucre (FIG. 1). El periodo de muestreo comprendio 16 meses (abril-diciembre 2006, enero-julio 2007). Mensualmente se colectaron por cada area tres muestras de bivalvos, estas fueron colocadas en bolsas plasticas con cierre hermetico y transportadas en cavas de anime con hielo al laboratorio de Microbiologia de Alimentos del Instituto Nacional de Investigaciones Agricolas (INIA-Sucre/Nueva Esparta). Una vez en el laboratorio, las muestras en su concha fueron desbulladas en condiciones de asepsia segun las recomendaciones de la American Public Health Association [3].

Identificacion de especies de Vibrio

En la deteccion de las especies de Vibrio presentes se siguieron las pautas senaladas por Kaysner y De Paola [34] y Barbieri y col. [4]. Se preparo un homogeneizado (OsterizerDeluxe, Mod. 450, Venezuela) con 50 g del molusco en 450 mL de agua peptonada alcalina (pH 8,6 [+ o -] 0,2) dejandose incubar durante 6 a 7 h a 37[grados]C. La tecnica de siembra se realizo por agotamiento en placas de Petri con agar TCBS (Tiosulfato Citrato Sales Biliares Sacarosa, Merck, Darmstadt-Alemania). Las placas fueron incubadas (Memmert B30, Alemania) a 37[grados]C durante 24 a 48 h. Las colonias desarrolladas se aislaron en agar Tripticasa Soya (Merck) con NaCl al 1%. Una vez realizada la tincion de Gram se les realizo las siguientes pruebas bioquimicas convencionales: oxidasa, crecimiento en agar TSI, hidrolisis de la gelatina, hidrolisis de la urea, Voges-Proskauer, reduccion de nitratos a nitritos, halotolerancia (0; 3; 6; 8 y 10% de NaCl), descarboxilacion de la lisina, arginina y ornitina, fermentacion de carbohidratos (glucosa, manitol y arabinosa), motilidad y crecimiento a 42[grados]C. Adicionalmente, se complementaron estas pruebas con el test de susceptibilidad al vibriostato O/129 (discos de 10 y 150 mg). La patogenicidad de las cepas de V. parahaemolyticus asociada con la habilidad de producir una hemolisina directa termoestable (Hemolisina Kanagawa, TDH) fue confirmada en agar Wagatsuma preparado con eritrocitos humanos. Para los aislados de V. cholerae se les aplico prueba serologica utilizando el antisuero polivalente (grupo O1). Se utilizo ademas como medios de cultivos no selectivos (para la posible recuperacion de V. hollisae) agar sangre, seleccionando aquellas colonias que resultaron positivas a la prueba de oxidasa, y agar con manitol y maltosa; en este medio, las colonias de V. hollisae son redondas, brillantes y moradas, no fermentan el manitol ni la maltosa [31, 34].

RESULTADOS Y DISCUSION

En el curso de la investigacion se aislaron un total de 458 cepas de Vibrios distribuidas de la siguiente manera: 119 en Punta Patilla, 117 Bahia Iglesia, 122 Isla Lobo-Chacopata y 100 para Bahia Guiria. Se observo una frecuencia total de aislamiento muy similar entre las tres primeras zonas con 26; 25,6 y 26,6%, respectivamente, seguida de Bahia Guiria con 21,8% (TABLA I). Se detecto la presencia de Vibrio cholerae no O1 , V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus, V. mimicus, V. metschnikovii y V. hollisae, observandose que la mayoria de las cepas correspondieron a V. alginolyticus seguida de V. parahaemolyticus, representando en promedio 57,4 y 22,7% de los aislamientos, respectivamente, en todas las muestras probadas de las distintas zonas de estudio (TABLA II). La mayor incidencia de V. alginolyticus sobre otras especies del genero ya ha sido reportada [39, 41]. En Venezuela, en un trabajo realizado por Rengel [46] sobre la deteccion de V. parahaemolyticus en ostras de la Laguna de La Restinga-estado Nueva Esparta, se hace mencion de la gran interferencia que le ocasionaba V. alginolyticus en el aislamiento de esta especie; es posible que la temperatura y la salinidad de las aguas alli presentes favorezcan sus condiciones de crecimiento.

Vibrio alginolyticus es la especie mas halotolerante, en el presente estudio se evidencio su caracter de halofila extrema soportando una concentracion del 10% de NaCl (TABLA III); es la mas abundante en el agua de mar y muy comun en el habitat marino de paises templados [39]. Causa infecciones gastrointestinales en el hombre y ocasionalmente, extraintestinales. Posee escasa virulencia y se asocia con frecuencia a otros patogenos, su poder invasivo es bajo y las infecciones que origina suelen ser benignas y autolimitadas [40].

Las infecciones causadas por la mayoria de las especies de Vibrio estan usualmente asociadas a la ingestion de moluscos contaminados; los sintomas que manifiesta el paciente van desde gastroenteritis, infeccion a la piel, septicemia, llegando a la mortalidad en el caso de pacientes inmunocomprometidos [49]. Ademas pueden actuar como patogenos de organismos acuaticos de importancia comercial [51].

Vibrio parahaemolyticus es un patogeno enterico que se transmite a humanos, primordialmente, a traves del consumo de mariscos crudos o pobremente cocidos, en otros paises tambien se ha encontrado en camarones, cangrejos, jaibas y, ocasionalmente, pescados [21, 29]. Al igual que otros miembros del genero Vibrio es halofilico y se encuentra ampliamente distribuido alrededor del mundo. Este patogeno se considera la causa principal de gastroenteritis en mariscos a nivel mundial [22, 37] y ocasionalmente se relaciona con infecciones extra-intestinales [8].

Como factor de virulencia destaca la hemolisina o toxina termoestable directa (thermostable direct hemolysin-TDH), responsable de la produccion de diarrea, efecto conocido como fenomeno de Kanagawa. Otros factores importantes son la toxina hemolisina relacionada (toxin related hemolysin-TRH), pili, hemaglutininas (hemaglutinina manosa sensible), factores de colonizacion y la capacidad de invasion celular [14, 19, 27].Al respecto, las cepas aisladas dieron reacciones negativas para la prueba de Kanagawa, concordando con trabajos previos que senalan que la facultad de V. parahaemolyticus para destruir eritrocitos humanos es muy rara en las cepas aisladas de especimenes marinos [46, 54]. Munoz y col. [41] tampoco encontraron en pepitonas, cepas de V. parahaemolyticus positivas para la prueba. Segun Dileep [17], una pequena porcion de las cepas ambientales de V. parahaemolyticus son virulentas y solo 1-2% de estas exhiben una hemolisis tipo [beta].

Otra de las especies de Vibrio reconocida como patogeno y que ha acaparado la atencion de muchos cientificos es V. vulnificus. En el presente estudio se logro aislar a esta especie solo en Punta Patilla y Bahia Iglesia con 5,9 y 5,1% de aislamiento, respectivamente.

Segun Cook y col. [13], Vibrio vulnificus es una bacteria cuyas infecciones presentan un alto indice de mortalidad en los Estados Unidos. Normalmente, las infecciones con V. vulnificus tienen como principal sindrome clinico septicemia, pero al igual que V. parahaemolyticus es capaz de causar gastroenteritis e infecciones en heridas [43]. En la actualidad, se reconoce la presencia de V. vulnificus alrededor del mundo donde se han reportado casos de este en diversos paises, tales como Estados Unidos (EUA), Dinamarca, Hong Kong, Japon, Africa y varias ciudades de America del Sur [44]. Vibrio vulnificus ha sido encontrado con anterioridad en E.U.A. por Dowdy y col. [18], en muestras de sangre de un paciente que recibio un trasplante de higado despues de ingerir ostiones crudos.

V. cholerae fue aislado en Punta Patilla con 8,4% de aislamiento en el total de las muestras, mientras que en Bahia Iglesia, Isla Lobos y Bahia Guria tuvo una frecuencia de aislamiento relativamente baja, entre 3,3-4%. A estas cepas se les practico las pruebas serologicas correspondientes comprobandose que, las colonias aisladas producian reacciones negativas al antisuero polivalente (grupo O1). La baja incidencia de esta especie de Vibrio en bivalvos fue encontrada tambien por Matte y col. [39], en un estudio sobre vibrios patogenos en ostras de la costa atlantica brasilena reportando una incidencia entre 0-8%.

La identificacion de 22 aislados de V. cholerae no O1 (TABLA II) plantea una problematica que requiere de analisis. En las aguas marinas tropicales de las costas de Venezuela se dan, en general, condiciones apropiadas de temperatura y salinidad para el desarrollo de esta bacteria. Solo ciertas condiciones son desfavorables para el desarrollo de esta especie en aguas marinas, como una salinidad de 35 ppt y temperaturas elevadas de 28 a 30[grados]C o mas [47, 48]. Pero se ha senalado que, aun en tales condiciones desfavorables, V. cholerae puede permanecer viable en estado de latencia pero no ser cultivable en los medios estandares [21] y, por tanto, no ser detectable.

V. cholerae no O1, ha sido reportado en ambientes acuaticos [25, 45], es frecuentemente aislado de aguas [9, 24], sedimentos [2] y de alimentos de origen marino [10, 54]. La patogenicidad de las cepas no O1 es conocida a traves de cuadros diarreicos donde se ha aislado el microorganismo a partir de las heces de los pacientes, con sintomas que van desde una diarrea leve hasta la deshidratacion grave, semejante a la observada en el colera [26]. Las cepas no O1 tambien se han asociado con infecciones de herida, cirrosis y septicemias [6]. Estos datos confirman su alto potencial patogeno y la importancia de evaluar su presencia en los moluscos que se consumen crudos.

La recuperacion de Vibrio mimicus y V. metschnikovii tambien resulto relativamente baja, ya que ambas presentaron una frecuencia de aislamiento entre 4-7,6% en las distintas zonas de estudio (TABLA II). V. mimicus es reconocido como un patogeno emergente humano, uno de los primeros reportes fue en Bangladesh en 1981, en el cual V. mimicus se vio involucrado en dos casos de otitis, ambos causados por la exposicion al mar [7, 16]. En otro reporte se presentaron 17 casos de gastroenteritis en adultos que habian consumido ostiones crudos [16]. De igual modo, en febrero del 2005, despues de una fiesta de carnavales en Cuncashca (Provincia de Carhuaz, en Peru), se produjo un brote de diarrea aguda que afecto a 32 personas. En todos ellos se determino a V. mimicus como el agente causal [7]. En Venezuela, ciudad de Cumana, hay reportes de su presencia, sin embargo no se tienen datos de algun caso clinico, probablemente debido a que este microorganismo no se busca rutinariamente [41, 54].

V. metschnikovii es una de las especies de Vibrio mas antiguas; en realidad es poco lo que se ha descrito sobre esta especie, aunque su aislamiento de ambientes marinos [36] y alimentos del mismo origen ha sido confirmado [23, 41]. Aunque es muy raro su aislamiento en humanos, existen reportes donde se ha evidenciado la presencia de esta especie causando peritonitis e inflamacion de la vesicula biliar [33], septicemia [28] y casos de diarrea [15, 38].

Solo cuatro cepas de V. hollisae fueron aisladas en el presente estudio. Su porcentaje de recuperacion fue entre 0-1,7% en el total de las muestras de las zonas Punta Patilla, Bahia Iglesia e Isla Lobos. Los resultados de la presente investigacion difieren de los obtenidos por Franco-Monsreal y col. [22] quienes obtienen una incidencia de V. hollisae de 11,5 y 6,2%, en alimentos marinos crudos y parcialmente cocidos, respectivamente, en marisquerias de la ciudad de Chetumal, Quintana Roo, Mexico.

La metodologia utilizada fue especial para la deteccion de esta especie, ya que ella no logra crecer en el medio TCBS [31]. V. hollisae es una especie halofila que recientemente fue reclasificada como Grimontia hollisae por Thopson y col. [52]. Se sabe que este microorganismo ha estado asociado a casos de gastroenteritis, que van de moderados a graves por el consumo de alimentos marinos, aunque su significado clinico no esta aun bien definido y los aislamientos son poco frecuentes [1, 11]. Hinestrosa y col. [32] resenan un caso en el cual un individuo sufrio la forma mas grave de ataque de esta especie, presentando hipotension profunda e insuficiencia renal y finalmente un shock hipovolemico.

Este hallazgo de V. hollisae en el presente estudio, indica la importancia de no subestimar las posibles infecciones por esta especie en zonas costeras en donde los individuos consumen alimentos marinos crudos. Un segundo punto importante es el medio de cultivo, el agar TCBS se utiliza como medio selectivo para el aislamiento de las especies de Vibrio en los laboratorios clinicos, pero desafortunadamente, V. hollisae no tiene buen crecimiento en este medio. El mejor crecimiento del aislamiento obtenido en este trabajo se produjo en placas con agar sangre y agar manitol y maltosa.

La recuperacion de Vibrio mimicus, V. metschnikovii, V. hollisae y V. vulnificus fue relativamente baja en comparacion con V. alginolyticus y V. parahaemolyticus, quizas debido a fenomenos de competencia, sin embargo, es probable que al estudiar las interrelaciones ecologicas entre estas especies y los factores que los afectan, pueden aportar informacion interesante de como estos vibrios, considerados como patogenos, pueden prevalecer en un momento dado.

Aunque los niveles de frecuencia de aislamiento en las especies Vibrio mimicus, V. metschnikovii, V. hollisae y V. vulnificus se consideran bajos, existe la probabilidad de que ocurra un brote de vibriosis a traves del consumo de bivalvos crudos. Este riesgo es agravado por el manejo tipico que reciben los bivalvos luego de su cosecha. La practica local en el comercio de bivalvos no conlleva refrigeracion lo que favorece el incremento en los numeros de Vibrio. Al igual que V. alginolyticus y V. parahaemolyticus, se les debe reconocer la importancia en su deteccion, tanto en las aguas como en los moluscos que se consumen en la zona, para que asi se puedan identificar y determinar su patogenicidad.

CONCLUSIONES

Diferentes especies de Vibrio de importancia clinica fueron aisladas de moluscos bivalvos, lo que indica que existen condiciones favorables para su habitat, por lo que se debe considerar su vinculacion con posibles infecciones adquiridas por el consumo de alimentos marinos crudos o mal cocidos o el riesgo de contraer enfermedades asociadas con el bano en aguas recreativas. Esta investigacion puede brindar informacion de caracter basico y aplicado para el perfeccionamiento de los sistemas de vigilancia de la calidad microbiologica del agua en las areas costeras del cualquier pais o territorio.

En las muestras de bivalvos se detecto la presencia de Vibrio cholerae no O1, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus, V. mimicus, V. metschnikovii y V. hollisae, observandose que la mayoria de las cepas correspondieron a V. alginolyticus seguida de V. parahaemolyticus.

Recibido: 25/10/2012. Aceptado: 19/07/ 2012.

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Daniel Munoz (1) *, Crucita Grau de Marin (2) , Hilda Marval (2) y Carlos Martinez (3) ([cruz])

(1) Liceo Bolivariano "Jose Silverio Gonzalez".

(2) Instituto Nacional de Investigaciones Agricolas (INIA Sucre/Nueva Esparta) -- Laboratorio de Microbiologia de Alimentos.

(3) Liceo Bolivariano Creacion "Tres Picos". * d_josem77@hotmail.com/danieljosemz@gmail.com
TABLA I

NUMERO DE CEPAS Y FRECUENCIA TOTAL DE AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEL
GENERO Vibrio EN LAS ZONAS DE MUESTREO, ESTADO SUCRE

Zona de muestreo       No de cepas   Frecuencia total (%)

Punta Patilla              119               26,0
Bahia Iglesia              117               25,6
Isla Lobos-Chacopata       122               26,6
Bahia Guiria               100               21,8

Total                      458               100

TABLA II

ABUNDANCIA RELATIVA DE ESPECIES DE Vibrio AISLADAS EN LOS MOLUSCOS
BIVALVOS PROCEDENTES DE LAS DISTINTAS ZONAS DE ESTUDIO

Zona de estudio                        Especie           No. (%) cepas
                                                          de vibrios

Punta Patilla                   Vibrio alginolyticus      57 (47,9)
(Mejillon: Perna spp.)         Vibrio parahaemolyticus    25 (21,0)
                                Vibrio cholerae no O1      10 (8,4)
                                   Vibrio mimicus          9 (7,6)
                                Vibrio metschnikovii       9 (7,6)
                                  Vibrio vulnificus        7 (5,9)
                                   Vibrio hollisae         2 (1,7)

Bahia Iglesia                   Vibrio alginolyticus      65 (55,6)
(Mejillon: Perna spp.)         Vibrio parahaemolyticus    29 (24,8)
                                Vibrio metschnikovii       7 (6,0)
                                 Vibrio vulnificus         6 (5,1)
                                   Vibrio mimicus          5 (4,3)
                                Vibrio cholerae no O1      4 (3,4)
                                   Vibrio hollisae         1 (0,9)

Isla Lobos (Chacopata)          Vibrio alginolyticus       72 (59)
(Pepitonas: Arca zebra)        Vibrio parahaemolyticus     28 (23)
                                   Vibrio mimicus          9 (7,4)
                                Vibrio metschnikovii       8 (6,6)
                                Vibrio cholerae no O1      4 (3,3)
                                   Vibrio hollisae         1 (0,8)

Bahia Guiria                    Vibrio alginolyticus      67 (67,0)
(Guacuco: Tivela mactroides)   Vibrio parahaemolyticus    22 (22,0)
                                Vibrio cholerae no O1      4 (4,0)
                                   Vibrio mimicus          4 (4,0)
                                Vibrio metschnikovii       4 (4,0)

TABLA III

PRUEBAS BIOQUIMICAS DIFERENCIALES REALIZADAS A LAS DISTINTAS CEPAS DE
Vibrio AISLADAS DE MOLUSCOS BIVALVOS

                           Especies identificadas
Pruebas
bioquimicas        V. alginolyticus   V. parahaemolyticus

Urea                      -                    V

Gelatinasa                +                    +

Voges-Proskauer           +                    -

N[O.sub.3.sup.-]          +                    +
[flecha diestra]
N[O.sub.2.sup.-]

Glucosa (a/g)            +/-                  +/-

Manitol                   +                    +

Arabinosa                 V                    +

Arginina                  -                    -

Lisina                    +                    +

Ornitina                  +                    +

Oxidasa                   +                    +

0% NaCl                   -                    -

3% NaCl                   +                    +

6% NaCl                   +                    +

8% NaCl                   +                    +

O/129 (10                 R                    R
[micron]g)

O/129 (150                S                    S
[micron]g)

                                 Especies identificadas
Pruebas
bioquimicas        V. cholerae no O1   V. mimicus   V. metschnikoviis

Urea                       -               -                -

Gelatinasa                 +               +                +

Voges-Proskauer            V               -                +

N[O.sub.3.sup.-]           +               +                -
[flecha diestra]
N[O.sub.2.sup.-]

Glucosa (a/g)             +/-             +/-              +/-

Manitol                    +               +                +

Arabinosa                  -               V                -

Arginina                   -               -                +

Lisina                     +               +                +

Ornitina                   +               +                -

Oxidasa                    +               +                -

0% NaCl                    +               +                -

3% NaCl                    +               +                +

6% NaCl                    -               -                +

8% NaCl                    -               -                V

O/129 (10                  S               S                S
[micron]g)

O/129 (150                 S               S                S
[micron]g)

                     Especies identificadas
Pruebas
bioquimicas        V. vulnificus   V. hollisae

Urea                     -              -

Gelatinasa               +              -

Voges-Proskauer          -              -

N[O.sub.3.sup.-]         +              +
[flecha diestra]
N[O.sub.2.sup.-]

Glucosa (a/g)           +/-            +/-

Manitol                  V              -

Arabinosa                -              +

Arginina                 -              -

Lisina                   +              -

Ornitina                 +              -

Oxidasa                  +              +

0% NaCl                  -              -

3% NaCl                  +              +

6% NaCl                  +              +

8% NaCl                  -              -

O/129 (10                S              R
[micron]g)

O/129 (150               S              S
[micron]g)

V: variable. NaCl: Cloruro de Sodio. N[O.sub.3.sup./] [flecha diestra]
N[O.sub.2.sup.-]: nitratos a nitritos. a/g: acido/gas. R: Resistente.
S: Sensible.
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Author:Munoz, Daniel; Grau de Marin, Crucita; Marval, Hilda; Martinez, Carlos
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Date:Sep 1, 2012
Words:5150
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