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INHIBITORY EFFECT in vitro OF EXTRACTS Cinnamomum zeylanicum BLUME IN CONTROL OF Cylindrocladium candelabrum/EFEITO INIBITORIO in vitro DE EXTRATOS DE Cinnamomum zeylanicum BLUME NO CONTROLE DE Cylindrocladium candelabrum.

INTRODUCAO

Atualmente, uma das principais causas de reducao da producao de eucalipto e a mancha e desfolha causada pelo parasitismo de Cylindrocladium candelabrum Viegas (SCHULTZ, 2011). Este fungo e nativo do Brasil e sobrevive saprofiticamente por meio de esclerodios no solo, disseminando-se no campo por meio de respingos de chuva com solo contendo inoculo para folhas e ramos do terco inferior da copa das arvores (FERREIRA, 1989; ALFENAS et al., 2009).

Segundo Santos, Auer e Grigoletti Junior (2001), a desfolha intensa pode ocorrer dependendo das condicoes ambientais favoraveis, afetando grande proporcao da copa das arvores. A ocorrencia desta doenca tem sido associada com temperaturas em torno de 26[degrees]C e umidade relativa superior a 80%, fatores climaticos que facilitam a infeccao do eucalipto (ALFENAS et al., 2009). Deste modo, quando as condicoes estao favoraveis ao desenvolvimento de Cylindrocladium candelabrum, o uso de fungicidas torna-se necessario (FERREIRA et al., 2006).

No entanto, alguns dos problemas associados a utilizacao de fungicidas sinteticos (agrotoxicos) para o controle de doencas em plantas incluem resistencia por parte dos fitopatogenos, contaminacao ambiental e danos a saude dos seres humanos e animais. Em funcao destas preocupacoes e da pressao exercida pela sociedade, houve um incentivo para que pesquisadores e produtores buscassem novos caminhos para o controle de doencas nas mais diferentes culturas (PAULA JUNIOR; PALLINI, 2005). Assim, uma das alternativas possiveis e o uso do controle alternativo no manejo fitossanitario com o uso de plantas medicinais e seus extratos.

Diversos estudos vem sendo desenvolvidos e direcionados para a descoberta de novos agentes antimicrobianos provenientes de extratos vegetais e outros produtos naturais, com o objetivo de descobrir compostos com atividade comparada a dos tradicionalmente utilizados, porem, com menor toxicidade, menor impacto ambiental e maior eficacia contra a resistencia de micro-organismos patogenicos (BONA et al., 2014).

Assim, as observacoes populares sobre o uso de plantas medicinais contribuem de forma relevante para as pesquisas, pois vem sendo a primeira fonte de informacao para que seja feita uma investigacao cientifica das propriedades medicinais de uma planta (ALFAIA; ALMEIDA, 2016).

Desta forma, nota-se a importancia da composicao quimica das plantas medicinais, por meio das substancias denominadas metabolitos secundarios, que atuam nas interacoes entre a especie vegetal e o fitopatogeno, ativando o sistema defensor da planta hospedeira ou diretamente sobre o desenvolvimento dos patogenos. Os metabolitos geralmente apresentam carater atoxico para os seres humanos, animais e meio ambiente, maior acao fungitoxica e menor fitotoxicidade quando comparados com os fungicidas sinteticos (STANGARLIN et al., 2011).

Nesse contexto, dentre as plantas que apresentam potencial fungicida ou antimicrobiano natural encontra-se a canela (Cinnamomum zeylanicum Blume), pertencente a familia Lauraceae. Trata-se de uma planta aromatica que, alem de apresentar atividade antifungica e antibacteriana, possui ainda propriedades antiespasmodica, carminativa, estimulante, tonica, digestiva, adstringente, afrodisiaca, antisseptica, antioxidante, aperiente, hipertensora, sedativa e vasodilatadora (SIMIC et al., 2004; LIMA et al., 2005; SILVA et al., 2012). Assim, o presente estudo objetivou avaliar a acao inibitoria in vitro dos extratos de Cinnamomum zeylanicum sobre o crescimento micelial do fitopatogeno Cylindrocladium candelabrum.

MATERIAL E METODOS

Caracterizacao da Area de Estudo

O estudo foi desenvolvido nos Laboratorios de Fitopatologia e Quimica Organica da Universidade do Estado do Amapa/UEAP, localizada no municipio de Macapa-AP.

Obtencao de Isolado

O isolado do fungo Cylindrocladium candelabrum foi obtido a partir da coleta de folhas de clone de eucalipto (Eucalyptus urophylla x E. grandis), oriundas do viveiro de plantio comercial da empresa Amapa Florestal e Celulose S. A./AMCEL, situado no municipio de Tartarugalzinho-AP, Brasil, que apresentavam sintomas caracteristicos da doenca.

Os procedimentos de isolamento constaram da desinfestacao superficial de fragmentos de tecidos lesionados com alcool 70% por um minuto, lavagem em solucao de hipoclorito de sodio a 2%, por dois minutos, e lavagem por tres vezes consecutivas em agua destilada esterilizada. Os fragmentos de tecidos foram acondicionados em placas de Petri contendo meio de cultura BDA (batata-dextrose-agar) e incubados por 10 dias a uma temperatura de 25[degrees]C sob fotoperiodo de 12h. Posteriormente, foi realizada a obtencao da cultura monosporica de acordo com a metodologia de Fernandes (1993) e identificacao do isolado.

Obtencao e preparo dos Extratos Brutos

A especie Cinnamomum zeylanicum foi coletada em area residencial no municipio de Macapa-AP. Folhas da planta foram secas em estufa com circulacao de ar, a uma temperatura de 45[degrees]C durante 48h. Os extratos brutos foram obtidos por percolacao com os solventes organicos hexano, acetato de etila ometanol, utilizando 500 gramas de folhas secas moidas em 1 litro de cada solvente por um periodo de tres dias. Apos esse periodo cada solucao foi submetida a evaporacao dos solventes, utilizando-se evaporador rotativo para completa eliminacao do solvente, obtendo-se assim os respectivos extratos Brutos: Extrato Bruto Hexanico (EBH), Extrato Bruto em Acetato de Etila (EBAcoEt) e Extrato Bruto Metanolico (EBM).

Estudo fitoquimico

Apos a obtencao dos extratos brutos de Cinnamomum zeylanicum foi realizada a analise dos compostos fitoquimicos presentes em cada um deles, de acordo com o Manual para Analise Fitoquimica e Cromatografica de Extratos Vegetais de Barbosa et al. (2001). Os metabolitos secundarios analisados foram: polissacarideos, acucares redutores, fenois, taninos, antraquinonas, esteroides, triterpenoides, alcaloides, saponina espumidica e flavonoides.

Avaliacao da acao inibitoria no crescimento micelial

Para a avaliacao in vitro do crescimento micelial do isolado de Cylindrocladium candelabrum sob acao dos extratos brutos de Cinnamomum zeylanicum (EBH, EBAcoEt ou EBM) adaptou-se a metodologia de Jesus et al. (2000), em que concentracoes de 5 mg.[mL.sup.-1], 10 mg.[mL.sup.-1] ou 20 mg.[mL.sup.-1] de cada extrato (tratamentos) foram adicionadas no meio de cultura BDA (autoclavado) e distribuidos em placas de Petri (9 cm).

Apos a solidificacao do meio, um disco de 0,5 cm de diametro contendo micelio de Cylindrocladium candelabrum, com 10 dias de incubacao, foi transferido para o centro das placas contendo os tratamentos. Em seguida, as mesmas foram seladas com papel aderente, identificadas e incubadas em estufa do tipo BOD sob fotoperiodo de 12h a temperatura de 25[degrees]C. No tratamento-testemunha (controle negativo), nao se adicionou nenhum tipo de produto ao meio de cultura e no tratamento com fungicida adicionou-se 5 mL de Clorotalonil ao meio BDA (controle positivo).

A avaliacao do experimento iniciou 24h apos sua instalacao, realizando-se medicoes ortogonais do diametro das colonias diariamente, durante sete dias. Cada medicao correspondeu a media de duas medidas diametralmente opostas da colonia fungica, com uma regua milimetrada.

Analise estatistica

Para a montagem do experimento, utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado (DIC) em esquema fatorial 3x3+2, (tres extratos brutos de canela, tres concentracoes e duas testemunhas adicionais (controles positivo e negativo)) com seis repeticoes para cada tratamento, sendo cada repeticao constituida por uma placa de Petri.

Para realizar a analise estatistica utilizou-se o software estatistico Assistat 7.7 beta. Os dados da avaliacao in vitro do potencial inibitorio dos extratos brutos sobre o crescimento micelial foram submetidos ao teste de Bartlett (p < 0,05), a fim de verificar a condicao de homogeneidade de variancia e ao teste de Shapiro-Wilk para verificar a normalidade dos dados. Os dados que nao apresentaram homogeneidade e normalidade de variancia foram transformados por arcsen (x/100) + 0,5. Em seguida, realizou-se a analise de variancia (ANOVA) (p < 0,05) e aplicou-se o teste de Tukey (p < 0,05).

RESULTADOS E DISCUSSAO

Estudo fitoquimico

Obteve-se um rendimento dos extratos brutos das folhas de Cinnamomum zeylanicum de aproximadamente 1,03% para o EBH, 1,02% para EBAcoEt e 1,07% para EBM, calculado em relacao a massa da planta seca. A analise fitoquimica possibilitou a determinacao dos metabolitos secundarios analisados, sendo que dos dez metabolitos secundarios (Tabela 1), quatro estavam presentes em EBH e EBAcoEt (acucares redutores, fenois, taninos, esteroides, triterpenoides e alcaloides), enquanto para o EBM, sete compostos reagiram positivamente nas analises (acucares redutores, fenois, taninos, antraquinonas, saponinas espumidicas, alcaloides e flavonoides).

Atualmente, a funcao natural de muitos metabolitos secundarios tem sido investigada com maior tenacidade, sendo reconhecida que estas sao, de fato, essenciais para a existencia dos vegetais e em diversas aplicacoes biotecnologicas (ALFAIA; ALMEIDA, 2016). Assim, a maior aplicacao biologica dos extratos e oleos essenciais ocorre como agentes antimicrobianos. Essa capacidade, presente na maioria desses compostos, de certa maneira, ira representar uma extensao do proprio papel que exercem nas plantas, defendendo-as das bacterias e fungos fitopatogenicos. O modo de acao que provoca a inibicao de micro-organismos atraves de seus compostos quimicos, envolve diferentes mecanismos, dependendo dos componentes majoritarios (SOUZA et al., 2005).

Em seu estudo, Pereira (2006) constatou que, entre os metabolitos secundarios, os principais grupos de compostos encontrados com maior atividade biologica sao os alcaloides, flavonoides, cumarinas, taninos, quinonas, oleos essenciais. Ja Orlando, Silva e Parreira (2006) encontraram em Cinnamomum zeylanicum proteinas, aminoacidos, taninos, esteroides e triterpenoides, carotenoides, purina, saponina espumidica. Corroborando alguns dos compostos encontrados no presente estudo. Desta maneira, nota-se que os extratos e oleos essenciais possuem uma quantidade variavel de substancias, sendo comum acontecer o predominio de um ou dois compostos. A atividade antimicrobiana pode estar associada a presenca de um destes compostos ou a acao sinergica (sinergismo) de dois ou mais compostos presentes (SILVA; BASTOS, 2007; CRUZ et al., 2015). Neste sentindo, os compostos encontrados nas plantas podem atuar isolada ou conjuntamente para a inibicao do crescimento micelial dos fitopatogenos, apresentando ainda composicao quimica diferente (GOMES, 2016).

Assim, variacoes na eficiencia entre extratos e oleos estao associadas ainda a diversos fatores como tipo de solvente e metodologia empregada no processo de extracao, fisiologia inerentes a planta (fase de desenvolvimento, ciclo de polinizacao, variacoes sazonais, condicoes de estresse da planta), condicoes ambientais tais como clima, poluicao atmosferica, caracteristicas do solo, luminosidade, temperatura, pluviosidade, nutricao, epoca e horario de coleta, variacoes geograficas, interacoes entre plantas, planta e micro-organismos, e plantas e insetos (GOBBO-NETO; LOPES, 2007; MORAIS, 2009).

Avaliacao da acao inibitoria no crescimento micelial

Na avaliacao da acao inibitoria dos extratos vegetais de canela sobre Cylindrocladium candelabrum, constatou-se que todas as concentracoes dos extratos brutos apresentaram diferencas estatisticas significativas com relacao aos controles (positivo e negativo), ou seja, quanto maior a concentracao de extrato bruto utilizado maior foi seu efeito inibitorio sobre o fitopatogeno. O EBM, na concentracao de 20 mg.[mL.sup.-1] foi o que melhor inibiu o crescimento micelial do fitopatogeno, apresentando 3,28 cm com 45,28% de inibicao. No tratamento com EBM foi possivel observar ainda que nao houve diferenca estatistica no crescimento micelial entre as concentracoes de 5 e 10 mg.[mL.sup.-1], tendo estas o mesmo efeito sobre a inibicao do crescimento do fungo (Tabela 2).

O fungicida Clorotalonil (3,24 cm), utilizado como controle positivo, foi eficiente e superior em relacao a grande parte das concentracoes dos extratos na inibicao do crescimento do fitopatogeno. No entanto, foi observado que o EBM (3,28 cm) igualou-se estatisticamente ao efeito de tal fungicida na concentracao de 20 mg.[mL.sup.-1] (Tabela 2, Figura 1). Sendo assim, a eficiencia do EBM em relacao aos demais extratos brutos pode estar associada a alta capacidade de seu extrator e/ou solvente, neste caso o metanol, em extrair substancias que possuem um grande poder antimicrobiano.

De acordo com Bakkali et al. (2008) e Costa et al. (2011), a atividade antifungica dos extratos e oleos essenciais esta relacionada a sua propriedade hidrofobica, o que significa que ao entrar em contato com o fungo, os componentes do extrato ou oleo interagem com a mitocondria e com os lipideos da membrana plasmatica, alterando sua permeabilidade, causando disturbios estruturais, o que pode promover a exposicao do conteudo celular, inclusive do nucleo. O que vem explicar o efeito de inibicao dos extratos brutos utilizados neste estudo.

Observa-se que, neste estudo, houve diferenca na inibicao do crescimento micelial de Cylindrocladium candelabrum quando submetido aos diferentes extratos brutos. Segundo Morais, Catini e Castanha (2014), isto e explicado por meio da variabilidade de substancias encontradas e ainda pela diferenca de polaridade entre os solventes organicos utilizados para preparar os extratos. Assim, e possivel que a maior inibicao do crescimento micelial seja resultado da maior quantidade de compostos secundarios presentes no extrato de metanol, devido a maior afinidade dos compostos ativos em Cinnamomum zeylanicum com este solvente.

Sendo assim, notou-se que o EBM foi o unico que obteve a presenca de flavonoides e saponinas espumidicas em sua composicao (Tabela 1), o que pode explicar sua maior eficacia no controle do fitopatogeno. De acordo com Simoes (2010), a atividade biologica dos flavonoides e bastante ampla, dentre elas pode-se citar atividade antioxidante, antiviral e atividade sobre a permeabilidade capilar. Ja o comportamento anfifilico das saponinas e a capacidade de formar complexo com esteroides, proteinas e fosfolipidios de membranas determinam um numero variado de propriedades biologicas para essas substancias, destacando-se a acao sobre membranas celulares, alterando sua permeabilidade, ou causando sua destruicao.

A atividade antimicrobiana de Cinnamomum zeylanicum ja foi avaliada in vitro diante de diferentes especies de micro-organismos em diversos estudos, no entanto, nao foram encontrados estudos com o enfoque no patossistema Cylindrocladium candelabrum X Eucalyptus spp. Assim, Jham (2005) testou a fungitoxidez de Cinnamomum zeylanicum contra os patogenos Aspergillus flavus e Aspergillus ruber, sendo que o extrato de hexano e o oleo obtido por meio de hidrodestilacao da casca da planta inibiram completamente o crescimento micelial dos fitopatogenos a partir das concentracoes de 300 e 100 [micro]l.[L.sup.-1], respectivamente. Dias et al. (2010) que avaliaram o EBM de Cinnamomum zeylanicum nas concentracoes de 10, 30 e 50 mg.[mL.sup.-1], constataram que o extrato se mostrou eficiente no controle dos fitopatogenos Cladosporium cladosporioides e Colletotrichum lindemunthianum, sendo o patogeno Cladosporium cladosporioides mais suscetivel a acao do extrato. Em seu trabalho, Yeole et al. (2014) estudando o efeito inibitorio dos extratos brutos hexanicos (EBH) e metanolicos (EBM) de Cinnamomum zeylanicum observaram que os mesmos inibiram completamente o crescimento de Alternaria solani.

Assim, os resultados mencionados corroboram os obtidos neste estudo, evidenciando o potencial dos extratos brutos de canela para o manejo de doencas fungicas, em particular para o controle de Cylindrocladium candelabrum, agente causal de doencas na cultura do eucalipto.

CONCLUSAO

De acordo com resultados verificou-se que as classes de metabolitos secundarios variaram entre os extratos brutos. Dos dez metabolitos secundarios analisados, quatro foram encontrados no EBH e EBAcoEt (acucares redutores, fenois, taninos, esteroides, triterpenoides e alcaloides). Sete compostos foram identificados para o EBM (acucares redutores, fenois, taninos, antraquinonas, saponinas espumidicas, alcaloides e flavonoides). Alem disso, constatou-se que tais extratos brutos apresentaram atividade antifungica significativa, sendo recomendavel a continuacao do estudo fitoquimico e antimicrobiano de Cinnamomum zeylanicum, considerando a perspectiva para aplicacao dos resultados deste trabalho na elaboracao de produtos fitossanitarios naturais para o manejo integrado de doencas de plantas com enfoque para o patossistema Cylindrocladium candelabrum X Eucalyptus spp.

DOI: http://dx.doi.org/10.5902/1980509835103

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq pela concessao da bolsa, as UEAP e UNIFAP pelo espaco e infraestrutura cedidos e a AMCEL pelo material vegetal fornecido.

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Ediellen Mayara Correa Gomes (1) Anderson Vasconcelos Firmino (2) Rosangela da Conceicao Marques Pena (3) Sheylla Susan Moreira da Silva de Almeida (4)

(1) Engenheira Florestal, MSc., Consultora Ambiental, Instituto Tempo e Vida--ITEV, Av. Custodio Silva, 1022 sala 102, Bairro Central, CEP 35430-026, Ponte Nova (MG), Brasil. ediellengomes@yahoo.com.br

(2) Engenheiro Florestal, MSc., Gerente de Meio Ambiente e Recursos Hidricos, Companhia de Agua e Esgoto do Amapa, Av. Ernestino Borges, 222, Bairro Trem, CEP 68908-010, Macapa (AP), Brasil. andersonvasconcelos11@ yahoo.com.br.

(3) Engenheira Agronoma, MSc., Gestora Tecnica e Administrativa, Instituto Tempo e Vida--ITEV, Av. Custodio Silva, 1022 sala 102, Bairro Central, CEP 35430-026, Ponte Nova (MG), Brasil. itev@itev.org.br

(4) Farmaceutica, Dra., Professora da Universidade Federal do Amapa, Laboratorio de Farmacognosia, Rod. Juscelino Kubitschek, KM-02, Bairro Jardim Marco Zero, CEP 68900-000, Macapa (AP), Brasil. sheyllasusan@yahoo.com. br

Recebido para publicacao em 1/05/2014 e aceito em 30/01/2018

Caption: FIGURE 1: Mycelial growth of Cylindrocladium candelabrum, after 7 days, under treatments with Cinnamomum zeylanicum crude extracts: EBH = Hexanic Crude Extract; EBAcoEt = Ethyl Acetate Crude Extract; EBM = Metanolic crude extract; Negative Control= only culture medium; Positive Control= Fungicide Chlorothalonil.

FIGURA 1: Crescimento micelial de Cylindrocladium candelabrum, aos 7 dias de avaliacao, sob os tratamentos com extratos brutos de Cinnamomum zeylanicum: EBH = Extrato Bruto Hexanico; EBAcoEt = Extrato Bruto em Acetato de Etila; EBM = Extrato Bruto Metanolico; Controle Negativo = somente meio de cultura; Controle Positivo = Fungicida Clorotalonil.
TABLE 1: Phytochemical composition of Cinnamomum zeylanicum crude
extracts.

TABELA 1: Composicao fitoquimica de Extratos Brutos de Cinnamomum
zeylanicum.

      Compostos                 Extratos Brutos (1)

                           EBH       EBAcoEt       EBM

Polissacarideos             -           -           -
Acucares Redutores          +           +           +
Fenois                      +           +           +
Taninos                     +           +           +
Antraquinonas               -           -           +
Esteroides                  +           +           -
Triterpenoides              +           +           -
Saponina espumidica         -           -           +
Alcaloides                  +           +           +
Flavonoides                 -           -           +

Em que: (1) EBH = Extrato Bruto Hexanico; EBAcoEt = Extrato Bruto em
Acetato de Etila; EBM = Extrato Bruto Metanolico; + = resultado
positivo; - = resultado negativo.

TABLE 2: Effect of Cinnamomum zeylanicum crude extracts in
inhibiting mycelial growth of Cylindrocladium candelabrum.

TABELA 2: Efeito dos extratos brutos de Cinnamomum zeylanicum na
inibicao do crescimento micelial de Cylindrocladium candelabrum.

Concentracoes              Crescimento Micelial (cm)
(mg.[mL.sup.-1])
                      EBH (1)      EBAcoEt        EBM

5                     4,30 aA      3,92 aB      3,55 aB
10                    3,54 bB      3,90 aA      3,54 aB
20                    3,46 cB      3,73 bA      3,28 bC
Controle Positivo                  3,24 dcC
Controle Negativo                  6,00 edD

Em que: (1) EBH = Extrato Bruto Hexanico; EBAcoEt = Extrato Bruto em
Acetato de Etila; EBM = Extrato Bruto Metanolico. Letras maiusculas
iguais indicam que nao houve diferenca estatistica no fungo dentro
da mesma concentracao nos diferentes tratamentos e letras minusculas
iguais indicam que nao houve diferenca estatistica entre as
concentracoes de um mesmo tratamento pelo teste de Tukey em nivel de
5% de probabilidade.
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Author:Gomes, Ediellen Mayara Correa; Firmino, Anderson Vasconcelos; Pena, Rosangela da Conceicao Marques;
Publication:Ciencia Florestal
Date:Oct 1, 2018
Words:3729
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