INFLUENCIA DA ERITROPOETINA HUMANA RECOMBINANTE SOBRE CONCENTRACOES DE LACTATO EM ANIMAIS TREINADOS.
INTRODUCAOA eritropoetina humana recombinante (rHuEPO) e uma glicoproteina altamente purificada, composta por uma sequencia de aminoacidos identica a da eritropoetina (EPO) endogena (Jacobs e colaboradores, 1985).
Esta substancia tornou-se comercialmente disponivel a partir de 1988 (Choi e colaboradores, 1996) e foi oficialmente proibida pelo Comite Olimpico Internacional (COI) em 1990 (Cazzola, 2002).
Em virtude da dificuldade de deteccao e diferenciacao entre a rHuEPO e a EPO endogena, bem como do uso da tecnica natural de hipoxia intermitente, que desencadeia aumento da producao de EPO no organismo (Balestra e Germonpre, 2010), este hormonio recombinante passou a ser utilizado de forma indiscriminada por atletas (Magnani e colaboradores, 2001) com o objetivo de melhorar o desempenho fisico (Cazzola, 2002).
Alem dos efeitos classicos relacionados ao estimulo a eritropoiese, os estudos tem demonstrado que a administracao subcutanea de rHuEPO, em diferentes doses, pode potencializar a capacidade aerobia de humanos (Audran e colaboradores, 1999; Juel e colaboradores, 2007), explicada principalmente pelo aumento da oferta de [O.sub.2] para os musculos ativos.
No entanto, ha relatos de que este tratamento pode tambem influenciar o sistema anaerobio, por meio de alteracoes relacionadas as concentracoes de lactato no sangue (Connes e colaboradores, 2004; Lavoie e colaboradores, 1998; Meierhenrich e colaboradores, 1996).
Alguns estudos observaram reducoes dos niveis de lactato sanguineo durante o exercicio fisico em pacientes em hemodialise e atletas recreacionais tratados com rHuEPO (Meierhenrich e colaboradores, 1996; Russell e colaboradores, 2002).
Isto pode ser explicado pelas diferentes modificacoes fisiologicas e biologicas no musculo, incluindo as alteracoes no transporte de lactato, realizadas pelos transportadores monocarboxilatos 1 e 4 e nos eritrocitos, que poderao funcionar como um compartimento de diluicao deste substrato durante o exercicio, reduzindo seu acumulo e a acidose (Connes e colaboradores, 2004; Juel e colaboradores, 2003).
Assim, estas adaptacoes tambem podem explicar o desempenho fisico aerobio maximizado, pelo fato de que o acumulo de lactato representa uma das principais causas da fadiga muscular, limitando inclusive a condicao fisica em exercicios de longa duracao (Freitas e colaboradores, 2010; Khanna e Manna, 2005).
Neste contexto, um melhor entendimento dos efeitos da rHuEPO sobre este substrato pode ajudar inclusive a estabelecer medidas preventivas e novas estrategicas de deteccao de doping (Connes e colaboradores, 2004).
E importante destacar que apesar das novas descobertas relacionadas aos efeitos da rHuEPO sobre variaveis que determinam o desempenho fisico, os resultados de que o hormonio promova de fato, adaptacoes no metabolismo do lactato sanguineo, ainda sao inconclusivos.
Desta forma, o presente estudo objetivou verificar se o tratamento com rHuEPO pode modificar a concentracao do lactato sanguineo e tempo de exaustao, em ratos submetidos ao treinamento aerobio com natacao.
MATERIAIS E METODOS
Modelo experimental
O presente estudo foi realizado baseando-se nos Principios Eticos de Experimentacao Animal adotado pelo Colegio Brasileiro de Experimentacao Animal (COBEA), o qual foi aprovado pela Comissao de Etica no uso de Animais (CEUA), da Universidade do Vale do Paraiba (Protocolo de no A032/CEUA/2011).
Foram utilizados 20 ratos Wistar machos, com peso corporal de 304 [+ o -] 8 gramas (Media [+ o -] DP), divididos aleatoriamente nos seguintes grupos: sedentario (S) (n=6), treinado (T) (n=7) e treinado + rHuEPO (T+rHuEPO) (n=7). Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas, com acesso a racao e agua ad libitum, no bioterio do Laboratorio de Fisiologia e Farmacologia do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D), da Universidade do Vale do Paraiba (UNIVAP), em temperatura de 22[grados] a 25[grados] C, umidade relativa e luminosidade controlada (Ciclo claro/escuro de12 horas).
Protocolo de treinamento fisico
Com o intuito de reduzir o estresse desencadeado pelo exercicio fisico, os animais foram previamente adaptados em meio liquido durante cinco dias (Gobatto e colaboradores, 2001).
O treinamento aerobio foi realizado durante seis semanas, incluindo cinco sessoes de treino por semana, com 30 min de duracao em cada uma delas. A intensidade do treinamento foi determinada pelo TCM, conforme descrito no estudo de Caetano Junior e colaboradores (2013).
Administracao de eritropoetina humana recombinante
A rHuEPO (Eritromax[R] Blausiegel) foi administrada por via subcutanea, na regiao dorsal (nuca), em tres dias de cada semana, durante seis semanas. A dose administrada foi de 50UI/Kg nas tres primeiras semanas e 20UI/Kg nas tres ultimas. Quinzenalmente os animais receberam por via oral, 2,4 mg de ferro. Optou-se por este protocolo, pelo fato de grande parte dos estudos relacionados ao desempenho esportivo utilizar essas dosagens similares (Audran e colaboradores, 1999; Juel e colaboradores, 2007; Poux e colaboradores, 1995; Russell e colaboradores, 2002).
Analise da concentracao sanguinea de lactato
Ao final do protocolo experimental, os animais foram submetidos individualmente, a um teste de esforco fisico continuo de natacao com sobrecarga de 8% do peso corporal. O sangue (25[micro]L) foi coletado pela porcao distal da cauda de cada animal, em repouso, aos 10 e 20 min. (Gobatto e colaboradores, 2001) e colocado em tiras-teste (BMLactate[R]) para quantificacao do lactato, atraves de um analisador portatil Accutrend[R] Lactate.
Coleta sanguinea
Para avaliacao da serie vermelha do sangue os animais, 24 horas apos o teste de lactacidemia, foram anestesiados com 50 mg/[Kg.sup.-1] de Ketamina (Cetamin 10%, 50 mL; Syntec do Brasil Ltda.) e 40 mg/[Kg.sup.-1] de xilazina (Xilazin 2%, 50 mL; Syntec do Brasil Ltda., Sao Paulo, Brazil), por via intramuscular.
O sangue foi coletado (0,5 mL por animal) por puncao cardiaca, armazenado em tubo com EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) e levado, sob refrigeracao, para analise hematologica automatica. Em seguida, os animais foram sacrificados, por meio de injecao intracardiaca de cloreto de potassio (KCl) a 20%.
As amostras de sangue foram homogeneizadas por cinco min. (AP22, Phoenix), em seguida, foram analisadas por 30 min., utilizando um analisador hematologico automatico (BC-2800Vet, Mindray[R], Nanshan, China), para avaliacao do numero de eritrocitos e concentracao de Hb.
Analise estatistica
Incialmente, os resultados foram submetidos a analise de normalidade pelo teste de Kolmogorov Smirnov (KS). Para a comparacao entre grupos, utilizou-se a analise de variancia ANOVA (One Way) e o teste de Tukey. Os valores foram expressos em media [+ o -] desvio padrao (DP) e o nivel de significancia adotado foi de P<0,05.
RESULTADOS
Na tabela 1 sao apresentados os valores (media [+ o -] DP) de eritrocitos e concentracao de Hb dos tres grupos estudados. De acordo com os resultados obtidos, observa-se que nao houve diferenca significativa entre os diferentes grupos experimentais.
Os valores da concentracao de lactato sanguineo, durante teste de esforco com sobrecarga de 8% do peso corporal (Figura 1), mostraram um aumento significativo dos valores obtidos em 10 e 20 min. comparados as concentracoes em repouso do S (2,1 [+ o -] 0,3 mmol/L; 7,2 [+ o -] 0,3 mmol/L; 9,1 [+ o -] 0,4 mmol/L; P<0,001).
As concentracoes de lactato em repouso do T (1,9 [+ o -] 0,2 mmol/L), tambem foram significativamente diferentes em relacao aos tempos de 10 (6,1 [+ o -] 0,6 mmol/L; P<0,001) e 20 min. (6,4 [+ o -] 0,6 mmol/L; P<0,001), o mesmo observado entre as concentracoes do T+rHuEPO em repouso (2,0 [+ o -] 0,3 mmol/L), comparada aos 10 min. (5,4 [+ o -] 0,4 mmol/L; P<0,001) e 20 min. (5,6 [+ o -] 0,3 mmol/L; P<0,001).
Ainda com relacao a concentracao sanguinea de lactato, os valores coletados em 10 min. do S foram significativamente diferentes dos valores dos T e T+HuEPO (P<0,05), bem como entre os valores obtidos em 20 min. do S vs T e T+HuEPO (P<0,05). Nao houve diferenca significativa entre as concentracoes de lactato em repouso, dos respectivos grupos.
Os tempos de exaustao registrados apos protocolo de natacao com sobrecarga de 8% do peso corporal de cada animal estao descritos na figura 2.
O T+rHuEPO apresentou um tempo de exaustao significativamente maior (57,9 [+ o -] 4,0 min.) do que o T (40,7 [+ o -] 3,1 min.) (P<0,01). Ambos os grupos apresentaram tempos significativamente superior ao do S (21,7 [+ o -] 0,7 min.) (P<0,01).
DISCUSSAO
Com o objetivo de verificar as alteracoes do lactato sanguineo e da resistencia fisica aerobia de ratos treinados e tratados com rHuEPO, pode-se observar que o tratamento influenciou ambas as variaveis, sem necessariamente aumentar significativamente os globulos vermelhos no sangue.
Os valores de eritrocitos e de Hb dos grupos T e T+rHuEPO, apesar de nao significativos, foram superiores aos valores do grupo S. Assim, pelo fato de nao haver diferenca entre o T e T+rHuEPO, pressupoe que este aumento se deva exclusivamente ao treinamento fisico aerobio, conforme mostrado em outros estudos, utilizando animais treinados em esteira (Baker e colaboradores, 2011; Martinez-Bello e colaboradores, 2011).
E importante destacar que a intensidade do treinamento, determinada pela carga, volume e frequencia das sessoes de treino, promove diferentes efeitos no organismo, podendo modificar ou nao o numero de eritrocitos e de Hb no sangue de acordo com a intensidade com e executado.
Nascimento e colaboradores (2004), por exemplo, mostraram que a serie vermelha do sangue de ratos nao foi modificada, apos seis semanas de natacao, com 45 min./dia e sobrecarga de ate 3% do peso corporal. Alem disso, ha relatos de que o treinamento excessivo, com inadequados periodos de recuperacao pode levar a um estado de overtraining reduzindo os niveis de Hb no sangue (Ru e Peijie, 2009).
Grande parte dos estudos encontrados na literatura, utilizando diferentes protocolos experimentais de administracao da rHuEPO (Audran e colaboradores, 1999; Durussel e colaboradores, 2013; Thomsen e colaboradores, 2007), mostra que o hormonio aumenta significativamente a serie vermelha do sangue. Assim como encontrado no presente estudo, os autores tambem nao observaram aumento significativo de componentes sanguineos em individuos saudaveis ate a sexta semana de tratamento com rHuEPO (65UI/Kg) (Robach e colaboradores, 2009). E importante ressaltar que em virtude da carencia de estudos associando o treinamento fisico sistematizado juntamente com o tratamento com rHuEPO, a explicacao e discussao para este achado foi dificultada.
Em relacao a resposta do lactato sanguineo e da resistencia fisica dos animais, verificou que o treinamento fisico aerobio proposto foi tambem responsavel por influenciar o metabolismo do lactato, evidenciado nas concentracoes significativamente menores do T comparado ao S, bem como pela diferenca nao significativa encontrada entre T e T+rHuEPO (Figura 1).
Os resultados estao de acordo com a literatura, que aponta o treinamento fisico aerobio, como sendo um dos principais estimulos para modificar o metabolismo do lactato no sangue, podendo reduzir sua producao e/ou aumentar sua remocao (Freitas e colaboradores, 2010; Macrae e colaboradores, 1992).
Alguns estudos utilizando diferentes protocolos de treinamento com natacao encontraram reducao de lactato sanguineo em animais, Freitas e colaboradores (2010), por exemplo, submeteram animais a sessoes diarias de natacao, por 30 min., sem sobrecarga, durante seis semanas e verificaram que a concentracao de lactato dos animais treinados estabilizou-se em 3,8 [+ o -] 0,4 mmol/L e 6,2 [+ o -] 0,56 mmol/L, nos testes de esforco sem sobrecarga e com sobrecarga a 5% do peso corporal, respectivamente. Gobatto e colaboradores (2001), por sua vez, apos treinamento com natacao de 9 semanas (sobrecarga de 8% - peso corporal/60 min. dia), observaram uma estabilizacao da concentracao de lactato sanguineo (5,5 mmol/L), nos animais treinados aos 10 e 20 min., durante teste de esforco a 8% do peso corporal.
Em relacao a influencia do tratamento com rHuEPO sobre o metabolismo do lactato sanguineo, verificou-se que as alteracoes de lactato apresentadas pelo T+rHuEPO, sao decorrentes do treinamento fisico aerobio, como discutido anteriormente. Estes resultados diferem de alguns relatos da literatura, os quais verificaram tais efeitos pelo tratamento com o hormonio (Connes e colaboradores, 2004; Meierhenrich e colaboradores, 1996). Russel e colaboradores (2002), por exemplo, observaram em atletas submetidos a exercicios com intensidades variando de 60% a 100% do V[O.sub.2max], menores concentracoes de lactato, apos oito semanas de tratamento com rHuEPO, sendo as tres primeiras a 50 UI/Kg e as cinco ultimas a 20 UI/Kg.
Um fator que ajuda a explicar esta divergencia e que os mesmos autores (Russell e colaboradores, 2002), verificaram aumento de hematocrito nos grupos tratados.
Alguns estudos tem demonstrado que a rHuEPO pode elevar o transporte intracelular de lactato para o intersticio dos eritrocitos, mediado por transportadores monocarboxilato 1 e 4 nos eritrocitos, bem como pode intensificar a capacidade destas celulas em funcionar como compartimento de diluicao deste substrato durante o exercicio, reduzindo seu acumulo e a acidose (Connes e colaboradores, 2004; Juel e colaboradores, 2003).
Os valores de tempo exaustao mostraram que os protocolos de treinamento fisico aerobio e de tratamento com rHuEPO, potencializaram o desempenho fisico dos animais. O T foi significativamente diferente do S, enquanto que o T+rHuEPO diferenciou significativamente (P<0,01) dos demais grupos (Figura 2).
Este achado corrobora com outros estudos, os quais encontraram aumento do tempo de exaustao e do V[O.sub.2max] em individuos submetidos ao mesmo tipo de tratamento (Juel e colaboradores, 2007; Russell e colaboradores, 2002; Thomsen e colaboradores, 2007).
Os resultados tambem mostraram que o tratamento com rHuEPO pode contribuir para o aumento do desempenho fisico dos animais, concomitante a niveis de eritrocitos, Hb e lactato similares aos de animais somente treinados. Apesar da pequena diferenca encontrada entre as concentracoes de lactato do T+rHuEPO e T, os componentes sanguineos analisados nao podem explicar o tempo de exaustao significativamente prolongado dos animais tratados. Isto sugere que os efeitos deste hormonio recombinante vao alem daqueles relacionados aos globulos vermelhos no sangue (Cayla e colaboradores, 1992; Robach e colaboradores, 2009) e as concentracoes sanguineas de lactato (Freitas e colaboradores, 2010; Lavoie e colaboradores, 1998).
Ha relatos de que o tratamento com rHuEPO pode influenciar proteinas musculares (Juel e colaboradores, 2007; Lundby e colaboradores, 2008), aumentar da concentracao de acidos graxos livres e glicogenio muscular (Lavoie e colaboradores, 1998), e ainda, pode promover efeitos neurais, potencializando o desempenho fisico, sem necessariamente alterar a producao de celulas vermelhas do sangue (Schuler e colaboradores, 2012).
Neste sentido, sugere-se novos estudos associando o tratamento com rHuEPO e exercicio fisico, envolvendo inclusive outras variaveis que ajudam a explicar mais precisamente a melhora do desempenho esportivo por meio deste tratamento.
CONCLUSAO
Pode-se concluir que o treinamento fisico apresenta-se como um dos principais estimulos capaz de reduzir as concentracoes de lactato sanguineo, e ainda, que o tratamento com rHuEPO potencializa consideravelmente o desempenho fisico de animais treinados, sem necessariamente alterar significativamente os niveis de eritrocitos, Hb e lactato sanguineo.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a Coordenacao de Aperfeicoamento Pessoal de Nivel Superior - CAPES.
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Paulo Cesar Caetano Junior (1), Lia Campos Lemes (2) Silvia Regina Ribeiro (3), Tatiana Sousa Cunha (4) Rodolfo de Paula Vieira (5), Wellington Ribeiro (2)
(1-) Universidade Paulista (UNIP), Sao Jose dos Campos-SP, Brasil.
(2-) Universidade do Vale do Paraiba (UNIVAP), Sao Jose dos Campos-SP, Brasil.
(3-) Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG), Ponta Grossa-PR, Brasil.
(4-) Universidade Federal de Sao Paulo (UNIFESP), Sao Jose dos Campos-SP, Brasil.
(5-) Instituto Brasileiro Ensino/Pesquisa em Imunologia Pulmonar e do Exercicio, Sao Jose dos Campos-SP, Brasil.
E-mails dos autores:
paulocaetanoj@hotmail.com
sta.branca@hotmail.com
sribeiro2908@gmail.com
ts.cunha@unifesp.br
rodrelena@yahoo.com.br
gton@univap.br
Endereco para correspondencia:
Paulo Cesar Caetano Junior
Universidade Paulista (UniP).
Departamento de Educacao Fisica.
Rod. Presidente Dutra, km 157,5 - Pista Sul. Sao Jose dos Campos-SP, Brasil.
CEP: 12240-420.
Recebido para publicacao 14/07/2017
Aceito em 27/11/2017
Tabela 1 - Valores sanguineos de eritrocitos ([10.sup.6]/[micro]L) e de
hemoglobina (g/dL) de ratos sedentarios (S), somente treinados (T) e
treinados e tratados com rHuEPO (T+ rHuEPO), durante seis semanas.
Grupos Eritrocitos Hemoglobina (g/dL)
([10.sup.6]/[micro]L)
S 8,1 [+ o -] 0,7 12,7 [+ o -] 0,4
T 8,6 [+ o -] 0,3 13,1 [+ o -] 0,7
T+rHuEPO 8,6 [+ o -] 0,7 13,3 [+ o -] 0,7
Legenda: Valores expressos em media [+ o -] DP. Nao houve diferenca
significativa entre os respectivos grupos experimentais.
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