Printer Friendly

INFLAMATUAR BARSAK HASTALIGI OLAN HASTALARDA BLASTOCYSTIS SPP.'NIN FARKLI TANI YONTEMLERI ILE ARASTIRILMASI VE GENOTIPLENDIRILMESI/EVALUATION OF BLASTOCYSTIS SPP. AMONG INFLAMMATORY BOWEL DISEASE PATIENTS WITH DIFFERENT DIAGNOSTIC METHODS AND SUBTYPE ANALYSES.

OZET

Amac: Blastocystis spp; fekal-oral yolla ozellikle kotu hijyen kosullarinda bulasan, tum dunyada yaygin bir protozoondur. Enfeksiyon asemptomatik seyredebildigi gibi karin agrisi, kabizlik, bulanti gibi gastrointestinal semptomlara neden olabilmektedir. Blastocystis spp. 'nin barsakta cesitli patolojilere neden olabilecegi, inflamatuar yaniti uyararak Inflamatuar Barsak Hastaliklari (IBH)'nin gelismesi ile iliskisi olabilecegi one surulmektedir.

Gerec-Yontem: Calismamiza I.U. Istanbul Tip Fakultesi Gastroenteroloji Bilim Dali'nda 30 Crohn hastaligi (CH), 30 ulseratif kolit (UK) tanisi alan hasta ve 40 gastrointestinal system hastaligi bulunmayan saglikli kontrol grubu dahil edilmistir. Bu hastalarin diski ornekleri tum parazitler yonunden incelenmis, mikroskopi, kultur, ELISA ve PCR ile Blastocystis spp. varligi arastirilmistir. Blastocystis spp. saptanan orneklerde subtip dagilimi sekanslama yontemi ile arastirilmistir.

Bulgular: IBH grubunda mikroskopi ve kultur yontemleri ile 6 (%10)'sinda, kontrol grubunun 2 (%5)'sinde Blastocystis spp. varligi saptanmistir. ELISA ile Blastocystis spp. antijeni IBH grubunun 12 (%20)'sinde, kontrol grubunun 3 (%7,5)'unde saptanmistir. Blastocystis spp. DNA'si PCR ile IBH grubunun 8 (%13,3)'inde, kontrol grubunun 6 (15%)'sinda bulunmustur. Gruplar arasinda Blastocystis spp. varligi yonunden anlamli bir sonuc saptanamamistir. Suptipler arasinda ST3 en sik olarak saptanmis, bunlarda en yaygin klinik semptomun karin agrisi oldugu gozlenmistir.

Sonuc: Iki farkli besiyeri kullanilmasi tani duyarliligini arttirmistir. En duyarli tani yontemi PCR olarak saptanmis, ELISA yontemi de oldukca yuksek duyarlilik ve ozgullukte sonuc vermis, mikroskopi ve kulture alternatif bir yontem olabilecegi gozlenmistir. Sonuclarimiz subtipler ile klinik bulgular arasinda bir baglanti oldugunu gostermese de konuyu aydinlatmak icin calismalara ihtiyac olduguna isaret etmektedir.

Anahtar kelimeler: Blastocystis spp.; inflamatuar barsak hastaligi; IBH; subtip; klinik semptomlar.

ABSTRACT

Objective: Blastocystis spp; is a protozoon that can be seen worldwide. Fecal-oral transmission is the most accepted pathway for Blastocystis spp. infection. Most infected patients show no symptoms of infection, however it can cause abdominal pain, acute or chronic diarrhea, vomiting, flatulence and nausea. It is suggested that Blastocystis spp. may cause several pathologies in gut causing an inflammatory response that may lead to Inflammatory Bowel Diseases.

Materials and Methods: Our study included 60 IBH patients diagnosed as ulcerative colitis (30) and Crohn's Disease (30) in Division of Gastroenterology and 40 healty controls with no gastrointestinal disease. Stool samples of all patients were examined for presence of any parasites. Presenceof Blastocystis spp. was evaluated with microscopy, culture with two different media, ELISA and PCR methods. For subtype analyses sequencing was performed.

Results: Blastocystis spp. was detected in 6 (10%) IBD patients, 2 (5%) in controls. Blastocystis spp. antigen detected in 12 (20%) IBD patients and 3 (7.5%) in controls. Blastocystis spp. DNA was detected in 8 (13.3%) IBD patients and 6 (15%) controls. No statistical significance was detected between IBD patients and control group in terms of Blastocystis spp positivity. ST3 was the predominant subtype and abdominal pain was the most common clinical symptom.

Conclusion: These results suggested that using two different media increases the sensitivity. PCR was the most sensitive method. ELISA results showed high sensitivity and specificity, suggested that ELISA method could be an alternative to the microscopy and culture. No significant relationship between IBD and Blastocystis spp. was determined. Also, no significance was detected between subtypes and clinical symptoms. Although we could not determine a relationship between subtypes and IBD or clinical symptoms, further investigations are needed to clarify this issue.

Key words: Blastocystis spp.; inflammatory bowel disease; IBD; subtype; clinical symptoms

GIRIS

Blastocystis spp., insan ve bircok hayvan turunde siklikla rastlanan, son zamanlarda onemi artan enterik bir protozoondur. Tum dunyada en sik rastlanmasina karsin patojenitesi henuz tam olarak aydinlatilamamistir.

Blastocystis spp., fekal-oral yol ile, ozellikle kotu hijyen kosullarinda bulasmaktadir. Gorulme sikligi dunyanin farkli yerlerinde degisiklik gostermektedir. Brezilya ve Misir gibi gelismekte olan ulkelerde (%30-50) Singapur ve Japonya gibi gelismis ulkelere (%1,5-10) oranla daha sik gorulmektedir (1). Ulkemizde de prevalansi %0.48 ile %59,7 olarak bildirilmistir (2). Enfekte ettigi canli gruplarinda 17 farkli subtipinin (ST1-ST17) oldugu bildirilmistir. Cogu enfeksiyon asemptomatik seyretmektedir. Ancak son yillarda Blastocystis spp. varligini semptomatik hastalarda bildiren cok sayida calisma yapilmis, irritable barsak sendromu gibi gastrointestinal rahatsizliklar (blastocystosis) ve cesitli kutanoz lezyonlar ile iliskilendirilmistir (3). En sik ishal, karin agrisi, kramp, kabizlik, bulanti ve gaz semptomlarina neden oldugu bildirilmektedir. AIDS, losemi gibi immun yetmezlik durumu olan hastalarda semptomlu veya semptomsuz Blastocystis spp. enfeksiyonunu bildiren, yine urtiker gibi alerjik semptomlarla, kolon kanseri ile iliskisini one suren calismalar da mevcuttur (4,5,6,7).

Ulseratif kolit (UK) ve Crohn Hastaligi (CH) Inflamatuar Barsak Hastaliklari (IBH) olup cevresel, genetik, immun mekanizmalarin ve barsak mikrobiyotasinin karmasik etkilesimi ile gelisebilen rahatsizlikliklardir. Blastocystis spp. enfeksiyonun degisik tani yontemleri kullanilarak IBH, UK ve CH hastalarinda %71'e varan oranlarda Blastocystis spp. varligi saptanmis ve IBH gelisimini tetikleyen bir unsur olabilecegi ileri surulmustur (8,9,10,11). Blastocystis spp. ile infekte edilen guinea piglerin barsaklarinin mikroskopik incelemesinde, cekum ve kolonda inflamatuar hucre infiltrasyonu, odematoz lamina propria, Blastocystis spp.'nin barsak epiteline penetrasyonu ve epitel icinde anlamli sayida parazitin varligi gosterilmistir (12). Blastocystis spp. ile enfekte farelerin nekroskopilerinde cekum ve kolonda distansiyon saptanmistir. Cekum ve kolonun histolojik incelenmesinde yogun inflamatuar hucre infiltrasyonu, odematoz lamina propria ve mukozal dokulme saptanmistir. Gastrointestinal semptomlar ile birlikte lokositlerdeki degisimler ve inflamasyonun baslamasiyla birlikte Blastocystis spp., intestinal epitel hucrelerinden inflamatuar sitokinlerin salgilanmasini uyarmaktadir. Blastocystis spp.'in kolon epitel hucrelerinden IL-8 ve GM-CSF'nin salgilanmasini uyardigi gozlemlenmistir. Blastocystis spp.'nin, barsak epitel hucrelerinden inflamatuar sitokinlerin salgilanmasini uyararak akut inflamasyona neden olmasi, IBH icin tetikleyici bir unsur olmaktadir (13). Bugune kadar insanlarda Blastocystis spp'in 9 subtipi saptanmistir. Bu subtipler arasinda siklikla gorulen tipin ST3 oldugu ve bunu sirasiyla ST1, ST2, ST4, ST7, ST6, ST8, ST5, ST9'un izledigi bildirilmistir (14). Ayrica Blastocystis spp. subtiplerinin dagiliminin incelendigi yayinlarda IBH'nda ST1'in siklikla bulundugu, bunu ST4 ile ST2'nin takip ettigi bildirilmistir. Saglikli bireylerde ise ST5 ve ST3'un siklikla bulundugu gosterilmistir (11).

Bu calismada IBH tanisi alan hastalarda Blastocystis spp. varliginin mikroskobi ve kultur ile, Blastocystis spp. antijeni varligi ELISA yontemi ile ve Blastocystis spp. DNA'sinin varligi ise PCR yontemi ile arastirilmasi amaclanmistir. Bu amacla 30 UK ve 30 CH tanisi alan hasta ile 40 gastrointestinal sistem hastaligi olmayan saglikli kontrol grubuna ait diski ornegi toplanmistir. Blastocystis spp. varligi saptanan orneklerde sekanslama ile subtip dagilimi saptanmis ve bu suptipler ile klinik bulgular arasinda bir iliski olup olmadigi arastirilmistir.

GEREC - YONTEM

I.U. Istanbul Tip Fakultesi Ic Hastaliklari A.B.D Gastroenteroloji Bolumu'nde CH ve UK tanisi alan hastalardan ve hicbir sikayeti olmayan saglikli bireylerden alinan diski ornekleri formol etil asetat cokturme yontemi uygulanarak mikroskobik olarak ve ayrica orneklerden hazirlanan preparatlar trikrom boyama yontemi ile boyanarak incelenmistir. Bu calisma Istanbul Universitesi Bilimsel Arastirma Projeleri Birimi tarafindan desteklenmistir (Proje No:43523). Calisma icin gerekli etik kurul onayi Istanbul Universitesi Etik Kurulu'ndan alinmistir (Proje No: 2014/184). Ornekler Blastocystis spp. uretilmesi icin Jones' Medium ve RPMI-Serum-Antibiyotik (RAS) icerikli besiyeri olmak uzere iki farkli besiyerine ekilmistir. Ayrica orneklerden Blastocystis spp. antijeni ELISA yontemi ile ve Blastocystis spp. DNA'si ise PCR yontemi ile belirlenmistir. Jones' besiyeri %1 Maya Ozeti fosfat tampon solusyonu (PBS) icinde cozulerek otoklavlanmistir. Daha sonra icine standart tarifteki at serumu yerine %20 inaktive newborn calf serum (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) eklenmistir. Besiyeri, Zaman ve arkadaslarinin (20) calismalarinda parazitin daha iyi uredigini belirtmelerinden yola cikilarak nisasta ilavesi olmadan hazirlanmistir (21). Ikinci bir besiyeri olan RAS besiyeri; 100ml RPMI-1640 (filtrasyon ile steril edilerek) icine tariftekinden farkli olarak Fetal Bovine Serumu yerine 5ml newborn calf serum (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) ve 1ml antibiyotik (Penisilin-Streptomisin karisimi) olacak sekilde eklenmistir. Her iki besiyeride 4'er ml olacak sekilde kapakli tuplere dagitilarak 4 [grados]C'de saklanmistir (22).

Besiyerleri 37 [grados]C'de anaerob ortamda inkube edilmis, 3. gun uremesi mikroskobi ile degerlendirilerek uremeyen ornekler 1 haftaya kadar inkube edilmeye devam edilmistir.

Ayrica bu diski orneklerinde Blastocystis spp. antijen varligi ELISA kiti ile (Abnova, GmBh Germany) arastirilmistir. Deneyler kit test prosedurune uygun olarak yapilmistir.

PCR yonteminde ve genotiplerin belirlenmesi amaci ile yapilan dizileme isleminde, daha yogun uremenin gozlendigi besiyeri secilerek besiyerinden, besiyerinde ureme gorulmeyen orneklerden ise diskidan direkt DNA izolasyonu yapilmistir (23). Bu amacla diski DNA extraksiyon kiti (Qiagen, Germany) prosedurune uygun olarak kullanilmistir.

PCR isleminde ekstraksiyonlardan DNA'nin cogaltilmasi amaci ile BioRad T100 Thermal Cycler cihazi kullanilmistir. Bu asamada kullanilan kosullar ve primerler Bohm-Gloning ve arkadaslarinin calismalari referans alinarak yapilmistir (24).

Blastocystis spp. tiplendirme calismasi icin sekanslama metodu kullanilmistir. Blastocystis spp. primeri olarak adlandirilan ve organizmanin small subunit ribozomal DNA'sindaki (ssu rDNA) ~500 bazlik korunmus bolgeyi cogaltan primer cifti ile amplikon PCR ile cogaltilmistir Santin ve ark (25)'in calismasinda belirtilen primerlar ticari olarak temin edilmistir. Bu amplikona oncelikle Exo 1-SAP enzimleri kullanilarak clean-up, ardindan ABI BigDye Terminator v3.1. Cycle Sequencing Kit, (Thermo Fisher Scientific, USA) kullanilarak Genetic Analyzer 3130xl'' (Applied Biosystems, CA, USA) cihazi ile sekanslama islemi uygulanmistir. Dizileme islemi tamamlanan ornekler "Sequencing Analysis 5.3.1" yazilimi ile analiz edilmistir. Dizi sonuclari "NCBI Blast" veri tabanindan Megablast kullanilarak subtipler analiz edilmistir.

BULGULAR

UK ve CH'larindan toplanan toplam 60 diski orneginde mikroskobi ile 6 (%10) hastada Blastocystis spp. saptanmistir. 30 adet UK hastasindan toplanan diski orneklerinin 4 tanesinde (%13,3), 30 CH ait orneklerden ise 2 (%6,6) tanesinde Blastocystis spp. varligi gozlenmistir. Pozitif UK orneklerinin 2 tanesi her iki besiyerinde de bol miktarda uretilirken, diger iki hastaya ait orneklerde Jones' besiyerinde RAS besiyerine oranla daha bol miktarda ureme gozlemlenmistir. CH grubuna ait pozitif iki ornekten ise bir tanesi Jones' mediumda urememis, RAS besiyerinde uremis, diger pozitif ornek ise her iki besiyerinde de uremis ancak Jones' besiyerinde daha seyrek uremistir. Orneklerde baska parazite rastlanmamistir.

Saglikli kontrol grubu orneklerinde ise 40 ornekten mikroskobi ile 2 ornekte (%5) Blastocystis spp. saptanmis, her iki ornek iki besiyerinde de uremis fakat biri Jones' besiyerinde daha yogun olarak uremistir. ELISA ile IBH grubunda 12 (20%) hastada Blastocystis spp. antijeni saptanmistir Bunlardan 7 (%23,3)'si UK, 5 (% 16,6)'I CH grubuna ait hastalardir. Kontrol grubunda ise 3 (7.5%) hastada Blastocystis spp. antijeni pozitif saptanmistir.

UK hastalarinin yas ortalamasi 47[+ or -] 15 ve CD hastalarinin ise 43[+ or -]14 olarak saptanmistir (p=0.31). Cinsiyet dagilimi ise UK icin %50 (n=11) erkek, CH icin ise %%40 (n=12) erkektir (p=0.44). Hastalara ait ortalama CRP, ESR ve albumin degerleri UK ve CH gruplari icin benzer olarak saptanmistir (sirasiyla p=0.71, p= 0.40 ve p=0.68). UK grubunda 9 (%31), CH grubunda ise 10 (%35.7) hasta klinik olarak aktifti (p=0.71). Anti-TNF tedavisi alan UK hastalari 7 (%24.1), CH hastalari 3 (%10.7), azathioprin tedavisi alan UK hastalari ise CH grubunda daha fazladir (%73.1 vs %34.5, p=0.004). UK grubunda hastaligin lokasyonunun dagilimi su sekilde saptanmistir; %48.8 (n=12) proktosigmoidit, %31 (n=9) pankolit. CH grubunda ise; %59.3 (n=16) ileokolonik yayilim ve %29.6 (n=8) ileal yayilim gozlenmistir.

Her ne kadar calismamizda Blastocystis spp. calisma grubunda kontrol grubuna oranla anlamli siklikta gorulmemis olsa da UK grubunda hicbir hastada aktif hastalik gozlenmemis olmasi, CH grubunda ise tek bir hastanin aktif olmasi, hicbir hastanin anti-TNF ve azathioprin tedavisi almiyor olmasi, UK grubundaki 4 Blastocystis spp. pozitif hastada sol kolon yayilimi, 1 hastada proktit ve 1 hastada genel yayilim, CH grubunda ise iki hastada da ileokolonik yayilim gorulmesi dikkat cekicidir.

PCR ile hasta grubu orneklerinden 8 tanesinde (%13,3) Blastocystis spp. DNA'si saptanirken bunlardan 6 (%20)'si UK, 2 (%6,6)'si ise CH grubuna ait orneklerdir. UK hastalarindan pozitif saptanan 2 ornekte diger yontemler ile Blastocystis spp. varligi saptanamamistir. Kontrol grubu orneklerinin ise 6 (%15)'sinda Blastocystis spp. DNA'si varligi gozlenmistir. Two-tailed Fishers' exact test ile Blastocystis spp. enfeksiyonu ile IBH arasinda CH-UK, UK-kontrol, CH-kontrol gruplarindan hicbiri arasinda anlamli bir sonuc saptanamamistir (sirasiyla; p=0.05, p=0.75, p=0.45) Mikroskopi ve kultur ile Blastocystis spp. varligi saptanan orneklerin tumu ELISA ve PCR yontemleri ile pozitif saptanirken, ELISA veya PCR ile pozitif saptanan orneklerden (Sekil 1) bir kismi mikroskopi ve kulturle negatif olarak gozlemlenmistir (Tablo 1,2). (**)Burada belirtildigi uzere kultur ve mikroskopi ile Blastocystis varligi saptanamayan bazi orneklerde PCR ile parazitin varligi saptanmistir. Bu durum PCR'in duyarliliginin yuksek oldugu olarak yorumlanmistir.

ELISA yonteminin kultur yontemi altin standart olarak alindiginda duyarliligi %100 ve ozgullugu %92,39, PCR yontemi altin standart olarak kabul edildiginde ise duyarliligi %85,7 ve ozgullugu %93,02 olarak saptanmistir.

PCR yontemi ile Blastocystis spp. DNA'si saptanan orneklere dizileme yapilmistir. Bunun sonucunda UK grubuna ait orneklerden 4 tanesi ST3, 1'er tanesi ST1 ve ST2, CH grubuna ait 2 ornek ise ST3 olarak olarak saptanmstir. Kontrol grubu orneklerinin ise 5 tanesi ST3, 1 tanesi ST1 olarak saptanmistir. Bu hastalarda en sik gorulen sikayet karin agrisidir, ancak asemptomatik hastalarda bulunmaktadir. Hasta grubuna ait ornekler, subtip dagilimi ve klinik bulgular Tablo 3'te gosterilmistir.

TARTISMA

Blastocystis spp. dunyada oldukca yaygin gorulen bir parazittir. Prevalansi degisik ulkelerde degismekte olup, gelismekte olan ulkelerde dusuk hijyenik kosullar ve hayvanlarla yakin temasa bagli olarak daha yuksek oranda gozlenmektedir. Ancak gorulme sikligi ulke icinde farkli bolgelerde de degisebilmektedir ve bu degisik oranlar farkli sosyoekonomik kosullara bagli olabilecegi gibi farkli duyarliliga sahip tani yontemlerinin kullanilmasina da baglanabilmektedir. Rutin incelemede en yaygin olarak mikroskobi yontemi kullanilmaktadir. Boyali preparasyon ve kultur metodlarina da siklikla basvurulmaktadir. Subunit (ssu) ribozomal RNA genlerinin saptanmasina yonelik PCR metodlari da yuksek duyarliliga sahip olmalari ile son yillarda ozellikle arastirmalarda yaygin olarak kullanilmaktadir (26).

Calismamizda toplam 60 UK ve CH'ndan olusan hasta grubunun mikroskobi ile 6 (%10)'sinda Blastocystis spp. gorulurken 40 kontrol grubu orneginin 2 (%5)'sinde Blastocystis spp. gorulmustur. Calismamizda, kultur yonteminin mikroskobi yonteminden ustun oldugunu ileri suren Zaman ve arkadaslarinin 1994'te iki aksenik kultur sistemi (modifiye Boeck & Drbohlav's medium ve tripton, yeast extract, glukoz, methionine-9 medium) kullandiklari calismanin aksine kultur yontemi ile mikroskobi sonuclari paralellik gostermistir (27). Kukoschke ve arkadaslari (28) ise besince zengin bir besiyeri kullandiklari calismada bizim sonuclarimizla uyumlu olarak kultur ve mikroskobi sonuclarini benzer saptamislardir (29). Pek cok calisma Blastocystis spp. kulturu icin Jones' besiyerini basarili ve yuksek duyarliliga sahip olarak onermektedir (30,31). C alismamizda bazi ornekler her iki besiyerinde de basarili sekilde urerken bir ornek Jones' besiyerinde uremezken, RAS besiyerinde uremistir. bazi ornekler ise bir besiyerinde digerine oranla daha yogun uremistir. Popruk ve arkadaslari (1) calismalarinda bir subtipin uremesinin diger bir subtipin uremesini baskilayabilecegini belirtmislerse de bizim calismamizda birden cok subtipin birlikte oldugu bir ornek saptanamamistir. Sonuclarimiz ayni subtiplerin farkli ureme yetenekleri olabilecegini dusundurmustur. Calismamizda ELISA yontemi ile mikroskobi-kultur yontemlerine oranla daha yuksek pozitiflik saptanmistir. ELISA yonteminin kultur yontemi altin standart olarak alindiginda duyarliligi 100% ve ozgullugu 92,39%, PCR yontemi altin standart olarak kabul edildiginde ise duyarliligi 85,7% ve ozgullugu 93,02% olarak saptanmistir. Baska bir ELISA kitinin (CoproELISATM Blastocystis, Savyon Diagnostics) kullanildigi, ELISA sonuclarinin kultur veya Indirekt Flouresan Antikor test sonuclari ile kiyaslandigi bir calismada ELISA'nin duyarliliginin %92, ozgullugunun ise %87 oldugu bildirilmistir. Bu oranlar calismamizdaki bulgularla paralellik gostermistir (32).

PCR ile. UK hastalarindan pozitif saptanan 2 ornekte diger yontemler ile Blastocystis spp varligi saptanamamistir. Kontrol grubu orneklerinin ise 6 (%15)'sinda Blastocystis spp. DNA'si varligi gozlenmistir. Mikroskobi ve kultur ile Blastocystis spp varligi saptanan orneklerin tumu ELISA ve PCR yontemleri ile pozitif saptanirken, ELISA veya PCR ile pozitif saptanan orneklerden bir kismi mikroskobi ve kulturde negatif olarak gozlemlenmistir. Kultur yonteminin PCR'a gore ustun oldugunu belirten calismalarin yani sira PCR yontemini ustun bulan calismalar da mevcuttur (26,33). Bizim calismamiz PCR yonteminin kultur ve mikroskobiye oranla daha duyarli oldugunu gostermistir.

Inflamatuar barsak hastaliklarindan UK ve CH cevresel, genetik ve immun mekanizmalarin karmasik etkilesimi ile gelisebilen rahatsizliklardir. Altta yatan genetik faktorlerin yani sira pek cok calisma ile kommensal bakterilere karsi mukozal immun yanitin disfonksiyonunun IBH ve ozellikle CH patogenezinde rolu olabilecegi one surulmektedir. Bir patojenle enfeksiyon veya defektif mukozal bariyere bagli olarak gelisen kronik inflamatuar yanit tetikleyici olabilmektedir. Karakteristik inflamatuar yanit notrofil veya makrofaj infiltrasyonu ile baslar, sitokin ve kemokin salinimi gerceklesir (34). Blastocystis spp.'nin IBH'ye yol actigini ileri suren calismalarin yani sira hayvan modellerinde Blastocystis spp.'nin olusturdugu immun yanit ve parazitin barsak epitel hucrelerine penetrasyonunu gosteren calismalarda bulunmaktadir (12). Inflamatuar hucre infiltrasyonu ve lokositlerdeki degisiklikler ile Blastocystis spp. kolon epitel hucrelerinden interlokin (IL)-8 ve granulosit-makrofaj koloni stimule edici faktor (GM-CSF) gibi inflamatuar sitokinlerin uretimini uyarir. Bu inflamatuar surec IBH'nin olusumu icin tetikleyici olabilmektedir (13). IBH hastalarindan kolonik biyopsiler alinarak yapilan bir calismada bu hastalardaki gastrointestinal semptomlarin serin proteaz aktivitesine bagli olarak olustugu bildirilmistir (35). Serin proteazlarin yuksek duzeyleri karin agrilarina, kas kasilmalarina neden olmaktadir ve bu yuksek duzey serin proteaz aktivitesi viral ve bakteriyal enteritlerde gorulmemektedir (36). Blastocystis spp.'nin 22 adet proteaz salgiladigi tahmin edilmektedir ve bunlar 20 sistein proteaz, 1 serin proteaz, 1 aspartik proteaz olarak karakterize edilmektedir (35). Sistein proteaz aktivitesinin IgA degradasyonuna neden olarak parazitin in vivo yasamasina olanak sagladigi dusunulmektedir (37). Enterik anti- Blastocystis IgA'nin yuksek duzeyde salgilanmasinin tum semptomatik hastalarda goruldugu fakat asemptomatik hastalarda saptanmadigi belirtilmistir (38). Bu durum hastaligin gelisiminde parazitin konaga saldirmasindan cok konagin parazite saldirmasinin etkili olmasi ve parazitin savunma mekanizmasinin hastaligi olusturmasina baglanmistir (39).

Calismamizda Blastocystis spp. varligi yonunden CH-UK, UK-kontrol, CH-kontrol gruplari arasinda istatistiksel olarak anlamli bir iliski saptanamamistir. Bu bulgular Peterson ve arkadaslarinin (40) 42 CH ve 41 UK hastalari ve 96 kontrol iceren calismalari ile benzerdir. Arastirmacilar Blastocystis spp.'nin bu hastalarda saptanamamasini bu hastalarda kolonizasyon icin uygun ortamin olmamasina baglamis ve uygun olmayan kosullarin mikrobiyotadaki degisimleri yansitip yansitmadiginin ve/veya bu durumun konak immunitesi ile iliskili olup olmadiginin anlasilmasi icin daha ileri arastirmalarin gerekli oldugunu bildirmislerdir. Rossen ve arkadaslari (41) Blastocystis spp. varligini triple feces test (TFT) kullanarak saglikli bireylerde 40/123 (%32.5), UK hastalarinda 6/45 (%13.3) oraninda saptamistir. Diger yandan IBH ile Blastocystis spp. arasinda anlamli iliski saptayan calismalar da mevcuttur. Cekin ve arkadaslari (42) IBH grubunda, ozellikle UK hastalarinda kontrollere oranla oldukca anlamli Blastocystis spp. pozitifligi saptamis (sirasiyla; p = 0.019, p=0.016), CH grubunda anlamli sonuc bulamamislardir. Yamamato ve arkadaslari (43) Meksikali CH hastalari arasinda Blastocystis spp. prevalansini %10 oraninda saptamistir fakat bu calismaya kontrol grubu dahil edilmemistir. Baska bir calismada 6 semptomatik UK hastasinda diskinin mikroskobik incelemesi sonucu Blastocystis spp. varligi saptanmis ve 14 gunluk metronidazol tedavisi sonucu tamamen iyilesme gozlenmistir (44).

Calismamizda PCR yontemi ile Blastocystis spp. DNA'si saptanan orneklere dizileme yapilmistir. Bunun sonucunda UK grubuna ait orneklerden 4 tanesi ST3, 1'er tanesi ST1 ve ST2, CH grubuna ait 2 ornek ise ST3 olarak olarak saptanmstir. Kontrol grubu orneklerinin ise 5 tanesi ST3, 1 tanesi ST1 olarak saptanmistir. Calismamizda subtipler ile klinik semptomlar arasinda anlamli bir sonuc bulunamamistir. Dogruman ve arkadaslari (45) Blastocystis spp. ST3 ve ST2'yi kronik diyare, IBS ve IBH hastalarinda yaygin olarak saptamislardir. Bizim sonuclarimiza parallel olarak subtipler ile semptomlar arasinda bir iliski saptayamamislar, bu durumu semptomlarin ortaya cikmasinda konak faktorlerinin kuvvetli rol oynamasina baglamislardir. Bu konuyu aciklamak icin daha yuksek sayida hastalarda Blastocystis spp. subtipleri dagilimi konagin immun durumununda arastirildigi calismalara gereklilik vardir.

Sonuc olarak calismamizda Blastocystis spp. tanisi amaci ile kullanilan degisik tani yontemleri kiyaslandiginda mikroskobik yontem ile iki farkli besiyeri ile uygulanan kultur yontemi sonuclari paralellik gostermistir. Iki farkli besiyerinin kullanilmasi tani duyarliligini arttirmistir. ELISA yontemi bu yontemler ile kiyaslandiginda yuksek oranda ozgulluk ve duyarlilik gostermistir. Fakat PCR yontemi altin standart olarak degerlendirildiginde ELISA yontemi duyarliligi daha dusuk olarak saptanmistir. Blastocystis spp. ve barsak patolojileri uzerine yapilan calismalar parazitin barsak homeostazini bozarak patolojilere yol actigini destekler niteliktedir. Her ne kadar calismamizda UK ve CH gruplarinda kontrol grubuna gore Blastocystis spp. varligi yonunden anlamli bir iliski saptanmamis olsa da bu konu uzerinde daha fazla calismaya ihtiyac vardir. Calismamizda semptomatik ve asemptomatik hastalarda en sik ST3 saptanmis olup ulkemizde yapilan calismalar ile bu sonuclar ortusmektedir. Bizim sonuclarimiz subtipler ile klinik bulgular arasinda bir baglanti oldugunu gostermemesine ragmen, konuyu aydinlatmak icin Blastocystis spp. subtiplerinin klinik ile iliskisini aciklamaya yonelik calismalara ihtiyac bulunmaktadir.

TESEKKUR

Desteklerinden dolayi Istanbul Universitesi Bilimsel Arastirma Projeleri Birimi (Proje No:43523)'ne ve calismamizda kullanilan sekanslama metodundaki yardimlarindan dolayi Fullgen Biyoteknoloji'ye tesekkur ederiz.

KAYNAKLAR

(1.) Popruk P, Pintong A, Radomyos P. Diversity of Blastocystis subtypes in humans. J Trop Med Parasitol 2013; 36:88-97.

(2.) Dagci.H: Blastocystis: Turkiye'deki Son Gelismeler. 18. Ulusal Parazitoloji Kongresi Kitapcigi, 29 Eylul-5 Ekim 2013, Denizli, 2013;30-4.

(3.) Wawrzyniak I, Poirier P, Viscogliosi E, Dionigia M, Texier C, Delbac F, El-Alaoui H. Blastocystis, an unrecognized parasite:an overview of pathogenesis and diagnosis. Ther Adv Infect Dis 2013; 1:167-78.

(4.) Koltas IS, Ozcan K, Tanriverdi S, Paydas S, Paydas S, Baslamisli F. The prevalence of Blastocystis hominis in immunosupressed patients. Ann Med Sci 1999; 8:117- 9.

(5.) Tasova Y., Sahin B., Koltas S., Paydas S.: Clinical significance and frequency of Blastocystis hominis in Turkish patients with hematological malignancy. Acta Med Okayama 2000; 54:133-6.

(6.) Zoglool DAM., Khodari YAW., Frooq MU.: Blastocystis hominis and allergic skin diseases; a single center experience. Journal Of Health Sciences 2012;2 : 66

(7.) Horiki N, Kaneda Y, Maruyama M, Fujita Y, Tachibana H. Intestinal blockage by carcinoma and Blastocystis hominis infection. Am J Trop Med Hyg 1999; 60:400-2.

(8.) Yakoob J., Jafri W., Jafri N., Khan R., Islam M., Beg MA., Zaman V.: Irritable bowel syndrome: in search of an etiology: role of Blastocystis hominis. Am J Trop Med Hyg 2004; 70: 383-5.

(9.) Nagler J., Brown M., Soave R.: Blastocystis hominis in inflammatory bowel disease. J Clin Gastroenterol 1992; 16:109-12.

(10.) Giacometti A., Cirioni O., Fiorentini A., Fortuna M., Scalise G.: Irritable bowel syndrome in patients with Blastocystis hominis infection. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999;18:436-9.

(11.) Yakoob J., Jafri W., Beg MA., Abbas Z., Naz S., Islam M., Khan R.: Irritable Bowl Sendrome: It is associated with genotypes of Blastocystis hominis. Parasitol Res 2010; 106:1033-8.

(12.) Phillips BP, Zierdt CH.: Blastocystis hominis: Pathogenic potential in human patients and in gnotobiotics. Exp Parasitol 1976;39: 358-64.

(13.) Long HY., Handschack A., Konig W., Ambrosch A.: Blastocytis hominis modulates immune responses and cytokine release in colonic epithelial cells. Parasitol Res 2001; 87:1029-30.

(14.) Alfellani MA, Mulla DT, Jacob AS, Imeede CA, Yoshikawa H, Stensvold CR, Clark CG. Genetic diversity of Blastocystis in livestock and zoo animals. Protist 2013;164:497-509.

(15.) Noel C, Dufernez F, Gerbod D, Edgcomb VP, Delgado-Viscogliosi P, Ho L.C, Singh M, Wintjens R, Sogin ML, Capron M, Pierce R, Zenner L, Viscogliosi E. Molecular phylogenies of Blastocystis isolates from different hosts: implications for genetic diversity, identification of species, and zoonosis. J Clin Microbiol 2005; 43: 348-55.

(16.) Tan KS. New insights on classification, identification, and clinical relevance of Blastocystis spp. Clin Microbiol Rev 2008; 21:639-65.

(17.) Scanlan PD, Marchesi JR. Micro-eukaryotic diversity of the human distal gut microbiota: quantitative assessment using culture-dependent and independent analysis of faeces. ISME J 2008; 2:1183-93

(18.) Dominguez-Marquez M, Guna R, Munoz C, Gomez-Munoz M, Borras R. High prevalence of subtip 4 among isolates of Blastocystis hominis from symptomatic patients of health district of Valencia (Spain). Parasitol Res 2009; 105:949-55.

(19.) Stendsvolt C, Christiansen D, Olsen K, Nielsen H. Blastocystis sp. subtype 4 is common in Danish Blastocystis-positive patients presenting with acute diarrhea. Am J Trop Med Hyg 2011; 84:883-5.

(20.) Zaman V, Ng GC, Suresh K, Yap EH, Singh M. Isolation of Blastocystis from the cockroach (Dictyoptera, Blattidae). Parasitol Res 1993;79:73-4.

(21.) Jones, WR. The experimental infection of rats with Entamoeba histolytica; with a method for evaluating the anti-amoebic properties of new compounds. Annals of Tropical Medicine and Parasitology 1946; 40: 130-40.

(22.) Grecu (Matiut) DS, Neagu AN, Harmanescu EA, Moglan I, In vitro division modalities developed by Blastocystis hominis examined with the acridine orange stain. Analele Stiintifice ale Universitatii Alexandra Ioan Cuza" din Iasi, s. Biologie animala, Tom LIX 2013;13-8

(23.) Stensvold CR. Comparison of sequencing (barcode region) and sequence-tagged-site PCR for Blastocystis subtyping. J. Clin. Microbiol 2013, 51: 190-4.

(24.) Bohm-Gloning B, Knobloch J, Walderich B. Five subgroups of Blastocystis hominis isolates from symptomatic and asymptomatic patients revealed by restriction site analysis of PCR-amplified 16S-like rDNA. Trop Med In Health 1997;2 (8):771-8.

(25.) Santin M, Gomez-Munoz MT, Solano-Aguilar G, Fayer R. Development of a new PCR protocol to detect and subtype Blastocystis spp. from humans and animals. Parasitol Res. 2011;109(1):205-12.

(26.) Roberts T, Barrat J, Harkness J, Ellis J, Stark D. Comparison of microscopy, culture and conventional polymerase chain reaction for detection of Blastocystis sp. in clinical stool samples. Am J Trop Med Hy.g 2011; 84:308-12.

(27.) Zaman V, Khan KZ. A comparison of direct microscopy with culture for the diagnosis of Blastocysis hominis. Southeast Asian J Trop Med Public Health 1994; 25:792-3.

(28.) Kukoschke KG, Necker A, Muller HE. Detection of Blastocystis hominis by direct microscopy and culture. Eur J Clin Microbiol Infec Dis 1990; 9:305-7.

(29.) Boeck, W. C., and J. Drbohlav. The cultivation of Endamoeba histolytica. Am. J. Hyg 1925; 5:371-407.

(30.) Leelayoova S, Taamasri P, Rangsin R, Naaglor T, Thathaisong U, Mungthin M. In-vitro cultivation: a sensitive method for detecting Blastocystis hominis. Ann Trop Med Parasitol 2002; 96:803-7.

(31.) Stensvold CR, Arendrup MC, Jespersgaard C, Molbak K, Nielsen HV. Detecting Blastocystis using parasitologic and DNA-based methods: a comparative study. Diagn Microbiol Infect Dis 2007;59:303-7.

(32.) Dogruman-Al F, Turk S, Adiyaman-Korkmaz G, Hananel A, Levi L, Kopelowitz J,et al. A novel ELISA test for laboratory diagnosis of Blastocystis spp. in human stool spesimens. Parasitol Res 2015; 114:495-500.

(33.) Termmathurapoj S , Leelayoova S , Aimpun P, Thathaisong U, Nimmanon T, Taamasri P, Mungthin M. The usefulness of short-term in vitro cultivation for the detection and molecular study of Blastocystis hominis in stool specimens. Parasitol Res 2004; 93: 445-7.

(34.) Hanauer SB. Inflammatory bowel disease: epidemiology, pathogenesis, and therapeutic opportunities. Inflamm Bowel Dis 2006;1:3-9.

(35.) Cenac N, Andrews CN, Holzhausen M, Chapman K, Cottrell G, Andrade-Gordon P, Steinhoff M, Barbara G, Beck P, Bunnet NW, Sharkey KA, Ferraz JG, Shaffer E, Vergnolle N. Role for protease activity in visceral pain in irritable bowel syndrome. J Clin Invest 2007; 117: 636-47.

(36.) Gecse K, Roka R, Ferrier R, Leveque M, Eutamene H, Cartier C, Ait-Belgnaoui A, Rosztoczy A, Izbeki F, Fiaramonti J, Wittmann T, Bueno L. Increased feacal serine protease activity in diarrhoeic IBS patients: a colonic luminal factor impairing colonic permeability and sensitivity 2008;57:591-9.

(37.) Puthia M., Vaithilingam A., Lu J., Tan K. Degradation of human secretory immunoglobulin a by Blastocystis. Parasitol Res 2005;97:386-9.

(38.) Mahmoud MS, Saleh WA. Secretory and humoral antibody responses to Blastocystis hominis in symptomatic and asymptomatic human infections. J Egypt Soc Parasitol. 2003; 33:13-30.

(39.) Markell EK, Udkow MP. Blastocystis hominis: pathogen or fellow traveler?. Am Trop Med Hyg 1986; 35:1023-26.

(40.) Petersen AM, Stensvold CR, Mirsepasi H, Engberg J, Friis-Moller A, Porsbo LJ, Hammerum AM, Nordgaard-Lassen I, Nielsen HV, Krogfelt KA. Active ulcerative colitis associated with low prevalence of Blastocystis and Dientamoeba fragilis infection. Scand J Gastroenterol 2013; 48:638-9.

(41.) Rossen NG, Bart A, Verhaar N, van Nood E, Kootte R, de Groot PF, D'Haens GR, Ponsioen CY, van Gool T. Low prevalence of Blastocystis sp. in active ulcerative colitis patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2015; 34:1039-44.

(42.) Cekin AH, Cekin Y, Adakan Y, Tasdemir E, Koclar FG, Yolcular BO. Blastocystosis in patients with gastrointestinal symptoms: a case-control study. BMC Gastroenterol 2012; 12:122.

(43.) Yamamoto-Furusho JK, Torijano-Carrera E. Intestinal protozoa infections among patients with ulcerative colitis: prevalence and impact on clinical disease course. Digestion 2010;82:18-23.

(44.) Tai WP, Hu PJ, Wu J, Lin XC: Six ulcerative colitis patients with refractory symptoms co-infective with Blastocystis hominis in China. Parasitol Res 2011;108:1207-10.

(45.) Dogruman-Al F, Kustimur S, Yoshikawa H, Tuncer C, Simsek Z, Tanyuksel M, et al. Blastocystis subtypes in irritable bowel syndrome and inflammatory bowel disease in Ankara, Turkey. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 2009;104:724-7.

Ozden BUYUKBABA BORAL (*), Deniz Gozde CELIK (*), Raim ILIAZ (**), Akin AKGUL (*), Halim ISSEVER (***), Filiz AKYUZ (**)

Istanbul Universitesi, Istanbul Tip Fakultesi, (*) Tibbi Mikrobiyoloji Anabilim Dali, (**) Ic Hastaliklari Anabilim Dali, Gastroenterohepatoloji BD, (***) Halk Sagligi Anabilim Dali, Istanbul, TURKIYE.

(Corresponding author/Iletisim kurulacak yazar: obboral@yahoo.com)

Date received/Dergiye geldigi tarih: 30.10.2016 -- Date accepted/Dergiye kabul edildigi tarih: 16.03.2017
Tablo 1: Mikroskobi ve kultur sonuclarinin ELISA sonuclari ile
karsilastirilmasi

n=100       Mikroskobi-   Mikroskobi-
            Kultur (+)    Kultur (-)

ELISA (+)   8              7
ELISA (-)   0             85
PCR (+)     8              6
PCR (-)     0             86

Tablo 2:ELISA sonuclarinin PCR sonuclari ile karsilastirilmasi

n=100     ELISA (+)   ELISA (-)

PCR (+)   12            2
PCR (-)    6           80

Tablo 3: Blastocystis spp. DNA'si saptanan IBH hast klinik bulgulari
ve subtip dagilimi.

Hasta   IBH   Subtip   Klinik bulgular
no

1       UK    ST3      Karin agrisi, Gaz
2       UK    ST3      Karin agrisi
3       UK    ST3      Karin agrisi
4       UK    ST3      Asemptomatik
5       UK    ST1      Karin agrisi
6       UK    ST2      Asemptomatik
7       CH    ST3      Karin agrisi
8       CH    ST3      Asemptomatik
COPYRIGHT 2017 AVES
No portion of this article can be reproduced without the express written permission from the copyright holder.
Copyright 2017 Gale, Cengage Learning. All rights reserved.

Article Details
Printer friendly Cite/link Email Feedback
Title Annotation:KLINIK ARASTIRMA/ CLINICAL RESEARCH
Author:Buyukbaba Boral, Ozden; Celik, Deniz Gozde; Iliaz, Raim; Akgul, Akin; Issever, Halim; Akyuz, Filiz
Publication:Journal of Istanbul Faculty of Medicine
Article Type:Report
Date:Mar 1, 2017
Words:5082
Previous Article:ACCORDANCE BETWEEN CLINICAL AND RADIOLOGIC FINDINGS OF NASAL BONE FRACTURE/NAZAL KEMIK KIRIGININ KLINIK VE RADYOLOJIK BULGULARI ARASINDAKI UYUMU.
Next Article:KAZANILMIS EPIGENETIK DEGISIKLIKLERIN KALITIMI VE HASTALIKLARA YATKINLIKTAKI ROLU/INHERITANCE OF ACQUIRED EPIGENETIC MODIFICATIONS AND ITS ROLE IN...
Topics:

Terms of use | Privacy policy | Copyright © 2019 Farlex, Inc. | Feedback | For webmasters