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Hongos filamentosos con actividades ligninoliticas aislados de Calamagrostis nitidula Pilg.

Lignin-degrading filamentous fungi isolated from Calamagrostis nitidula Pilg.

Introduccion

La lignina es un polimero complejo conocido por su resistencia al ataque microbiano y es considerado como un componente anticalidad por su impacto negativo en la disponibilidad nutricional de la fibra de la planta (Moore y Jung 2001). Los hongos con actividades ligninoliticas se vienen estudiando desde hace dos decadas en "pajas", como las de trigo, la cascarilla de arroz y en madera (StefFen et al. 2002). Estos hongos pertenecen a la clase basidiomycetes, pero tambien han sido reportados Ascomycetes y Levaduras (Milstein et al. 1983, Kadam y Drew, 1985, Betts y Dart 1989, Cardoso y Costa 1994, Conesa et al. 1999, Steffen et al. 2002, Olvera 2003)

El Peru cuenta con una diversidad de pastizales silvestres nativos (pastos forrajeros) pertenecientes a la familia Poaceae (gramineas) que crecen en altitudes por encima de 3500-3800 m de altitud, sobre todo en la region alto andina; entre los cuales, los llamados "pajonales" ocupan areas extensas y estan formados por especies de los generos Stipa, Festuca y Calamagrostis. Estas comunidades de plantas son las unicas fuentes de alimento para la ganaderia de las zonas alto andinas teniendo un bajo valor nutritivo (5% de proteina y 35,4 % de fibra cruda) y baja digestibilidad debido a la lignina (Choque y Sotomayor 1989, Tovar 1960, 1993, Didier et al. 1994).

En el presente trabajo se aislan, identifican y evaluan hongos ligninoliticos a partir de Calamagrostis nitidula.

Materiales y metodos

Recoleccion de muestra vegetal

Muestras de paja silvestre de Calamagrostis nitidula Pilg. en condicion erguida (PE) y descompuesta (PD) fueron recolectadas en la localidad de Ticlio, provincia de Huarochiri, departamento de Lima a 4800 m de altitud.

El material biologico recolectado se guardo en una prensa de madera entre secantes. Para su identificacion se siguio la clave dicotomica de Tovar (1960, 1993).

Aislamiento de los hongos de Calamagrostis nitidula

Las muestras colectadas de Calamagrostis nitidula fueron procesadas en el laboratorio el mismo dia de la colecta, se corto en trozos pequenos y se sembro en medio liquido de sales minerales Czapeck teniendo a la lignina como unica fuente de carbono 0,2% (Lignin alcali low sulfonate content, ALDRICH). El medio liquido Czapeck-Lignina fue llevado a un pH 5,5, a una temperatura de laboratorio de 25 [grados]C y una humedad relativa de 65%, en cultivos sumergidos estaticos y en oscuridad. Los cultivos liquidos fueron evaluados durante 30 dias. Una vez observado el crecimiento superficial y la produccion de gas se tomo un inoculo de cada frasco y se sembro en placas petri conteniendo Agar Czapeck-Lignina al 0,2%, a pH 5,5. Las colonias aisladas fueron sembradas en placas petri con un medio de agar papa dextrosa (APD) observandose diariamente su crecimiento hasta los 20 dias para luego obtener un cepario.

Identificacion de los hongos aislados

Se observaron caracteristicas macroscopicas de las colonias describiendo detalles de textura, aspecto, superficie, color en un estereoscopio. Tambien se realizo la observacion microscopica mediante la tecnica de microcultivo en lamina para observar las estructuras vegetativas y reproductivas. En la identificacion de genero y especie se utilizo el manual de identificacion de hongos segun Egorova (1983).

Prueba de la degradacion de la lignina

Las concentraciones de la lignina fueron medidas por su absorbancia a 560 nm en un espectrofotometro estableciendose una curva de calibracion (Olvera 2003) (Fig. 1).

[FIGURA 1 OMITIR]

Las cepas aisladas se sembraron en el medio Czapeck con 0,002 g/mL de lignina y 3 blancos con medio Czapeck sin lignina ambos por triplicado. Las muestras fueron incubadas en condiciones de laboratorio a una temperatura de 25 [grados]C, humedad relativa de 65%. Los cultivos de las cepas fueron sometidas a dos procesos fermentativos: el primero, un cultivo en condiciones estaticas por 15 dias y el segundo fue incubado en un agitador orbital por 7 dias a 150 RPM. En la determinacion del consumo de la lignina se utilizaron dos metodos: a) Metodo cualitativo y b) Metodo cuantitativo.

a) Metodo cualitativo

Se evaluo diariamente el cambio de la coloracion cafe de la lignina contenida en los matraces hasta 30 dias. Al cabo de este tiempo se filtro con papel filtro de 4-7 micras (filtracion lenta), para retener las esporas, luego se hizo una centrifugacion a 5300 RPM por 30 minutos para separar el resto de micelio.

b) Metodo cuantitativo

Se tomo 10 mL del filtrado de las muestras tratadas en el metodo cualitativo y se procedio a medir la absorbancia de cada tubo a 560 nm, determinandose el peso soluble de lignina en el medio de cultivo, luego se calculo la cantidad de lignina degradada por el hongo.

Resultados y discusion

Aislamiento e identificacion de los hongos ligninoliticos

Doce cepas de hongos filamentosos tanto en paja erguida (PE) como paja descompuesta (PD) fueron aislados (Tabla 1).

En el medio Czapeck conlignina todas estas cepas formaron colonias levaduriformes, sin embargo, al sembrarlas en APD tomaron las caracteristicas propias filamentosas segun el genero de los hongos.

[FIGURA 2 OMITIR]

Degradacion de la lignina por los hongos aislados

La prueba de degradacion de lignina se realizo con las 12 cepas aisladas de las diferentes muestras de paja a partir de un inoculo de cada una en el medio minimo Czapeck con glucosa al 1% y lignina al 0,2%. Despues de 15 dias en cultivo estatico, la cepa PD5F fue la unica que evidencio la degradacion de la lignina, al cambiar de un color cafe a un color amarillo (Fig 2). En la evaluacion cuantitativa la cepa PD5F mostro una absorbancia final de 0,118 con respecto al blanco 0,631, lo cual indico una degradacion de 0,002 a 0,0004 g/mL de lignina al cabo de 15 dias, lo que corresponde a una degradacion del 80%. En la prueba cualitativa en un cultivo en agitacion, se pudo observar un cambio de coloracion en la cepa PD5F a los 7 dias de crecimiento. El resto de cepas no evidencio cambios en la coloracion del caldo de cultivo, pero si se observo crecimiento, y al realizar la determinacion cuantitativa se observa en algunas cepas un incremento de la absorbancia en relacion al blanco, esto se debe a que los hongos han producido pigmentaciones en el medio de cultivo, alterando la lectura del espectrofotometro (Fig.3).

[FIGURA 3 OMITIR]

Identificacion de la cepa PD5F con actividades ligninoliticas

La cepa PD5F fue identificada hasta especie como Aspergillus melleus Yukawa (Egorova 1986), y esta caracterizada por tener abundante micelio, semejante a cesped, abundantes cabezas conidiales dorada-amarillentas; el lado reverso es rojo-castano. La cabeza aspergilar es esferica de 140,8 micras de diametro y tiende a elongarse en forma de columnas. La vesicula tiene un promedio de 53,5 micras de diametro. Las hifas vegetativas son hialinas y septadas. El conidioforo es amarillo y rugoso, lleva metulas y fialides con conidias de paredes lisas de 1,92-2,4 micras.

Discusion

En la primera prueba espectrofotometrica donde se utilizo el medio minimo Czapeck y lignina al 0,2%, no mostro un adecuado crecimiento ni variacion de coloracion, por lo tanto al medio utilizado se le anadio glucosa al 1%, porque la degradacion de la lignina se da con el consumo previo de la glucosa segun los trabajos realizados por Lobarzewski y Paszczynski (1985) y Olvera (2003).

De todos los hongos filamentosos aislados, unicamente Aspergillus melleus cambio la coloracion de la lignina en medio agitado a 150 RPM al cabo de 7 dias, y en condiciones estaticas se evidencio la degradacion de lignina de este hongo a los 15 dias de incubacion. La diferencia en el tiempo del cambio de coloracion se debe a que el proceso degradativo de la lignina es oxidativo, y es necesario la presencia de oxigeno (Olvera, 2003). La lignina tiene un color cafe debido a grupos cromoforos fuertemente unidos a la molecula, para que se reduzca este color es necesario la presencia de oxigeno y peroxido de hidrogeno, el proceso oxidativo causa la ruptura de los enlaces insaturados carbono-carbono de las cadenas propanoides destruyendo algunos grupos cromoforos (Lin, 1980). Por lo tanto, aireacion, presencia de oxigeno y dosis adecuada de glucosa permiten la degradacion de la lignina al cabo de 7 dias, previo consumo de la glucosa (Lobarzewski y Paszczynski 1985, Olvera 2003). Tambien es de notar que las enzimas son expresadas durante la fase secundaria del crecimiento (idiofase) cuando la limitacion de carbono, nitrogeno y sulfuro ocurre (Staszczak, 2002); sin embargo es necesario realizar estudios para evaluar que tipo de enzima esta actuando.

Estos hongos no pueden utilizar directamente lignina como su fuente de carbono y energia por ello dependen de azucares mas digeribles como los monomeros precursores de fenilpropano. La funcion primaria de la ligninolisis es exponer estos monomeros al ataque del hongo con ayuda de diferentes tipos de enzimas. En la mayoria de los hongos se ha observado que la lignolisis ocurre durante el metabolismo secundario, es decir bajo limitacion de nutrientes, lo que permite que el hongo solo sintetice y secrete agente ligninoliticos que comiencen a fragmentar el polimero (Olvera 2003, Lobarzewski y Paszczynski 1985).

Los otros hongos aislados mostraron un crecimiento muy notable en los medios Czapeck-Lignina con glucosa al 1%, esto se debio al consumo preferencial de la glucosa y en consecuencia no tendrian el potencial enzimatico adecuado para transformar la lignina al cabo de un mes en condiciones estaticas y al cabo de 15 dias en condiciones agitadas de 150 RPM. Otra observacion, fue el aumento de la absorbancia al inicio del experimento en algunas cepas, esto se explica debido a que los hongos aislados presentaron pigmentacion en el medio debido al crecimiento lo cual influyo sobre la absorbancia.

Aspergillus melleus es un hongo ligninolitico productor de micotoxinas y de enzimas tales como proteasas, esterasas, (Semeniuk et al. 1971, Palumbo et al. 2007, Ondeyka et al. 2003, Luisetti et al. 1991, Miyazawa et al. 2002) aunque no hay registros de su actividad ligninolitica en la literatura, en este trabajo se ha demostrado su capacidad en la degradacion de la lignina.

Por otro lado, el medio empleado Czapeck-Lignina tenia elementos quimicos como nitrogeno, sodio, potasio, cloro, fosfatos, sulfatos, magnesio y Hierro, pese a esto Aspergillus melleus fue capaz de degradar la lignina en el caldo de cultivo, aun no habiendo manganeso ni cobre que son los elementos necesarios. Se ha senalado que para que se active las enzima MnP y la lacasa tienen que tener concentraciones de Mn(II) y Cu minimas, en caso contrario no se detectaria la actividad de estas isoenzimas (Polanco et al. 2002, Staszczak 2002).

Agradecimientos

Al Dr. Juan Sabatier Cadalso por el valioso asesoramiento. Al Dr. Oscar Tovar y la Magister Maria Isabel La Torre, quienes ayudaron en la identificacion del material botanico en el Herbario de San Marcos (UNMSM).

Literatura citada

Betts W. & R. Dart. 1989. Initial reactions in degradation oftri- and tetrameric lignin-related compounds by Aspergillus flavus. Mycological Research 92(2):177-181.

Cardoso J. & M. Costa. 1994. Aspergilli and lignocellulosics: Enzymology and biotechnological applications. Microbiology Reviews 13(2-3):377-386.

Conesa A., C. Hondel & P. Punt. 2000. Studies on the Production of Fungal Peroxidases in Aspergillus niger. Appl. Environ. Microbiol 66(7): 3016-3023.

Choque L. y M. Sotomayor. 1989. Resumenes de investigacion en pastos y forrajes de la region sur peruana. Proyecto Alpacas. Universidad Nacional del Altiplano.181 pp.

Didier G., Z. Villca & P. Abasto.1994. Diet selection and utilization by llama and sheep in a high altitude-arid rangeland of Bolivia. Journal of Range Management 47:245-248.

Egorova, L.1986. Hongos del suelo. Instituto de biologia del suelo de la Academia de Ciencias. URSS. Editorial "Ciencia", Division de Leningrado. 207pp. (En Ruso)

Kadam K. & S. Drew. 1985. Study of lignin biotransformation by Aspergillus fumigatus and white-rot fungi using 14Clabeled and unlabeled kraft lignins. Biotechnology and Bioengineering 28(3): 394-404.

Lin, S. 1980. Process for reduction of lignin color. U. S.Patent 4184845. <http://www.freepatentsonline.com/4184845.html

Lobarzewski J. & A. Paszczynski. 1985. Lignocellulose biotransformation with inmobized Cellulose D-glucose oxidase and fungal peroxidases. Enzyme and Microbial Technology (7) 564-566.

Luisetti M., P. Piccioni, K. Dyne, M. Donnini , A. Bulgheroni , et al. 1991. Some properties of the alkaline proteinase from Aspergillus melleus. Int. J. Tissue React. 13(4):187-192.

Milstein O., Y. Vered, L. Shragina, J. Gressel, H. Flowers & A. Huttermann. 1983. Metabolism of lignin related aromatic compounds by Aspergillus japonicus. Archives of Microbiology 135(2).

Miyazawa T., M. Hiramatsu, T. Murashima & T. Yamada. 2002. Aspergillus melleus protease-catalyzed peptide synthesis using the carbamoylmethyl ester as an acyl donor in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro- 2-propanol/N,N-dimethylformamide. Biotechnology Letters. 24(23): 1945-1949.

Moore K. & H. Jung. 2001. Lignin and fiber digestion. Journal of range management 54:420-430.

Ondeyka J., A. Dombrowski, J. Polishook, T. Felcetto, W. Shoop, et al. 2003. Isolation and insecticidal activity of mellamide from Aspergillus melleus. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 30(4):220-224.

Olvera P. 2003. Aislamiento de levaduras que tengan la capacidad para degradar lignina y busqueda de algunos genes implicados en dicha degradacion. Tesis profesional presentada para obtener el titulo en maestria en biotecnologia. Escuela de Ciencias, Universidad de las Americas. Puebla-Mexico.

Palumbo J., T. O'Keeffe & N. Mahoney. 2007. Inhibition of ochratoxin A production and growth of Aspergillus species by phenolic antioxidant. Mycopathologia 164(5):241-248.

Polanco R., S. Lobos y R. Vicuna. 2002. Binding of nuclear proteins to the promoter region of the laccase gene Cs-lcs1 from the basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora. Enzyme and Microbial Technology 30:525-528.

Semeniuk G. G. S. Harshfield, C. W. Carlson, C. W. Hesseltine, & W. F. Kwolek. 1971. Mycotoxins in Aspergillus. Mycopathologia. 43(2):137-152.

Staszczak M. 2002. Proteasomal degradation pathways in Trametes versicolor and Phlebia radiata. Enzyme and Microbial Technology 30: 537-541.

Steffen K., M. Hofrichter & A. Hatakka. 2002. Purification and characterization of manganese peroxidase from the litterdecomposing basidiomycetes Agrocybe praecox and Stropharia coronilla. Enzyme and Microbial Technology 30:550-555.

Tovar O. 1960. Revision de las especies peruanas del genero Calamagrostis. En: memorias del museo de Historia Natural "Javier Prado" N0 II, 1960.

Tovar O. 1993. Las gramineas (Poaceae) del Peru. Madrid, Real Jardin Botanico de Madrid.

Presentado: 26/01/2008 Aceptado: 02/03/2009 Publicado online: 28/08/2009

Janet Laura y Pedro Castellanos

Facultad de Ciencias Biologicas, Universidad Nacional Mayor de

San Marcos, Av. Venezuela cdra.

35 s/n Ciudad Universitaria, Apartado

110058, Lima 11, Peru. Email

Pedro Castellanos: pcastellanoss@unmsm.edu.pe
Tabla 1. Cepas fungicas aisladas de Calamagrostis nitidula Pilger.

               Cepas fungicas
Tipo de paja   aisladas         Generos

erguida        P2C              Alternaria sp.
               P2F              Ulocladium sp.
               P3C              Alternaria sp.
               P3E              Trichoderma sp.
               PD1F             Mucor sp.
descompuesta   PD321            Helicomyces sp.
               PD322            Trichoderma sp.
               PD3S             Cephalosporium sp.
               PD3              Cephalosporium sp.
               PD5F             Aspergillus melleus
               PD6C             Cephalosporium sp.
               PD6F             Cephalosporium sp.

* (PE): paja erguida y (PD)muestra de paja descompuesta.
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Title Annotation:NOTA CIENTIFICA
Author:Laura, Janet; Castellanos, Pedro
Publication:Revista peruana de biologia
Article Type:Report
Date:Aug 1, 2009
Words:2621
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