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Hiperinmunizacion de ovinos contraveneno de Bothrops asper del estado Zulia, Venezuela. Estudio preliminar.

Hyperimmunization of Ovines Against Bothrops asper Venom from the Zulia State, Venezuela. Preliminary Study.

INTRODUCCION

El suero antiofidico fue producido por primera vez por Albert Calmette en 1894 [8]. A partir de entonces, este ha contribuido en la disminucion de la mortalidad por mordeduras de serpientes. Sin embargo, siguen habiendo muchos problemas asociados con la produccion de antivenenos [71].

El envenenamiento ofidico representa un grave problema medico, social y economico en muchas partes de Asia, Africa y las Americas, y es considerado un problema de Salud Publica en toda America y gran parte del mundo [9, 17, 32, 36, 42, 45, 46, 49, 57, 75]. Venezuela como pais tropical, no escapa de esta realidad debido a que es poseedora de una rica fauna, en la cual las serpientes ocupan un lugar preponderante [17, 54, 63, 65]. Por otra parte, la mayor distribucion de las mismas en el mundo se presenta en las zonas tropical y subtropical, donde la combinacion de la densidad poblacional de las serpientes, las actividades humanas al aire libre maximiza la probabilidad de que ocurra la mordedura de serpientes [54, 69]; el impacto de estos accidentes se une a la ausencia de servicios medicos modernos y apropiados entre las poblaciones humanas expuestas al mas alto riesgo [9, 75].

Los estudios epidemiologicos mas recientes de los accidentes ofidicos en el mundo sugieren que, al menos ocurren al ano, 5 millones de mordeduras por serpientes con 2,5 millones de envenenamientos y 125.000 muertes [14, 69, 75, 76].

Debido a que las condiciones socio-economicas en Venezuela son deficientes, los datos epidemiologicos que se obtienen sobre el ofidismo no escapan de ser escasos e incompletos, de manera que la magnitud real del problema es muy dificil de determinar [17, 46, 54, 59].

Para el lapso comprendido entre 1998-2004 se reportaron en el pais un promedio de 6.094 casos de mordeduras de serpientes por ano [38].

En el estado Zulia, el riesgo de sufrir un accidente ofidico es muy elevado debido a la gran cantidad de actividades agricolas y mineras que en el se desarrollan. La ocurrencia por mordeduras de serpientes para el estado Zulia en el periodo 1998-2004 fue de 717 casos al ano, con un promedio de 5 muertes anuales [38].

Las publicaciones sobre las serpientes venenosas y sus problemas medicos en Venezuela, salvo por algunos autores, son escasas y carecen de estudios sistematicos que den informacion sobre distribucion de especies en el territorio nacional [57].

La falta de conocimiento de la fauna ofidica ofensiva al hombre, la accion de sus venenos sobre los tejidos humanos, los aspectos clinicos y terapeuticos, mas que un descuido de la creacion del conocimiento autoctono, se ha debido a los escasos investigadores venezolanos dedicados a estos temas y por supuesto, a los infimos recursos que dedica el Estado al referido problema [57].

En Venezuela, el mayor numero de accidentes por mordeduras de serpiente es ocasionado por el genero Bothrops, con una ocurrencia del 80%, esto debido a su amplia distribucion en el territorio nacional, su agilidad y a la toxicidad de su veneno [17, 36, 54, 57, 59, 63, 65].

Los adelantos en materia de produccion de antivenenos se basan principalmente en publicaciones cientificas que evidencian el esfuerzo de los investigadores en producir propuestas para la mejora del suero antiofidico, no solo tomando en cuenta el rendimiento, como se hacia hasta hace pocos anos, sino, que mas recientemente han enfocado otro problema de fondo, como es encontrar la forma de disminuir las reacciones adversas con que los antivenenos se manifiestan, mediante el desarrollo de nuevas tecnicas que pueden ofrecer algunas soluciones [1-5, 12, 13, 15, 20, 21, 24, 25, 27-30, 33-35, 41, 47, 48, 52, 64, 66-68].

Finalmente, la limitacion ha sido que las nuevas tecnicas usadas por los investigadores en el area, son prohibitivas para los paises donde este problema es mas relevante, por ser paises subdesarrollados, donde los recursos para este fin son limitados, por lo que el reto ahora es conseguir la manera de producir un antiveneno que sea inocuo, efectivo, economico y que se pueda distribuir ampliamente [75].

Existe una importante variabilidad en la composicion del veneno de serpientes interfamilia, intergenero, interespecies, intersubespecies e intrasubespecie, variaciones geograficas, entre especimenes individuales, y en especimenes individuales debidas a variacion estacional, dieta, habitat, edad, dimorfismo sexual, esta variabilidad del veneno tiene impacto, tanto en la investigacion del veneno como en el manejo de la mordedura de serpientes, incluyendo la seleccion de antivenenos y la seleccion de especimenes para la produccion de antivenenos [10, 13, 19, 33, 41, 44, 46, 49, 73, 74]. Es necesario producir antiveneno ofidico restringiendo la especificidad de los anticuerpos contra los venenos provenientes de las serpientes autoctonas de las regiones, donde este se va a aplicar, ya que reduce la cantidad a inyectar en los pacientes, por ser mas especifico [19, 73, 74].

El resultado severo y ocasionalmente fatal del envenenamiento ocasionado por la mordedura de serpientes venenosas se previene exclusivamente con la administracion de suero antiofidico [8, 27, 31, 61, 76].

Desde hace mas de un siglo, el caballo ha sido el animal utilizado para la produccion de antivenenos debido a su facil manejo, gran volumen sanguineo y plasmaferesis. A pesar de estas ventajas, existen numerosos factores importantes a considerar en la produccion de antivenenos, tales como: costos de adquisicion y mantenimiento e inmunorespuesta local exacerbada, lo cual resulta en la formacion de grandes abscesos, fistulas y fibrosis en el lugar de la inoculacion [4, 8, 22, 23, 67]. La administracion de inmunoglobulinas de origen equino con frecuencia causa una reaccion de hipersensibilidad mediada por complejos inmunes tipo III, debido a la bivalencia de esas moleculas y al hecho de que los caballos inmunizados tienen niveles altos de IgGt circulantes, la cual no ha sido detectada en ovinos. Ademas muchos pacientes a quienes se les administra el antiveneno de origen equino manifiestan sensibilidad a sus proteinas debido a una exposicion previa y pueden desarrollar una reaccion anafilactica tipo I [24, 40, 42, 43, 67].

El problema de contar con un tratamiento adecuado para los pacientes sensibles al suero equino ha conducido al desarrollo de tecnicas de inmunizacion utilizando animales alternativos [16,53], tales como: conejos, caprinos, bovinos, gallinas, perros, ovejas; los cuales han mostrado buenos resultados a nivel experimental, enfatizando que la oveja, se utiliza en la produccion de antiveneno comercialmente en la India, Australia, EUA y Reino Unido [33].

Los excelentes resultados obtenidos en ovinos para la produccion de antivenenos se deben a su facil manejo y mantenimiento, son economicos, buena respuesta inmunologica, son resistentes, ausencia de reacciones locales, permitiendo asi la obtencion de un antiveneno efectivo, de bajo costo y que provee buena proteccion [1, 5, 6, 24, 29, 33, 35, 37, 39, 42, 43, 56, 67, 68].

El objetivo del presente trabajo consistio en hiperinmunizar ovinos con venenos provenientes de serpientes Bothrops asper zulianas, para evaluar su respuesta humoral y contribuir en la produccion de antivenenos autoctonos.

MATERIALES Y METODOS

Ubicacion del estudio

La investigacion se realizo en la Unidad de Investigaciones Ofidiologicas (U.I.O) de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad del Zulia en la ciudad de Maracaibo, estado Zulia, Venezuela. El clima es calido-humedo con una temperatura promedio de 26-30[grados]C.

Veneno

El veneno se obtuvo de un lote de 20 serpientes Bothrops asper, colectadas en diferentes Municipios del estado Zulia: (2 de Cabimas, 2 de Lagunillas, 2 de Mene Grande, 2 de Machiques de Perija, 2 de Rosario de Perija, 3 de Burro Negro, 4 de Mara, 2 de La Canada de Urdaneta, 1 de Colon) y mantenidas en cautiverio en el bioterio de serpientes de la U.I.O. Una vez extraido el veneno, se congelo, liofilizo, se determino su [DL.sub.50] (7,37 mg/kg de peso) y se mantuvo a una temperatura de -20[grados]C [25].

Unidades Experimentales

Se utilizaron cuatro ovinos adultos, de 12 a 17 meses de edad, machos, sanos, raza mestizo criollo-West African, cuyos pesos oscilaron entre 30 y 40 Kg y nunca antes inoculados con ningun tipo de veneno. En dichos animales, la condicion general y parametros clinicos de salud eran normales. Previo a la inmunizacion, los ovinos se dejaron en un periodo de adaptacion de dos meses, sometiendose a un programa de control parasitario y de enfermedades infecciosas. Ademas, fueron evaluados clinicamente cada semana, mientras se aplico el programa de inmunizacion. Su alimentacion consistio en pasto de corte picado (Buffle), heno y una mezcla de alimento concentrado en "pellets", reforzado con vitaminas y minerales en proporciones y calidades adecuadas a sus necesidades nutricionales.

Inoculos

A partir de una solucion madre: 1% del veneno liofilizado en solucion salina fisiologica (0,85% NaCl) y esterilizada por filtracion (Millipore 0,22 [micron]n), se prepararon los inoculos. Aquellos correspondientes a las dos primeras inoculaciones fueron elaborados preparando emulsiones con adyuvante Completo de Freund para la primera inoculacion e Incompleto para la segunda inoculacion; el inoculo fluido para las inoculaciones 3, 4 y 5, consistio en una mezcla de veneno en solucion salina fisiologica. Las dosis administradas por animal se presentan en la TABLA I.

Inmunizacion y Sangrias

Los ovinos fueron inoculados por via subcutanea, previo rasurado y desinfeccion, en la tabla del cuello y en la porcion dorso-lateral de la region costal y lumbar.

Las dosis aplicadas se basaron en los esquemas utilizados en el Instituto Butantan, Brasil [62] y en el Centro de Biotecnologia de la Universidad Central de Venezuela [11], ajustando la dosis de veneno y la cantidad de adyuvante de acuerdo al peso del ovino y utilizando veneno de serpientes procedentes exclusivamente del estado Zulia.

Antes de comenzar el esquema de inmunizacion, se extrajo una muestra de sangre a cada ovino con el objeto de demostrar, en ratones, la ausencia de anticuerpos neutralizantes contra el veneno bothropico que se empleo, para su posterior inclusion en el programa de inmunizacion, TABLA II.

De cada ovino se obtuvo 20 ml de sangre de la vena yugular en 9 oportunidades. La misma fue recogida en Erlenmeyers esteriles, en solucion de citrato de sodio al 17,5%, en proporcion de 5 ml de citrato por cada, 100 ml de sangre. Se agito suavemente durante la sangria. Luego el plasma se centrifugo a 7000 rpm por 30 minutos, una vez separado se hizo un pool del mismo y se coloco en bano maria a 56[grados]C por 30 minutos para eliminar el fibrinogeno y el complemento. Se filtro con Millipore 0,22 [micron]n y se preservo a una concentracion final de 0,4% con una solucion de eter-fenol al 50% [11], distribuido en alicuotas de 10 ml y mantenido a -20[grados]C hasta ser usado [25].

Neutralizacion de la letalidad

La neutralizacion de la letalidad se determino calculando la Dosis Efectiva Cincuenta ([DE.sub.50]) del suero de los ovinos hiperinmunizados utilizando el metodo de Spearman-Karber y se expreso en ug de veneno neutralizado por ml de suero [11, 46].

Se prepararon tubos de ensayo con una cantidad fija del suero problema y diluciones seriadas del veneno y la dilucion control positivo, se incubaron durante 30 minutos a 37[grados]C. Luego, cada una de las diluciones fue evaluada por triplicado en una cantidad no mayor de 1 ml, conteniendo 2 [DL.sub.50] (280 [micron]g) por raton e inoculada intraperitonealmente a grupos de 5 ratones albinos no isogeneticos, de 19 a 21 g de peso corporal, [7]. Los ratones muertos y sobrevivientes se registraron durante 48 horas [22] y la data se utilizo para la determinacion de la [DE.sub.50]. Con la media correspondiente del triplicado de cada dilucion, se grafico el comportamiento de la respuesta inmunologica del conjunto de ovinos del grupo experimental durante 56 dias.

Analisis Estadistico

Se resume la informacion a traves de metodos estadisticos de posicion y dispersion, entre ellos: media, error estandar, coeficiente de variacion y numero de muestras. Graficando, se obtiene la curva tiempo-respuesta para evidenciar el tiempo de aparicion del titulo neutralizante optimo.

Para analizar la relacion entre el titulo de anticuerpos y el tiempo expresado en dias, se ajusto un modelo de regresion no lineal. El paquete para estimar este modelo fue el "Curve Expert" en su version 1,3 [18]; dicho software selecciona entre varios modelos, el modelo de mejor ajuste, basandose en el criterio de mayor coeficiente de correlacion y menor error estandar de estimacion. Entre varios modelos probados, el de mejor ajuste resulto ser el conocido como "Funcion Racional" cuya expresion es:

y = [a + bx]/[1 + cx + [dx.sup.2]]

donde a, b, c y drepresentan los parametros encontrados por el paquete y proporcionan la forma de la curva que mejor ajusto la data experimental dentro de un grupo de 30 modelos probados, "x" el tiempo en dias e "y" la taza de neutralizacion expresada en ug de veneno neutralizado por ml de suero.

RESULTADOS Y DISCUSION

En relacion al estado general de los ovinos, no hubo alteraciones, determinando que todos estaban en buenas condiciones de salud. Tampoco hubo alteraciones locales en el sitio de inoculacion del veneno.

La produccion de anticuerpos contra el veneno de Bothrops asper del estado Zulia, determinada por su capacidad para neutralizar la letalidad en ratones, mostro diferencias individuales en la magnitud de las respuestas de los 4 ovinos sometidos al esquema de hiperinmunizacion, observandose un incremento paralelo de ug de veneno neutralizado por ml de suero antiofidico, desde el dia 0 al dia 14 del esquema, TABLA II y FIG. 1; a partir de este momento, se notan marcadas diferencias individuales en el aumento de los niveles de respuesta. A pesar de esta variabilidad, se evidencian rasgos comunes en el comportamiento de las cuatro curvas.

Segun el modelo utilizado, resulto una curva caracteristica, mostrando un titulo promedio, maximo y optimo en las muestras correspondientes al dia 21 posterior a la primera inoculacion; luego se observa un descenso paulatino del titulo neutralizante hasta el dia 56, ultima sangria, donde muestra el titulo promedio mas bajo, FIG. 2, con un coeficiente de correlacion r = 0,7626, lo cual evidencia que, aproximadamente el 76% de la variabilidad de la respuesta total (titulo de neutralizacion) se puede explicar por el tiempo en dias trascurrido desde el dia 0 al 56. El 24% restante de la variabilidad, puede estar representada por la zona geografica, razones climatologicas, raza, factores de especie, factores individuales, ambientales y esquemas de inmunizacion, incidiendo en forma definitiva sobre la respuesta; los mismos fueron estrictamente controlados en el presente trabajo, pero no se obtuvo reportes de observaciones de este tipo para poder comparar.

De acuerdo a la magnitud de las medias de las sangrias por dia, TABLA III, se aprecia que el titulo de anticuerpos optimo fue de 705,5 [micron]g/ml de suero, alcanzado en la sangria del dia 21, despues de la primera inoculacion y la mas baja fue de 308 [micron]g/ml de suero en la sangria del dia 56.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

Aun cuando la produccion de Suero Antiofidico se sigue haciendo con la metodologia tradicional en equinos usando protocolos de produccion derivados del metodo basico descrito por Pope [50,51] y modificado por Harms [26], el cual se basa en digestion con pepsina a pH bajo y precipitacion con sulfato de amonio [55, 74]; durante los ultimos diez anos, hay grupos de investigadores que han publicado propuestas diferentes utilizando cambios en el proceso de concentracion y purificacion de anticuerpos [29, 37, 47, 55, 58, 60], en los esquemas de inmunizacion [15,52,71], en el tipo de adyuvante [24, 30, 34, 52], modificacion del veneno [13, 25, 34, 70, 71] y uso de otras especies diferentes al equino [20, 24, 27, 53, 70, 72], para tratar de minimizar los problemas adversos que con este producto manifiestan los pacientes. El resultado de este trabajo se considera como una alternativa en la produccion de antivenenos en otras especies animales.

Existe muy poca informacion en la literatura cientifica revisada, relacionada con el desarrollo de la respuesta inmune en animales inmunizados para la produccion de antivenenos, lo cual coincide con lo reportado por Estrada y cols. [22, 23].

El estudio de la respuesta de anticuerpos neutralizantes en animales utilizados en la produccion de suero antiofidico, se ha efectuado investigando la capacidad del suero para neutralizar el efecto letal de un determinado veneno [22].

En este trabajo se evaluo la respuesta inmunologica de cuatro ovinos inyectados con veneno de la serpiente Bothrops asper del estado Zulia, midiendo la produccion de anticuerpos contra los componentes responsables de la letalidad del veneno, observandose una marcada variabilidad individual en la respuesta de anticuerpos, excepto durante la primera etapa del esquema de inmunizacion, donde la respuesta fue homogenea, concordando con Estrada y cols., Gutierrez y cols. y Montilla y cols. [23, 25, 39].

Al inocular ovinos con veneno bothropico, se obtuvo un titulo neutralizante optimo a los 21 dias despues de la primera inoculacion, coincidiendo con lo reportado por Montilla y cols. [39], inoculando ovinos con veneno crotalico y difiriendo con lo reportado por Rolim y cols. [62], al inocular veneno crotalico y con el Centro de Biotecnologia de la Universidad Central de Venezuela (U.C.V) [11], inoculando un pool de veneno crotalico y bothropico, los que inmunizando equinos, encontraron respuestas maximas de anticuerpos a los 28 dias, diez dias despues de la ultima inoculacion. Estrada y cols. [22] reportaron en equinos inoculados con un pool de veneno bothropico, crotalico y lachesico, titulos neutralizantes maximos de la actividad de la fosfolipasaAalos 110 dias. Bolanos y Cerdas [7], reportaron en ovinos y equinos, entre los 230 y 255 dias, la obtencion de una respuesta maxima de anticuerpos neutralizantes para venenos de la subfamilia crotalinae. Ferreira y cols. [24] reportaron en ovinos inmunizados con veneno bothropico, un titulo maximo de anticuerpos neutralizantes entre 30 y 40 dias despues de la primera inoculacion.

El titulo neutralizante optimo en suero crudo obtenido en el presente estudio fue de 705,5 [micron]g/ml de suero, mientras que Bolanos y Cerdas [7] reportan que, el suero crudo preparado en ovinos presenta una actividad neutralizante frente al veneno de Bothrops asper de 1000 a 2000 [mciron]g/ml y en equinos reportan los mismos valores que en los ovinos en la actividad neutralizante de los venenos de la subfamilia crotalinae. Rolim y cols. [62] reportan contra veneno bothropico 1000 [micron]g/ml de suero de origen equino como titulos considerados satisfactorios en el Instituto Butantan en Brasil. Es posible que la diferencia de los resultados reportados se deba a que dichos autores han trabajado con otras especies animales de distintas zonas geograficas, diferentes venenos y/o esquemas de inmunizacion.

Si se compara los resultados obtenidos en el presente estudio, con los reportados por Montilla y cols. [39], en un estudio similar pero utilizando veneno crotalico, se puede ver que a los 21 dias, en el caso del veneno crotalico, el suero crudo de ovinos hiperinmunizados fue capaz de neutralizar 40 [DL.sub.50], mientras que en el caso del veneno bothropico el suero crudo de ovinos hiperinmunizados neutralizo 5 [DL.sub.50]; esta diferencia puede ser debida probablemente, a que el veneno Bothropico, utilizado sea menos antigenico que el veneno crotalico o a cualquier otro factor inherente a la gran variabilidad de los venenos ofidicos, como lo reporta Chippaux [14].

Existen pocos reportes relacionados con alteraciones de los animales inoculados con venenos de serpientes para la produccion de antivenenos.

Durante la realizacion de este trabajo, no se presento ningun tipo de alteracion aparente en la salud de los ovinos sometidos al esquema de inmunizacion, todos estaban en muy buenas condiciones, a excepcion de unos pequenos nodulos que aparecieron a nivel del cuello en los puntos de inoculacion del veneno cuando el preparado tenia adyuvante, desapareciendo espontaneamente sin tratamiento alguno, coincidiendo con Ferreira y cols. [24], Landom y cols. [33], Netto y cols. [42, 43] y Sjostrom y cols. [67], lo que sugiere una mayor resistencia del ovino al ser sometido a inoculaciones de veneno de serpientes en comparacion con el equino, el cual presenta un exacerbada respuesta local que resulta en grandes abscesos, fistulas y fibrosis en el sitio de inoculacion del veneno [4, 22, 23, 42, 43, 67].

CONCLUSIONES

La evaluacion de la respuesta inmunologica de los animales sometidos a protocolos de hiperinmunizacion por primera vez, debe hacerse en forma individual, para facilitar la seleccion de los animales con buena respuesta, asegurando que mediante la aplicacion de esta medida, se mejorara el rendimiento en cualquier centro de produccion de suero antiofidico.

El ovino es un animal potencial para ser usado en la produccion de suero antiofidico por constituir una especie economica, resistente, de facil manejo, buenos productores de anticuerpos y representa una alternativa para los pacientes alergicos al suero antiofidico equino.

Los resultados obtenidos en esta investigacion aportan datos de interes para investigaciones futuras y para investigadores en el area de produccion de sueros hiperinmunes en la region y en el pais, ya que existen pocos reportes al respecto.

Esta investigacion sirve de apoyo al desarrollo de un suero antiofidico autoctono de gran especificidad, ya que los ovinos se inocularon con venenos de serpientes propias de la region.

RECOMENDACIONES

Debido a la excelente resistencia de los ovinos a las inoculaciones con el veneno utilizado, se recomienda para futuras investigaciones elevar la dosis y el numero de inoculaciones de este con el fin de incrementar el titulo de anticuerpos.

Recibido: 03/04/2006. Aceptado: 16/04/2007.

AGRADECIMIENTO

Los autores desean agradecer al Consejo de Desarrollo Cientifico y Humanistico de la Universidad del Zulia (CONDES), por el financiamiento de la presente investigacion.

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Juan R. Montilla F., Maria V. Alvarez de M., Elvira E. Diaz Z. y Saulo H. Urdaneta V.

Unidad de Investigaciones Ofidiologicas. Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad del Zulia, Apartado 15252. Maracaibo 4005-A, estado Zulia, Venezuela. E-mail: jumontilla@luz.edu.ve
TABLA I

ESQUEMA DE INMUNIZACION BASICO CON VENENO BOTHROPICO EN
OVINOS/ BASIC INMUNIZATION SCHEDULE WITH BOTROPIC VENOM
IN OVINES

Dias   Veneno mg   Adyuvante   Sangrias     Titulacion
                                          de anticuerpos

0         0,1         FC          Si            Si
7         0,1         FI          Si            Si
14        0,1         SSF         Si            Si
16        0,1         SSF         No            No
18        0,1         SSF         No            No
21        --          --          Si            Si
28        --          --          Si            Si
35        --          --          Si            Si
42        --          --          Si            Si
49        --          --          Si            Si
56        --          --          Si            Si

FC: Adyuvante de Freund completo FI:Adyuvante de Freund
incompleto SSF: Solucion Salina Fisiologica.

TABLA II

NEUTRALIZACION DEL VENENO DE Bothrops asper
DEL ESTADO ZULIA, EXPRESADO EN [micron]g/ml.
NEUTRALIZATION OF Bothrops asper VENOM OF ZULIA
STATE EXPRESSED IN [micro]g/ml

             Ovejo 1   Ovejo 2   Ovejo 3   Ovejo 4

Sangria 0       0         0         0         0
Sangria 7      280       300       296       300
Sangria 14     330       372       360       384
Sangria 21     593       770       619       840
Sangria 28     395       514       409       641
Sangria 35     379       390       336       440
Sangria 42     336       379       320       403
Sangria 49     300       336       305       375
Sangria 56     292       308       292       340

TABLA III

RESUMEN DE ESTADISTICA DESCRIPTIVA/DESCRIPTIVE
STATISTICS SUMMARY

Dia de             X              ES       CV     N
Sangria

0                  0              0        0      4
7         294,00 [micron]g/ml   4,761    3,2387   4
14        361,50 [micron]g/ml   11,587   6,4103   4
21        705,50 [micron]g/ml   59,434   16,849   4
28        489,75 [micron]g/ml   56,982   23,270   4
35        386,25 [micron]g/ml   21,371   11,066   4
42        359,50 [micron]g/ml   19,116   10,635   4
49        329,00 [micron]g/ml   17,277   10,503   4
56        308,00 [micron]g/ml   11,314   7,3466   4

X: Media ES: Desviacion Estandar CV: Coeficiente de
Variacion N: Numero de animales.
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Author:Montilla F., Juan R.; Alvarez de M., Maria V.; Diaz Z., Elvira E.; Urdaneta V., Saulo H.
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Date:Nov 1, 2007
Words:6317
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