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Hidrolisis enzimatica de residuos de la cosecha de cana de azucar.

Hydrolysis Enzymatic of crop residues sugar cane

Introduccion

En el Valle del Cauca (Colombia) se siembran alrededor de doscientas mil hectareas de cana y se cosechan 16 millones de toneladas de cana de azucar por ano (Cenicana, 2007). Esta produccion genera en el Valle del Cauca abundantes desechos lignocelulosicos, alrededor de 7 millones de toneladas por ano constituidos principalmente por las hojas y cogollos, los cuales pueden ser aprovechados en la produccion de combustibles de segunda generacion. Entendiendo este escenario, es necesario buscar alternativas tecnologicas que permitan la conversion a azucares fermentables de estos residuos agricolas. En este trabajo se evaluan experimentalmente parametros de modelos cineticos de la hidrolisis enzimatica encontrados en la literatura, utilizando como sustratos residuos de la cosecha de cana de azucar (hojas y cogollos), para que puedan ser utilizados en la modelacion y simulacion de procesos de obtencion de alcohol carburante.

La hidrolisis enzimatica de la celulosa es una reaccion de pasos multiples que toma lugar en un sistema heterogeneo, en el cual la celulosa insoluble se fracciona en la interface solido--liquido por la accion sinergica de la [beta]-1-4 endoglucanasa, [beta]-1-4 exo celobiohidrolasas, [beta]-1-4 glucan hidrolasas y las [beta]-1-4 glucosidasas (Selby et al., 1976; Kadam et al., 2004; Kubicek, 1992; Zhang et al., 2004). Numerosos intentos se han hecho experimentalmente para encontrar modelos que describan los mecanismos de inhibicion de glucosa y celobiosa sobre celulasas, entre los que se encuentran: modelos competitivos, no-competitivos o mezclados en concordancia con los esquemas clasicos de Michaelis-Menten (Philippidis et al., 1993; Beltrame et al., 1984; Al-zuhair et al., 2007; Kadam et al., 2004; Gruno et al., 2004). Tambien, ha sido evaluada la inhibicion por celobiosa sobre diferentes sistemas enzimaticos celuliticos usando principalmente Celulosa "pura" (Andric et al, 2010). En la busqueda de la produccion de alcohol carburante de residuos de cana de azucar se han propuesto diferentes alternativas para la produccion de azucares fermentables como la hidrolisis quimica (Rodriguez-Chong et al., 2004; Geddes et al., 2010) y diferentes pretratamientos del material lignocelulosico seguido de hidrolisis enzimatica (Fuentes et al., 2011; Adsul et al., 2005; Rolz et al., 1987; Martin et al., 2002).

Materiales y metodos

Las hojas y cogollos usados en este estudio provienen de los residuos de cosecha de dos variedades Colombianas de cana de azucar cultivadas en el Valle del Cauca (CC 8475 - CC 8592), siendo suministradas por el Centro de Investigaciones de la Cana de Azucar "CENICANA"

Pretratamiento de residuos de cosecha de cana de azucar

Los residuos de la cosecha de la cana que se usaron en esta investigacion, se sometieron a secado y molienda hasta que el 94.5% del material pasara una malla 10 (2 mm) y el 22% una malla 60 (0.25 mm). Se preparo un sustrato obtenido por un tratamiento con organosolvente, con alcohol etilico al 45% v/v como solvente, hidroxido de sodio al 3% p/v como catalizador, se utilizo una relacion solido/liquido de 1:8 p/v. La reaccion se llevo a cabo en un reactor de 10 litros durante dos horas a una temperatura de 160[grados]C (Mutis, 2009). El material obtenido se lavo y seco y se le denomino S1 (ver tabla 1).

El sustrato S1, se continuo deslignificando para separar hemicelulosa. Inicialmente, se le adiciono acido sulfurico 1N hasta un pH de 5, manteniendo una relacion solido/liquido 85:15 p/v. Seguidamente, se agrego EDTA en relacion de 1/1000 p/p con respecto al material solido. La mezcla se agito a 1000 rpm durante10 minutos, luego se filtro y se lavo el solido con agua suficiente para lograr un pH neutro. Luego, este solido se disolvio con hidroxido de sodio 1N, hasta llevar la mezcla a un pH de 10.8, con una relacion solido/ liquido de 85:15 y agregando 4% de peroxido de hidrogeno con respecto al solido, durante dos horas. Despues, se filtro, lavo y seco. A este sustrato, se le denomino sustrato S2. Para el analisis composicional de los sustratos, se utilizo el metodo Van Soest (Van Soest, 1893).

Coctel de enzimas

La enzima usada en esta investigacion estuvo compuesta por un preparado enzimatico de mezclas de enzimas comerciales donadas por Genecor[R] International. Las cuales tuvieron las siguientes actividades: Celulasa 27.53 unidades de papel filtro/ml, Endoglucanasa 1782.1 CMC/ml, Exoglucanasa 0.37 UI/ml, [beta]-glucosidasa 550 p NPG U/ml, Xilanasa 28.23 UI/ ml, Galactosidasa 7.11 UI/ml, Mananasa 2.76 UI/ml, Ramnosidasa 14.63 UI/ml. Este coctel se caracterizo por la distribucion de sus actividades enzimaticas, las cuales estan dirigidas a la degradacion de celulosa y hemicelulosa; ademas del alto contenido de actividad [beta]-glucosidasa, que genera una mayor velocidad de degradacion de celobiosa (Salcedo et al., 2010).

Evaluacion del pH y temperatura sobre la actividad de la enzima

El sustrato S1 se utilizo para determinar las condiciones de temperatura y pH a los que puede operar la enzima. Las actividades enzimaticas fueron determinadas por los metodos descritos por Stemberg et al., 1977; Mandels et al., 1976; Ghose, 1987; Megazyme, 2009; Jong-Rok et al., 2008. Se recurrio a un diseno experimental rotacional compuesto con puntos estrellas para evaluar la relacion entre las variables pH y temperatura, en un diseno factorial para la combinacion del tiempo de reaccion en dos niveles (1 y 3 horas) y pH en cinco niveles (3.5, 3.8, 4, 4.5 y 5). Las reacciones enzimaticas se realizaron en tubos de ensayo de 10 ml, como medio de calentamiento se uso un bano termostatado con control de temperatura. Se utilizo una relacion enzima/sustrato de 0.3 ml/g, en cinco mililitros de buffer citrato de sodio 0.05 M. Cada 10 minutos se agitaron las muestras hasta cumplir el tiempo de reaccion. Al final de cada ensayo, las muestras se sometieron a centrifugacion a 5000 rpm en una centrifuga Marca Beckman[R], Modelo 5414. El liquido sobrenadante se centrifugo a 14000 rpm a -5 [grados]C durante 10 minutos. Al nuevo sobrenadante se le determino los azucares reductores por el metodo DNS (Miller, 1959).

Determinacion del modelo cinetico

La informacion recolectada para validar los modelos cineticos, se obtuvo a partir de reacciones de hidrolisis enzimaticas de residuos de cana de azucar. Estas reacciones se realizaron en matraces de 250 ml con una agitacion de 250 rpm. Al material pretratado (S2), se le adicionaron 100 ml de una solucion buffer 0.05 M de citrato de sodio a pH 4.2 y temperatura de 50[grados]C. Se mantuvieron relaciones enzima (ml)/sustrato (gr) de 1.5, 0.75, 0.5, 0.375, 0.25, 0.187. Los tratamientos se realizaron por triplicado durante 51 horas, coleccionando muestras para analisis a (0, 0.5, 1, 1.5, 2, 6, 9, 24, 27, 33, 48 y 51 horas). Las muestras recolectadas se sometieron a centrifugacion a -5[grados]C durante 10 minutos, al liquido sobrenadante se le determino azucares reductores por el metodo DNS. La cuantificacion de glucosa y celobiosa se hizo por cromatografia liquida, empleando un equipo HPLC Shimadzu con una columna Sugar Pack I, detector de Indice de refraccion con agua como fase movil a flujo de 0.4 ml/min y un tiempo de retencion promedio de 8.6 minutos para celobiosa y 11.5 para glucosa. Para la medicion de glucosa y celobiosa las muestras se centrifugaron a 14000 rpm a -5[grados]C por 30 minutos, para luego proceder a la precipitacion de proteinas con acetona (CIN-VESTAV-UGPM, 2009). Seguidamente se sometieron a rota-evaporacion a 40[grados]C y 450 mbar a 50 rpm para retirar la acetona, finalmente se retoma la centrifugacion por 10 minutos y se somete a filtrado (0.22 [micron]m). Con la informacion recolectada se construyeron curvas de progreso para la produccion de azucares reductores y glucosa. El porcentaje de conversion se calculo a traves de la Ecuacion 1 (Ghose, 1987).

x% = ([Azucares reductores (g/i)/Conc Sustrato (g/i)] x 0.9) x 100 (1)

Determinacion de los parametros cineticos (Michaelis--Menten)

Con los datos de azucares reductores obtenidos de las curvas de progreso para diferentes concentraciones iniciales de sustrato, se determinaron las velocidades iniciales, a partir de las pendientes cuando el tiempo tiende a cero (Marangoni, 1987; Dixon et al., 1979; Duarte, 1995). Por este metodo se calculo la constante de Michaelis--Menten ([K.sub.m]) y la velocidad maxima ([V.sub.max]).

Evaluacion de la inhibicion por sustrato

Se basa en la determinacion de la velocidad inicial de hidrolisis, con el objetivo de evitar altas concentraciones de producto que incidan sobre la velocidad intrinseca de reaccion. Se consideraron, como variable independiente la relacion enzima/concentracion de sustrato (E/S) y como variable dependiente la velocidad inicial de hidrolisis. Para confirmar los modelos de inhibicion incompetitiva por sustrato, inhibicion no competitiva por sustrato (ecuaciones 2 y 3), se utilizo la metodologia propuesta por Alberty (2008). Estas ecuaciones se reordenaron, formulandose las ecuaciones 4 y 5, las cuales pueden ser expresadas por un modelo en funcion de las constantes a, b y c (ver ecuacion 6). A traves de la construccion de figuras de la relacion Sustrato/ Velocidad de reaccion (S/V) contra la concentracion de sustrato (S), conjuntamente con un analisis de regresion polinomial y de un analisis de regresion no lineal basado en el algoritmo Marquardt recurriendo al software estadistico STATGRAPHICS[R], se calculo la constante cinetica de inhibicion por sustrato ks

v = [SV.sub.max]/[S + [K.sub.m] + [[S.sup.2]/[K.sub.s]]] (2)

v = [SV.sub.max]/[S + [K.sub.m](1 + [S/[K.sub.s]]) + [[S.sup.2]/[K.sub.s]]] (3)

S/V = [[K.sub.m]/[V.sub.max]] + (1/[V.sub.max])S + (1/[[K.sup.s][V.sub.max]])[S.sup.2] (4)

S/V = [[K.sub.m]/[V.sub.max]] + (1/[V.sub.max])(1 + [[K.sub.m]/[V.sub.max]]) (5)

S + (1/[[K.sub.s][V.sub.max]])[S.sup.2] (6)

S = Concentracion de sustrato g/L, V = velocidad de reaccion g/(L h)

Modelos de Inhibicion por producto

Evaluada la constante de Michaelis-Menten y la velocidad maxima, se procede con la evaluacion de las constantes cineticas de los modelos que presenten inhibicion por productos. Entre los modelos cineticos analizados se encuentran aquellos que tienen en cuenta la inhibicion representada por todos los productos generados durante la reaccion, que son expresados como la conversion total de azucares reductores (X), Ecuaciones 7, 8 y 9. Ademas, se analizaron modelos que especifican la injerencia de la glucosa como inhibidor, tomando como base el modelo general de inhibicion propuesto por Bezerra et al. (2004). Todos los modelos cineticos propuestos se basaron en la integracion matematica de modelos tipicos de inhibicion como son: modelos de inhibicion competitiva, incompetitiva, no-competitiva y mezclada. Los modelos tenidos en cuenta son representados por las ecuaciones 10, 11, 12 y 13. La determinacion de los parametros de inhibicion de los modelos cineticos, se baso en el balance de masa en un reactor por lotes de la hidrolisis enzimatica (Coraza et al., 2005; Orsi et al., 1979; Chau et al., 1977). Para la evaluacion de los parametros cineticos a partir de los datos experimentales, se utilizo un analisis de regresion no lineal basado en el algoritmo Marquardt, a traves del software estadistico STATGRAPHICS[R].

Modelo competitivo (ITP1):

t = [1/[V.sub.max]][[XS.sub.0] - [K.sub.m]([[k.sub.i] + [S.sub.0]]/[[k.sub.i] - [K.sub.m]])ln(1 - X)](1 - [[K.sub.m]/[k.sub.i]]) (7)

Modelo incompetitivo (ITP2):

t = [XS.sub.0]/[V.sub.max](1 + [[S.sub.0]X/2[k.sub.i]]) - [[K.sub.m]/[V.sub.max]]ln(1 - X) (8)

Modelo mezclado y no-competitivo (ITP3):

t = 1/[V.sub.max]([XS.sub.0] - [[[K.sub.m]([k.sub.i] + [S.sub.0]]/[k.sub.i] + [[k.sub.i][XS.sub.0]/2[k.sub.ii]]]ln(1 - X))(1 + [[S.sub.0]X/2[k.sub.ii]] - [[K.sub.m]/[k.sub.i]]) (9)

Inhibicion competitiva (IC):

[EXPRESION MATEMATICA IRREPRODUCIBLE EN ASCII] (10)

Inhibicion incompetitiva (IIC):

t = [[S.sub.0]X/[V.sub.max]] - [[K.sub.m]/Vmax]]ln(1 - X) + [[S.sup.0][A.sub.0]/[V.sub.max][k.sub.i][(k + 1).sup.2]][[e.sup.(k+1)X-1] - [1/e]] (11)

Inhibicion no-competitiva (INC):

[EXPRESION MATEMATICA IRREPRODUCIBLE EN ASCII] (12)

Inhibicion no-competitiva y mezclada (INCM):

[EXPRESION MATEMATICA IRREPRODUCIBLE EN ASCII] (13)

Resultados y discusion

Caracterizacion de los sustratos y enzimas obtenidas

Los residuos de la cosecha de la cana de azucar tenian un contenido porcentual (p/p) de celulosa de 37.6%, hemicelulosa 34.6 %, lignina de 21.2 3% y un numero de Kappa de 47 (Gomez, 2010). Despues del pretratamiento, el sustrato S1 alcanzo un contenido de celulosa de 80.53, hemicelulosa de 13.35 %, lignina de 1.35 % y numero de Kappa de 5.85. De la misma forma, el sustrato S2 obtuvo un contenido de celulosa de 82.6%, hemicelulosa de 7.37%, lignina de 4.79 % y numero de Kappa de 6.21 (ver tabla 1). Lo cual, muestra la eficiencia de los pretratamientos, al lograr una reduccion considerable de lignina y hemicelulosa con respecto al residuo sin tratar. Algunos trabajos de investigacion sobre pretratamiento de materiales lignocelulosicos muestran las bondades del proceso organosolvente: Cuando se utiliza acetona--agua, se presenta un aumento de glucanos en pinus radiata de 45.3% a 70.9%, y para pajas de cana de azucar con 5 horas de tratamiento, el resultado muestra un contenido porcentual de lignina y celulosa que pasa de 21.5%, 39.4% hasta 11.7% y 64%, respectivamente (Araque et al., 2008; Saad et al., 2008). Igualmente, cuando se emplea alcohol sobre bagazo de cana de azucar, iniciando con una composicion de glucanos de 49.3%, xilanos de 15.65% y lignina insoluble de 27.22%, despues del pretratamiento se obtiene un producto con 62.08% de glucanos y 8.71% de xilanos (Mesa et al., 2010)

Condiciones de operacion de la enzima

La informacion obtenida para determinar las condiciones de operacion del preparado enzimatico se expresan en la figura 1, estos resultados presentan un coeficiente de determinacion 0.9864 con un nivel de confianza del 95%. Se observa como el pH tiene un mayor efecto sobre la produccion de azucares reductores. Los valores maximos de la superficie de hidrolisis para el sustrato S1 corresponden a una temperatura cercana a los 50[grados]C y a un pH entre 4 y 4.4.

[FIGURA 1 OMITIR]

El cambio de los azucares reductores producidos en la hidrolisis del material S1 en el rango de pH obtenido en la superficie de respuesta, muestra un valor maximo entre un pH de 3.8 y 4.2 (Ver figura 2). Estos resultados estan dentro de las condiciones de operatividad propuestos Genecor[R] para mezclas de enzimas como: endoglucanasa y beta glucosidasa (temperatura 50-60 [grados]C y pH 4.5), endoglucanasa y xilanasa (temperatura 45-65[grados]C y pH 3.5-6.5). En forma similar, para betaglucosidasa (temperatura 30-55[grados]C, pH 4-6) y para hemi celulasas (50-75[grados]C, pH 4-7)

Parametros cineticos

La tabla 2 presenta los datos que se utilizaron para la construccion de las curvas de progreso de produccion de azucares reductores en la hidrolisis del sustrato S2 con sus respectivas desviaciones estandar. En esta tabla, las siglas X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7 representan conversiones globales promedios, que estan referidos a todos los azucares reductores involucrados en la reaccion de hidrolisis, para concentraciones de sustrato de 10, 20, 30, 40, 60, 80 y 120 g/L, que corresponden a relaciones enzima/sustrato (E/S) 1.5, 0.75, 0.5, 0.375, 0.25, 0.187 y 0.125 ml/g, respectivamente. Ademas, equivalen a cargas de actividad celulolitica de 41.3, 20.64, 13.76, 10.32, 6.88, 5.09 y 3.44 FPU/g de sustrato, respectivamente.

[FIGURA 2 OMITIR]

Con esta informacion se evalua la velocidad inicial de hidrolisis, la cual se obtiene al evaluar la pendiente cuando el tiempo tiende a cero, con un coeficiente de determinacion ([r.sup.2]) por encima de 0.99 de una regresion polinomica de tercer orden, de la curva obtenida al graficar la conversion (X) contra el tiempo para cada relacion enzima/sustrato. Los resultados de la velocidad inicial en funcion de la concentracion inicial de sustrato se pueden ver en la figura 3, la cual permitio determinar las constantes del modelo de MichaelisMenten como son la velocidad maxima [V.sub.max] y la constante de Michaelis [K.sub.m]

Para establecer las constantes de inhibicion por sustrato se utilizo un modelo matematico de segundo orden (ecuacion 14), generado al graficar la relacion entre la concentracion inicial y la velocidad inicial de hidrolisis ([V.sub.o]/[S.sub.o]) obtenida de la figura 4 contra concentracion inicial de sustrato ([S.sub.o]).

[S.sub.0]/[V.sub.m] = [alfa] + bS + [cS.sup.2] (14)

Donde

a = 0.576658, b = 0.0225541 y c = 0.0000332165

[FIGURA 3 OMITIR]

Los resultados de las constantes cineticas se presentan en la tabla 3. Se observa que no hay una diferencia estadistica entre el modelo de Michaelis-Menten y de inhibicion incompetitiva por sustrato. En este ultimo modelo, la constante de inhibicion por sustrato [K.sub.s] es 20 veces mayor que [K.sub.m]. Un analisis de valor de la constante del modelo cinetico de inhibicion incompetitiva, conduce a despreciar el termino adicional de inhibicion ([S.sup.2]/[K.sub.s]) con respecto a la constante de Michaelis, ya que no genera un cambio sobre el resultado de la velocidad de hidrolisis. Con estos argumentos se puede afirmar que la inhibicion por sustrato no tiene un papel importante en el modelo cinetico. Ademas, el modelo de inhibicion no competitiva por sustrato no aplica por presentar valores de [K.sub.m] negativos.

En el desarrollo de los modelos cineticos, se hizo necesario encontrar una correlacion matematica entre la relacion E/S, la conversion total y el contenido de glucosa, a partir de los datos experimentales. Esta correlacion permitio resolver analiticamente las ecuaciones diferenciales que representaban los diferentes modelos. La figura 5 presenta las curvas de progreso para el contenido de glucosa, datos que suministran la informacion necesaria para obtener la relacion entre el % conversion y el contenido de glucosa (ver ecuaciones 15, 16 y 17)

Glu = [[A.sub.0]/(k+1)][e.sup.[(k+1)x-1]] (15)

[A.sub.0](g/I) = 0.0037 [So.sup.2] + 1845 [r.sup.2] = 0.9996 (16)

k = 0.00205[S.sub.o] + 0.1483 [r.sup.2] = 0.9961 (17)

[FIGURA 4 OMITIR]

[FIGURA 5 OMITIR]

Es importante hacer notar que las concentraciones de celobiosa presentadas durante las diferentes corridas experimentales alcanzaron valores maximos de 0.7 g/L, los cuales son valores menores comparados con la produccion de glucosa. Esta diferencia se debe a que el preparado enzimatico usado en esta investigacion, contiene un alto contenido de actividad [beta]-glucosidasa. En la tablas 4 y 5, se presentan los resultados para las evaluaciones de las constantes cineticas para los modelos que involucran como inhibidores a todos los azucares reductores expresados como % conversion total (ITP1, ITP2 e ITP3) y los modelos que tengan como inhibidor solamente glucosa (IC, INC, IIC e INCM). Ademas, en estas tablas se presentan los coeficientes de determinacion ([r.sup.2]) que permiten decidir cual modelo se ajusta mejor a los datos experimentales.

El modelo que presento mayores coeficientes de determinacion en este estudio, fue el de inhibicion competitiva (IC). Estos resultados estan de acuerdo con los modelos propuestos por Andric et al. (2010), donde se precisa que los modelos de inhibicion mas comunes en este tipo de reacciones son la inhibicion competitiva y no competitiva. Ademas, reporta constantes de inhibicion [k.sub.i] (g/L) entre 0.01 y 54 g/L. Igualmente, el National Renewable Energy Laboratory (NREL), usando como sustrato residuos de la cosecha de maiz, propuso modelos de inhibicion competitiva por glucosa (Kadan et al., 2004). En dicho estudio, se definio como referencia el modelo de inhibicion (IC), para indicar la velocidad de hidrolisis de residuos de cosecha de cana de azucar, el cual presenta una constante de inhibicion entre 0.427 g/L y 0.464 g/L hasta relaciones E/S de 0.375, con un promedio de 0.442 g/L

En el caso de concentraciones menores a 30 g/l o E/S mayores que 0.5, donde los coeficientes de determinacion fueron bajos, se busco una alternativa para distinguir que tipo de modelo podia representar los datos experimentales. Como una primera aproximacion, se hizo una comparacion entre los datos arrojados por el modelo de Michaelis-Menten y los datos experimentales para las relaciones E/S menores a 30 g/L. Las figuras 6 y 7, presentan las curvas de progreso para datos arrojados en la simulacion del modelo de Michaelis-Menten (XM) y los datos obtenidos experimentalmente para cada una de las relaciones E/S.

[FIGURA 6 OMITIR]

[FIGURA 7 OMITIR]

Para determinar cuales medias son significativamente diferentes de las otras, en el rango de E/S de 0.375 hasta 1.5, se utilizo el procedimiento de diferencia minima significativa (LSD) de Fisher, con un riesgo de un 5% de que cada par de media es significativamente diferente. El analisis se expresa en la tabla 6, donde se puede concluir que puede existir diferencia entre las curvas de progreso correspondiente E/S = 0.375 y E/S = 1.5

Se puede concluir que para relaciones E/S por encima de 0.5 es posible aplicar el modelo encontrado de Michaelis-Menten sin tener en cuenta los fenomenos de inhibicion.

En resumen, puede decirse que en este trabajo, para el modelo de Michaelis-Menten, el analisis de los datos experimentales arroja las siguientes constantes cineticas: [K.sub.m] = 20.37 g/L y [V.sub.max] = 39 g/L h. El modelo cinetico de inhibicion competitiva (IC), es el que presenta los mejores ajustes con los datos experimentales, muestra una constante de inhibicion promedio de 0.442 g/L, puede ser aplicado para relaciones E/S menores a 0.375. Este modelo cinetico queda definido por la ecuacion 14:

dX/dt = 39(1 - X)/[S.sub.0](1 - X) + 2037(1 + [1/0.442]) (14)

La inhibicion por sustrato no tiene un papel importante en la hidrolisis de residuos de la cosecha de cana de azucar. En la hidrolisis de residuos de la cosecha de cana de azucar para relaciones E/S mayor de 0.5, se puede aplicar el modelo cinetico de Michaelis-Menten.

Recibido: enero 2 de 2012

Aprobado: junio 29 de 2012

Agradecimientos

Los autores agradecen el soporte financiero dado al proyecto 2007D-3719-346-07 por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, la Universidad Autonoma de Occidente (Laboratorio de Bioprocesos) y la Universidad del Valle, lo mismo que a la Agencia de Cooperacion Suiza a traves del proyecto: EPFL DDC 2009-2012 SCIENTIFIC COOPERATION FUND.

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Salcedo MendozaJairo G., c. Ph.D. Escuela de Ingenieria Quimica. Universidad del Valle. Universidad de Sucre. jairo.salcedo@unisucre.edu.co

Galan Lopez Jorge E., Dr. Sci. Grupo Interinstitucional de Investigacion en Biocombustibles. GRUBIOC. Universidad del Valle. jorge.lopez@correounivalle.edu.co

Pardo Florez Luz Marina, Dr. Sci. Grupo Interinstitucional de Investigacion en Biocombustibles. GRUBIOC. Universidad Autonoma de Occidente. lmflorez@uao.edu.co
Tabla 1. Composicion de los materiales pretratados
por proceso organosolvente

                  S1(% en peso)       S2 (% en peso)

Celulosa        80.53 [+ o -] 0.15    82.6 [+ o -] 0.82
Hemicelulosa    13.35 [+ o -] 0.55   7.37 [+ o -] 0.057
Lignina Total   1.36 [+ o -] 0.36     4.79 [+ o -] 0.05
Extractivos     4.22 [+ o -] 0.01    5.06 [+ o -] 0.0057
Humedad          4.2 [+ o -] 0.4      5.1 [+ o -] 0.10
Cenizas         0.12 [+ o -] 0.028    0.22 [+ o -] 0.1

Tabla 2. Conversiones globales promedios (X1, X2, X3, X4,
X5, X6 y X7) de azucares reductores para diferentes tiempos
de hidrolisis de residuos de cosecha de caia de azucar

Tiempo (h)         X1         X2        X3         X4
                 E/S 1.5   E/S 0.75   E/S 0.5   E/S 0.375

0                     0          0         0           0
0.5               0.452      0.351     0.302       0.235
1.0               0.665      0.581     0.410       0.378
1.5               0.817      0.650     0.523       0.437
2.0               0.853      0.689     0.578       0.488
3.0               0.924      0.831     0.642       0.564
6.0               0.944      0.907     0.777       0.697
9.0               0.959      0.927     0.856       0.708
24.0              0.965      0.928     0.882       0.858
27.0              0.965      0.946     0.884       0.873
33.0              0.967      0.970     0.893       0.884
48.0              0.973      0.977     0.899       0.898
51.0              0.974      0.977     0.907       0.908
Desv. Estandar     0.01      0.009    0.0125      0.0099
promedio

Tiempo (h)          X5         X6          X7
                 E/S 0.25   E/S 0.187   E/S 0.125

0                      0           0           0
0.5                0.160       0.112       0.094
1.0                0.241       0.161       0.153
1.5                0.304       0.233       0.129
2.0                0.355       0.274       0.149
3.0                0.437       0.316       0.206
6.0                0.548       0.442       0.251
9.0                0.583       0.466       0.390
24.0               0.743       0.659       0,529
27.0               0.765       0.713       0,596
33.0               0.769       0.727       0,650
48.0               0.843       0.759       0.710
51.0               0.841       0.784       0.742
Desv. Estandar    0.0077       0.002       0.004
promedio

Tabla 3. Constantes cineticas del modelo de Michaelis- Menten e
inhibicion por sustrato

Modelo                                    [V.sub.max]   [K.sub.m]
                                            (g/L h)       (g/L)

Michaelis- Menten                             39          20.37
Inhibicion incompetitva por sustrato          44          25.56
inhibicion no competitiva por sustrato       35.18         --*

Modelo                                    [K.sub.s]   [r.sup.2]
                                            (g/L)

Michaelis- Menten                                       0.992
Inhibicion incompetitva por sustrato         684        0.993
inhibicion no competitiva por sustrato       856        0.995

* Km negativa

Tabla 4. Constantes cineticas ([k.sub.i], [k.sub.ii] g/L)
de los modelos de inhibicion Total evaluados a 50[grados]]C
y pH 4.2 para diferentes relaciones E/S

                ITP1                    ITP2

E/S     [k.sub.i]   [r.sup.2]   [k.sub.i]   [r.sup.2]

1.5       0.504       0.57        0.05        0.32
0.75      0.81        0.79        0.19        0.486
0.5       0.69        0.75        0.34        0.579
0.375     0.79        0.89        0.53        0.724
0.25      0.73        0.96        0.89        0.85
0.187      0.7        0.96        1.29        0.903
0.125     0.55        0.98        0.55        0.96

                       ITP3

E/S     [k.sub.i]   [k.sub.ii]   [r.sup.2]

1.5       0.42         0.15        0.53
0.75      0.54         0.17        0.61
0.5       0.85         0.29        0.84
0.375     1.07         0.50        0.86
0.25      1.61         0.87        0.93
0.187     2.36         1.31        0.94
0.125     4.00         1.88        0.97

Tabla 5. Constantes cineticas ([k.sub.i], [k.sub.ii] g/L) de los
modelos de inhibicion por glucosa evaluados a 50[grados]C y pH
4.2 para diferentes relaciones E/S

                 IC                      INC

E/S     [k.sub.i]   [r.sup.2]   [k.sub.i]   [r.sup.2]

1.5       0.340       0.47        0.390       0.46
0.75      0.550       0.67        0.632       0.65
0.5       0.490       0.87        0.794       0.82
0.375     0.430       0.89        0.915       0.83
0.25      0.464       0.97        0.903       0.92
0.187     0.448       0.97        1.257       0.93
0.125     0.427       0.98        1.780       0.97

           IIC                              INCM

E/S     [k.sub.i]   [r.sup.2]   [k.sub.i]   [k.sub.2]   [r.sup.2]

1.5       0.08        0.30      6.50E+07      0.346       0.47
0.75      0.15        0.44      1.88E+09      0.519       0.69
0.5       0.26        0.68      1.45E+11      0.49        0.87
0.375     0.379       0.70      1.03 E+11     0.546       0.90
0.25      0.564       0.85      2.8E+11       0.464       0.96
0.187     0.815       0.91      3.24E+08      0.448       0.97
0.125     1.352       0.96      3.8           0.66        0.97

Tabla 6. Comparacion multiple de conversiones,
usando procedimiento LSD para las medias de las
curvas de progreso (E/S=0.375,0.5, 0.75, 1.5)

Curva de progreso      Conversion     Grupos
                         Media      Homogeneos

E_40 g/L (E/S=0.375)     0,609          X
E_30 g/L (E/S=0.5)       0,657          XX
E_20 g/L(E/S=0.75)       0,748          XX
E_10 g/L (E/S=1.5)       0,804          XX
XM_40 g/L                0,804          XX
XM_30 g/L                0,820          XX
XM_20 g/L                0,839          XX
XM_10 g/L                0,858          X

E = datos Experimentales

XM = Modelo de Michaelis--Menten
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Title Annotation:ARTICULO DE INVESTIGACION
Author:Salcedo Mendoza, Jairo G.; Galan Lopez, Jorge E.; Pardo Florez, Luz Marina
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2012
Words:6486
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