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Herpesvirus bovino 1 (BoHV-1): actualizacion de las cepas circulantes en Argentina.

El BoHV-1, miembro de la familia Herpesviridae, afecta naturalmente a la especie bovina, provocando una amplia gama de manifestaciones: rinotraqueitis (IBR), vulvovaginitis pustular infecciosa (IPV), balanopostitis (IPB), conjuntivitis, aborto, enteritis y encefalitis (7).

BoHV-1 es un patogeno mundialmente diseminado que muestra diferencias significativas en la incidencia regional y la prevalencia respecto de las posiciones geograficas y el manejo de cria bovina en cada establecimiento (7).

Asi como otras enfermedades causadas por herpesvirus en el hombre y en los animales, el ciclo de reactivacion de la latencia tiene un profundo impacto epidemiologico ya que es responsable del mantenimiento de BoHV-1 en la poblacion bovina (12).

Todas las cepas de BoHV-1 se clasifican en tres subtipos BoHV-1.1, BoHV-1.2a y BoHV-1.2b (7). Aunque la mayoria de las cepas de BoHV-1.1 han sido aisladas de enfermedades respiratorias y las cepas de subtipo BoHV-1.2 a partir de lesiones de organos genitales, el unico criterio distintivo fiable es el analisis del perfil de restriccion del ADN viral por endonucleasa (6).

Historicamente los subtipos 1.1 y 1.2a se han asociado con enfermedades graves, incluida la infeccion del feto y el aborto (6). Sin embargo el subtipo 1.2b generalmente no se ha asociado con el aborto (3). De hecho, los terneros infectados experimentalmente por via nasal con cepas de BoHV-1.2 mostraron signos clinicos respiratorios y fueron capaces de transmitir la infeccion respiratoria a otro terneros (3). Del mismo modo, las lesiones del tracto reproductivo en novillas se observaron despues de la inoculacion intrauterina con BoHV-1.1 (6).

En cuanto al impacto economico, el BoHV-1 es responsable de perdidas significativas ocasionadas por las enfermedades y las restricciones comerciales de la industria ganadera (7). Por lo tanto, los programas de control se desarrollaron rapidamente despues de la aparicion de IBR en rebanos de America del Norte, que generalmente se basan en el uso de vacunas marcadoras, en la deteccion y el sacrificio de animales seropositivos, o en la vacunacion repetida de rebanos infectados.

Debido a la incapacidad de las vacunas para prevenir la infeccion por BoHV-1 y el establecimiento de latencia, los programas de control de BoHV-1 pueden durar un largo periodo antes de completar la erradicacion de esta infeccion bien adaptada al ganado bovino (7). Otra preocupacion en los esquemas de erradicacion de BoHV-1 es la capacidad de este virus para cruzar la barrera de especies huesped.

Los datos de campo y las infecciones experimentales han puesto de manifiesto la posible infeccion de varias especies de rumiantes con BoHV-1, asi como la infeccion de bovinos con otros alfa herpesvirus de rumiantes, sin posibilidad de distinguirlos a nivel serologico y complejizando aun mas la aplicacion de los programas de erradicacion (7).

El analisis del perfil de restriccion por endonucleasa (REA) se ha utilizado ampliamente para diferenciar los aislamientos de BoHV-1 (7). Ademas, resulto ser particularmente util para la diferenciacion entre diversos alfaherpesvirus de rumiantes antigenicamente relacionados con BoHV-1, ya que muestran diferentes perfiles de restriccion del ADN viral (12). Esta tecnica permite la subtipificacion de aislamientos que aparentemente pertenecen al mismo virus.

Tradicionalmente, la diferenciacion entre los subtipos de BoHV-1 se basa en las caracteristicas clinicoepidemiologicas de los brotes seguidos de REA de ADN viral despues del aislamiento viral (1). En nuestro pais se describio el primer brote de BoHV en 1982, a partir del cual se aislaron tanto BoHV-1, como la cepa de referencia A663 (BoHV-5b) clasificada como BoHV-5 (11) y ahora reportada como virus recombinante natural entre BoHV-1/5 (Maidana S.S. et al.: World Buiatric Congress, Dublin, 2016).

Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron actualizar, caracterizar y comparar por REA las variantes geneticas de los aislamientos argentinos de BoHV-1 obtenidos a partir de bovinos con diferentes signos clinicos desde 1984 hasta 2015.

MATERIAL Y METODOS

Virus y celulas. Las cepas de campo BoHV-1 se obtuvieron por aislamiento a partir de muestras de animales naturalmente infectados. Los detalles del sitio geografico, el tiempo, el tipo de muestra de la que se obtuvo y la sintomatologia del animal al momento de la toma de muestra se encuentran descriptos en la Tabla 1.

Las muestras fueron colectadas y aisladas previamente por nuestro grupo o bien se utilizaron aislamientos del banco de cepas del laboratorio de diagnostico del Instituto de Virologia del INTA Castelar; tambien se incluyeron aquellas remitidos por distintos laboratorios privados de diagnostico.

Se utilizaron celulas Madin Darby Bovine Kidney (MDBK) tanto para la amplificacion de las cepas de referencia que se utilizaron como control, como para la deteccion de nuevos aislamientos. Las cepas virales de referencia utilizadas en los diversos ensayos fueron las siguientes: LA, K22, ST que corresponde a BoHV1.1, BoHV1.2b, BoHV1.2a respectivamente.

Obtencion del ADN viral (PCR multiplex diferencial entre BoHV-1/5 y REA). Para la obtencion de ADN viral, monocapas de celulas MDBK fueron crecidas en botellas de cultivo celular de 150 [cm.sup.2] de superficie (T150) e infectadas con las cepas de referencia y los aislamientos de campo. Cuando el ECP fue extensivo, los frascos fueron congelados a -70[grados]C.

Luego se realizo el clarificado a 3.000 rpm durante 20 minutos a 4[grados]C. El sobrenadante fue ultracentrifugado a 100.000 g (Beckman L-90K) durante 1 hora a 4[grados]C. El pellet se resuspendio en 1 ml de buffer TE (Tris 200 mM pH 8, EDTA 20 mM) con NP-40 0,1% v/v (Sigma) e incubado a 37[grados]C por 30 minutos y a 56[grados]C por 1 hora. Luego se llevo a 30 ml con TE, se agregaron 5 ml de sacarosa 30% p/v en el fondo del tubo y se ultracentrifugo a 100.000 g durante 2 horas a 4[grados]C.

El pellet fue resuspendido en 500 ul de buffer de extraccion (TE pH=8, SDS 1%, Proteinasa K 0,5 mg/ml). Para lograr la disolucion del pellet, se incubo a 56[grados]C por 2 horas. La purificacion y extraccion del ADN viral fueron realizadas segun se detalla en un trabajo realizado en el norte de Francia (12).

Primeramente se realizo una PCR multiplex disenada por M.Claus (2), que diferencia entre BoHV-1/5. Los cebadores utilizados fueron B1 especifico para BoHV-1 (5-CAA CCG AGA CGG AAA GCT CC-3_nt 185-204); B5 especifico para BoHV-5 (5-CGG ACG AGA CGC CCT TGG-3_nt 322-339) y un cebador consenso para ambos virus Bcon (5-AGT GCA CGT ACA GCG GCT CG-3_nt 519-538).

Los productos de amplificacion, de diferentes pesos moleculares dependiendo del virus, corresponden al gen que codifica para glicoproteina gC (numero de acceso al GenBank Z49223 and U35883). La PCR multiplex fue preparada en una mix de reaccion (12,5 ul final) conteniendo 50 ng de ADN viral, 0,4 pmol de cada cebador (B1, B5, and Bcon); 1,5 mM dNTPs (Invitrogen TM Life Technologies, USA); 2,5 units de Taq DNA Polimerasa (Invitrogen TM Life Technologies, USA); 1X PCR buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KCl); 1,5 mM MgCl2 y agua ultrapura hasta llegar 12,5 [micron]l.

La reaccion de amplificacion se realizo en un termo ciclador (Biometra TRIO - Thermoblock) bajo las siguientes condiciones: un paso de 10 min a 96[grados]C seguido por 25 ciclos de 1 min a 96[grados]C; 1 min a 58[grados]C; 1 min a 72[grados]C y un paso de extension final de 10 min at 72[grados]C. Finalmente los productos de PCR fueron analizados en una corrida electroforetica de agarosa 1%, tenido con bromuro de etidio (0,5 [micron]g/ml) en buffer TBE pH 8,4 (89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA) y visualizado bajo luz UV.

Para el ensayo de REA, 4 ug de ADN viral fueron digeridos con la endonucleasa Hind-III siguiendo las recomendaciones del fabricante (Promega, Wisconsin, USA). Finalmente los productos de digestion fueron separados por electroforesis en gel de agarosa 0,7% a 50 V durante toda la noche usando buffer TBE. Luego el gel fue tenido con bromuro de etidio y el patron de bandeo fue observado y fotografiado con el sistema de documentacion de geles de BioRad.

RESULTADOS

En este estudio, analizamos un total de 44 cepas aisladas (entre 1984 y 2015) de bovinos de diferentes provincias. Los datos de las cepas se encuentran resumidos en la Tabla 1. Todas las cepas aisladas fueron exitosamente amplificadas en cultivo celular (MDBK). La PCR multiplex permitio diferenciar los aislamientos por peso molecular de los productos, 159 pb para BoHV-5 y de 354 pb para BoHV-1.

A partir de las muestras analizadas se observo que la mayoria de los aislamientos de BoHV-1 fueron aislados a partir de semen (22 de 44) durante diagnosticos de rutina. La mayor parte de los aislamientos mostro un patron de bandas por REA similar al prototipo BoHV-1.2b (35 aislamientos), 7 aislamientos fueron similares a BoHV-1.1 y los 2 ultimos mostraron un patron de bandas similar a BoHV-1.2a (Figura 1).

DISCUSION

En America Latina la seroprevalencia de BoHV-1 es muy alta, con niveles que oscilan entre 20-90% dependiendo del pais. Se ha informado que mas del 75% de las poblaciones de rebanos bovinos en Colombia tienen anticuerpos neutralizantes contra la infeccion por BoHV-1 (10).

En Brasil el porcentaje de seroprevalencia se ubica entre 19 y 85% (4), mientras que en Argentina el promedio es de 60% (8). Sin embargo, se dispone de informacion limitada sobre el tipo/subtipo de cepas circulantes en nuestro pais. Para tener una vacuna eficiente es necesario y relevante saber que subtipos de este virus estan circulando actualmente.

En Argentina, un grupo de investigadores (9) caracterizaron por perfiles de restriccion cuatro aislados de campo, tres de los cuales fueron BoHV-1.1 y el restante BoHV-1.2. Sin embargo, en este momento es necesario actualizar y aumentar el numero de muestras/aislamientos analizados para determinar la situacion de nuestro pais en cuanto a los subtipos circulantes, su distribucion en el tiempo, co-circulacion y prevalencia de cada subtipo.

De acuerdo con las muestras analizadas en este trabajo el subtipo mas prevalente es 1.2b (35 aislamientos de 44). Se cree que la transmision de BoHV-1 por via genital precede a la transmision respiratoria que ocurrio aparentemente con el advenimiento de los feedlots (12). Basados en tal observacion y segun los resultados aqui obtenidos, podriamos inferir que la prevalencia del subtipo 1.2b podria deberse a la utilizacion mas frecuente de sistemas extensivos de produccion en Argentina.

Segun los aislamientos aqui caracterizados, resulta interesante observar la co-circulacion de los subtipos BoHV-1.1 y 1.2b durante 30 anos. Los aislamientos de BoHV-1.2a reportados en este trabajo fueron obtenidos de bovinos asintomaticos, uno de ellos aislado de semen durante el diagnostico de rutina y el otro durante un muestreo aleatorio en un campo de produccion mixta bovinos-bufalos.

En los ultimos anos la principal region pecuaria del centro de Argentina se ha dedicado a la produccion de soja. Ello dio lugar a cambios importantes en la distribucion del ganado bovino, como la intensificacion de la carga de ganado en campos de menor calidad agricola y la aparicion de sistemas de produccion mixtos (bufalobovino) (5). Desde el punto de vista epidemiologico es interesante conocer que los alpha herpesvirus circulan en estos rebanos mixtos, siendo nuestro pais endemico para los tipos BoHV-1, BoHV-5 (9).

En busqueda de una mejor comprension de la epidemiologia del herpesvirus bovino en el pais, 44 aislamientos de campos de diferentes regiones agricolas fueron examinados, pudiendo observarse que, independientemente del subtipo, las cepas mostraron tropismo diferente por las distintas mucosas. Del mismo modo, articulos brasilenos han reportado casos en los cuales el cuadro clinico no correlaciono con el subtipo (13).

De acuerdo con lo observado en este trabajo, en Argentina parecen circular todos los subtipos de herpesvirus bovino 1 descritos en la literatura (BoHV-1.1, BoHV-1.2a y b). Aunque se determino que dos subtipos (BoHV-1.1 y BoHV-1.2b) circularon en el periodo 1982-2011, la mayoria de los aislamientos actuales son BoHV-1.2b. Segun la busqueda efectuada, este seria el primer informe sobre la circulacion del subtipo de BoHV-1 "1.2a" en Argentina, mostrando la circulacion de tres subtipos de BoHV-1 como en otras partes del mundo.

De acuerdo al numero de muestras analizadas, la mayoria de los aislamientos de campo, incluidos los actuales, pertenecen al subtipo "1.2b". El subtipo "1.2a" solo se aislo para este trabajo entre los anos 2012-2015 y aparentemente es el subtipo menos prevalente en nuestro pais.

La estrategia para controlar el BoHV-1, se basa en el diagnostico y la vacunacion. Las vacunas utilizadas en Argentina son inactivadas y generalmente se basan en el subtipo BoHV-1.1 (cepas de referencia de Los Angeles), ocasionalmente con la adicion del virus BoHV-5. El exito de la vacunacion eficaz contra el BoHV-1 debe tener en cuenta tanto la diversidad genetica como antigenica del virus. Por esta razon, la caracterizacion de aislamientos recientes de BoHV-1 es necesaria para monitorear la aparicion de variantes de importancia epidemiologica.

Dado que los subtipos de BoHV-1 estan altamente relacionados antigenicamente, es probable que se produzca la proteccion cruzada de la vacuna actualmente utilizada en Argentina (subtipo 1.1). Sin embargo, hasta ahora no se han realizado ensayos experimentales en bovinos demostrando que una vacuna monovalente incluyendo solo el subtipo 1.1 proteja contra los otros subtipos de este virus.

Agradecimientos. Los autores desean agradecer a la Dra Mercedes Odeon por participar en la redaccion del manuscrito y a los Dres Gaston Caspe y Daniel Benitez por colaborar en la recoleccion de muestras.

REFERENCIAS

(1.) Christensen L, Madsen K, Nylin B, Ronsholt L. 1996. A contribution to the systematization of bovine herpesvirus 1 based on genomic mapping by restriction fragment pattern analysis. Virus Res 46,: 177-182.

(2.) Claus M, Alfieri A, Folgueras A, Wosiacki S, Medici K, Alfieri A. 2005. Rapid detection and differentiation of bovine herpesvirus 1 and 5-glycoprotein C gene in clinical specimens by multiplex-PCR. J Virol Methods 128: 183-188.

(3.) Edwards S, White H, Nixon P. 1990. A study of the predominant genotypes of bovid herpesvirus 1 found in the U.K. Vet Microbiol 22; 213-223.

(4.) Holz C et al. 2009. Soroprevalencia de herpesvirus bovinos tipos 1 e/ou 5 no Estado do Rio Grande do Sul. Pesq Vet Bras 29: 767-773.

(5.) Konrad J et al. 2012. Experimental inoculation of Neospora caninum in pregnant water buffalo. Vet Parasitol 187: 72-78.

(6.) Miller J, Whetstone C, Maaten M. 1991. Abortifacient property of bovine herpesvirus type 1 isolates that represent three subtypes determined by restriction endonuclease analysis of viral DNA. Am J Vet Res 52, 458-461.

(7.) Muylkens B, Thiry J, Kirten P, Schynts F, Thiry E. 2007. Bovine herpesvirus 1 infection and infectious bovine rhinotracheitis. Vet Res 38: 181-209.

(8.) Odeon A et al. 2001. Seroprevalencia de la diarrea viral bovina, herpesvirus bovino y virus sincicial respiratorio en Argentina. Prev Vet Med 82: 216-220.

(9.) Pidone C, Galosi C, Echeverria M, Nosetto E, Etcheverrigaray M. 1999. Restriction endonuclease analysis of BHV-1 and BHV-5 strains isolated in Argentina. Zentralblatt fur Veterinarmedizin 46: 453-456.

(10.) Ruiz J, Jaime J, Ramirez G, Vera V. 2012. Molecular and in vitro characterization of field isolates of bovine herpesvirus-1. Virol Sin 27: 26-37.

(11.) Schudel A, Carrillo B, Wyler R. 1986. Infections of calves with antigenic variants of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) and neurological disease. Zentralbl Vet 33: 303-310.

(12.) Thiry J, Dams L, Muylkens B, Thiry E. 2011. Isolation of cervid herpesvirus 1 from the genital tract of a farmed red deer in Northern France. Vet J 187: 282-283.

(13.) Traesel C, Silva M, Spilki F, Weiblen R, Flores E. 2013. Nucleotide sequencing and phylogenetic analysis of the 3' region of glycoprotein C gene of South American bovine herpesviruses 1 and 5. Res Vet Sci 94: 178-185.

Maidana, S.S. (1,2,3); Marin, M. (2,5); Destefano, G. (1); Combessies, G. (6); Romera, S.A. (1,2,3,4)

(1) Instituto de Virologia INTA Hurlingham, Buenos Aires, Argentina. (2) CONICET. (3) Catedra Inmunogenetica Univ. Moron. (4) Cat. Inmunologia Univ.Salvador, Pilar. (5) INTA Balcarce, 6Lab.Azul, Buenos Aires, Argentina. E-mail: maidana.silvina@inta.gob.ar

Recibido: 12 octubre 2017 / Aceptado: 7 marzo 2018
Tabla 1. Aislamientos de Bovine herpesvirus 1 argentinos y cepas de
referencia agrupadas en subtipos de acuerdo con el analisis del perfil
de restriccion.

subtipo  ano   cepa      muestra          origen y signos clinicos

1.2b     1984  67/89     cerebro          Sin datos
         1989  107/89    higado           Sin datos
         1991  LP 202    hisopado         Sin datos
                         prepucial
               LP 170    hisopado         Sin datos
                         prepucial
         1996  26/96     semen            Sin datos
         1998  98/759    hisop. nasal     Ayacucho, Buenos Aires. Sin
                         y ocular         datos.
         2001  01/156    secrecion        Catrilo, La Pampa. Aborto
                         vaginal
         2001  01/211    secrecion        Saladillo, Buenos Aires.
                         vaginal          Aborto
         2002  02/221    secrecion        Balcarce, Buenos Aires. Aborto
                         vaginal
         2002  02/701    hisopado         Laprida, Buenos Aires.
                         prepucial        Presentacion de toros con
                                          prepucio inflamado y con
                                          lesiones en el glande peneano.
         2003  03/41     secrecion        Ayacucho, Buenos Aires. Sin
                         vaginal          datos
         2003  03/134    hisopado nasal   Balcarce, Buenos Aires.
                         y ocular         Lagrimeo, herpes labial, nariz
                                          seca, disenos y perdida de
                                          estatus, disfuncion respirat.
         2004  16/04     semen            Entre Rios. Asintomatico
         2006  67/06     semen            Saladillo, Buenos Aires.
                                          Asintomatico
               75/06     semen            San Antonio de Areco, Buenos
                                          Aires
         2009  09/210    hisopado nasal   Carlos Tejedor, Buenos Aires.
                                          Signos nerviosos
         2010  621/10    semen            Saldungaray, Buenos Aires.
                                          Asintomatico
               612/10    semen            San Antonio de Areco, Buenos
                                          Aires. Asintomatico
               688/10    semen            San Antonio de Areco, Buenos
                                          Aires. Asintomatico
         2011  122232    hisopado ocular  Queratoconjuntivitis
               745/11    semen            Buenos Aires. Asintomatico
               al-most   semen            Buenos Aires. Asintomatico
               (890/11)
         2012  94        hisopado ocular  Chubut, Esquel.
                                          Queratoconjuntivitis
               146       hisopado ocular  Chubut, Esquel.
                                          Queratoconjuntivitis
               997       hisopado ocular  Chubut, Esquel.
                                          Queratoconjuntivitis
               932/12    semen            Capitan Sarmiento, Buenos
               (50)                       Aires. Asintomatico
               935/12    semen            Capitan Sarmiento, Buenos
               (5)                        Aires. Asintomatico
               935/12    semen            Capitan Sarmiento, Buenos
               (17)                       Aires. Asintomatico
               942/12    semen            Capitan Sarmiento, Buenos
               (33)                       Aires. Asintomatico
               972/12    semen            Capitan Sarmiento, Buenos
               (30)                       Aires. Asintomatico
         2013  1039/13   semen            Capitan Sarmiento, Buenos
               (36)                       Aires. Asintomatico
         2014  1127/14   semen            Chaco. Asintomatico
               (58)
         2015  1273/15   semen            San Antonio de Areco, Buenos
               (61)                       Aires. Asintomatico
               1273/15   semen            San Antonio de Areco, Buenos
               (65)                       Aires. Asintomatico
1.2a     2012  972/12    semen            San Antonio de Areco, Buenos
               (26)                       Aires. Asintomatico
         2015  39        hisopado nasal   Mix herd (bufalo/cattle),
                                          Corrientes. Asintomatico
1.1      1984  P 898     cerebro y        Sin datos
                         cornetes
         2003  03/404    secrecion        Barker, Buenos Aires. Aborto
                         vaginal
         2007  FR        cerebro          Encefalitis
               40418     cerebro          Encefalitis
               41184     cerebro          Encefalitis
         2008  86274     hisopado nasal   Signos respiratorios
         2012  12/255    hisopado ocular  Lincoln, Buenos Aires.
                                          Conjuntivitis
         2015  1260/15   semen            San Antonio de Areco, Buenos
               (67)                       Aires. Asintomatico
               1263/15   semen            San Antonio de Areco, Buenos
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Author:Maidana, S.S.; Marin, M.; Destefano, G.; Combessies, G.; Romera, S.A.
Publication:Revista Veterinaria
Date:Jul 1, 2018
Words:3361
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