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Hepatozoon canis infection in a domestic dog in Southern Brazil confirmed by molecular techniques/Infeccao por Hepatozoon canis em canino domestico na regiao Sul do Brasil confirmada por tecnicas moleculares.

INTRODUCAO

A hepatozoonose e uma doenca causada pelo protozoario Hepatozoon spp., transmitida por artropodes, que acomete principalmente os carnivoros domesticos e silvestres (BANETH et al., 2003; RUBINI et al., 2005). Ate o momento, duas especies de Hepatozoon infectando canideos foram identificadas: Hepatozoon canis e Hepatozoon americanum.

As manifestacoes clinicas da hepatozoonose canina nao sao claramente definidas. Descricoes de infeccoes por H. canis em caes variam de inaparentes a severas (ASSARASAKORN et al., 2006) e a doenca geralmente e intercorrente a outras enfermidades imunossupressoras (O'DWYER et al., 2001; BANETH et al., 2003; GAVAZZA et al., 2003) ou outros hemoparasitas (GAVAZZA et al., 2003; AGUIAR et al., 2004; RUBINI et al., 2005), o que dificulta a individualizacao dos seus sinais clinicos (AGUIAR et al., 2004). A infeccao por H. americanum geralmente e fatal (PALUDO et al., 2003; RUBINI et al., 2005).

No Brasil, existem poucos relatos de infeccao por Hepatozoon spp. em caes, e pouco se sabe a respeito de sua epidemiologia, patogenicidade, seus vetores e sua caracterizacao genetica. Apesar de a doenca ter sido descrita nos Estados do Rio de Janeiro (MASSARD, 1979; O'DWYER et al., 2001), Sao Paulo (O'DWYER et al., 1997), Minas Gerais (MUNDIM et al., 1992), Distrito Federal (PALUDO et al., 2003) e Rio Grande do Sul (SOUZA et al., 2001; MELLO et al., 2006), apenas em 2005 RUBINI et al. identificaram e caracterizaram especies de Hepatozoon spp. como sendo H. canis, por meio de tecnicas moleculares, seguidos por GARCIA DE SA et al. (2007) no Rio de Janeiro e RUBINI et al. (2008) em Botucatu, Sao Paulo.

O presente estudo objetivou relatar um caso de infeccao canina por H. canis diagnosticado por meio de esfregaco sanguineo e confirmado pela tecnica de PCR associada ao sequenciamento.

MATERIAL E METODOS

Foi atendido no Hospital de Clinicas Veterinarias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (HCV -- UFRGS), Porto Alegre, Rio Grande do Sul (RS), um canino macho, da raca Collie, de quatro anos de idade, apresentando sangramento na ponta das orelhas e emagrecimento progressivo. O proprietario relatou nao haver um controle efetivo de carrapatos. Foi coletado sangue com EDTA-[K.sub.3] e sem anticoagulante para realizacao do hemograma e analises bioquimicas por meio de puncao da veia cefalica. Por meio da visualizacao por microscopia optica no esfregaco sanguineo, foram observadas estruturas compativeis com gamontes de Hepatozoon spp.

DNA foi extraido a partir do sangue total com EDTA-[K.sub.3], utilizando o kit comercial GFX Genomic Blood DNA Purification Kit, (Amersham Biosciences, UK Limited, Buckinghamshire, England) de acordo com as instrucoes do fabricante. O DNA extraido foi armazenado a -20[degre]C ate o momento das analises moleculares. Para a amplificacao do DNA, foram utilizados os iniciadores (primers) para o gene 18S RNA ribossomico sugeridos por INOKUMA et al. (2002): HepF 5' -- ATA CAT GAG CAA AAT CTC AAC -- 3' e HepR 5' -- CTT ATT ATT CCA TGC TGC AG -- 3'. A reacao em cadeia da polimerase (PCR) foi constituida de tampao 1X (pH 8,5), 2mM de Mg[Cl.sub.2], deoxinucleotideos (dNTPs) na concentracao de 200[micro]M, cada primer na concentracao de 1[micro]M, 1,5U de GoTaq[R] Flexi DNA Polymerase (Promega, Madison, WI, USA), 5[micro]L da amostra de DNA e agua ultrapura ate o volume total de 25[micro]L por reacao. A PCR foi realizada utilizando o termociclador Eppendorf Mastercycler gradient thermocycler (Eppendorf Scientific Inc., Westbury, NY, USA) e consistiu de tempo de tres minutos de desnaturacao inicial a 94[degre]C, seguido por 35 ciclos de um minuto a 94[degre]C, dois minutos a 57[degre]C, dois minutos a 72[degre]C e tempo de extensao final de sete minutos a 72[degre]C. DNA extraido do sangue de tres caninos saudaveis provenientes da Universidade de Purdue, nos Estados Unidos (EUA), e agua ultrapura foram utilizados como controles negativos. As amostras foram submetidas a eletroforese (15[degre]L) em gel de agarose a 1,5% por uma hora a 80V. O gel foi corado com brometo de etidio e fotografado utilizando Epi Chemi II Darkroom (UVP Inc., Upland, CA, USA). Um marcador de peso molecular de 100pb (DNA ladder, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) foi utilizado para comparar o tamanho dos produtos.

O produto da amplificacao do tamanho aproximado ao esperado de 625pb foi purificado a partir do gel de agarose, utilizando-se o kit comercial Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA), de acordo com as instrucoes do fabricante, e clonados utilizando-se o vetor pGEM-T EasyVector (pGEM-T EasyVector System II, Promega, Madison, WI, USA). Os plasmidios foram purificados utilizando-se o kit comercial QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Para evitar possiveis erros cometidos durante a PCR, tres amostras provenientes de diferentes colonias foram enviadas para sequenciamento (Purdue Genomics Core Facility at Purdue University, West Lafayette, IN, USA).

As analises moleculares foram realizadas utilizando-se os programas Blastn (BENSON, 1998) e Clustal W2 (THOMPSON et al., 1999). Para a analise filogenetica do novo isolado, 19 sequencias de H. canis e uma sequencia de H. americanum foram obtidas na base de dados contida no GenBank. Alinhamentos foram realizados utilizando-se o programa Clustal W e ajustadas manualmente. A arvore filogenetica foi construida utilizando-se o programa Mega package (TAMURA et al., 2007) pelo metodo Kimura-neighbour-joining (Figura 1).

RESULTADOS E DISCUSSAO

Os sinais clinicos descritos na literatura relacionados com hepatozoonose canina incluem anorexia, emagrecimento, membranas mucosas palidas, perda de peso, febre, poliuria, polidipsia, dor, vomitos, diarreia, fraqueza, depressao, incoordenacao dos membros posteriores, emaciacao, linfadenopatia periferica, membranas palidas e febre (VOYVODA et al., 2004). No cao do presente relato, apenas perda de peso foi observada. O paciente apresentava sangramento nas pontas das orelhas, sinal que nao esta associado a esse patogeno, e sim a infeccao por Rangelia vitalli (LORETTI & BARROS, 2004), o que traz a suspeita de coinfeccao, fato nao confirmado devido a ausencia de metodo diagnostico para tal parasita. A coinfeccao com outros parasitas transmitidos por carrapatos e comum em caes no Brasil, e agentes como Babesia sp. e Ehrlichia sp. tambem nao podem ser descartados (DANTAS-TORRES, 2008).

[FIGURA 1 OMITTED]

A presenca de gamontes de Hepatozoon spp. foi observada no esfregaco sanguineo, sendo essa a forma mais comum do diagnostico da doenca, porem a tecnica possui baixa sensibilidade, pois os gamontes podem nao ser detectaveis devido ao seu baixo numero circulante e a parasitemia intermitente (O'DWYER et al., 2001), alem de nao distinguir as especies. As tecnicas moleculares, alem de servirem como ferramenta de diagnostico e de estudos epidemiologicos, tem facilitado analises geneticas importantes para a caracterizacao e distincao das especies de Hepatozoon spp. (RUBINI et al., 2005)

A confirmacao sobre a especie envolvida na hepatozoonose em diferentes paises foi, historicamente, controversa. Com o uso das tecnicas moleculares, somente em 2000, BANETH e colaboradores demonstraram uma diferenca de 13,59% de homologia entre o H. americanum e H. canis na regiao 18S do gene para RNA ribossomico, comprovando definitivamente que as especies sao diferenciadas, causando doencas tambem distintas.

Apesar de outros autores terem utilizado a mesma tecnica de PCR para deteccao do Hepatozoon spp. com sucesso (RUBINI et al., 2005; GARCIA DE SA et al., 2007), bandas inespecificas e formacao de hibridizacao indesejada pelos primers (primer-dimer) foram observadas, mesmo utilizando diferentes temperaturas de hibridizacao (Figura 2). A formacao de primer-dimer pode ser explicada pelo fato do primer HepR possuir seis pares de base na extremidade 3', que sao complementares a ele mesmo. Outra limitacao desse protocolo de PCR e que ele nao diferencia as especies de Hepatozoon sp. e deve ser associado a outra tecnica molecular como o sequenciamento, o que dificilmente se aplica a rotina laboratorial. Devido aos problemas na tecnica de PCR disponivel e a ausencia de um controle positivo, a estrategia utilizada foi utilizar pelo menos tres amostras de DNA de caes saudaveis como controles negativos. Ao comparar-se a amostra do cao infectado com o controle negativo, uma banda extra de tamanho proximo aos 663pb (tamanho esperado para o protocolo utilizado) foi evidenciada no cao em estudo e ausente nos controles negativos. Para confirmar a identidade do produto, a banda extra foi extraida do gel de agarose e purificada. A purificacao da banda a partir do gel evitou que as bandas inespecificas presentes fossem fatores complicadores para a reacao de clonagem e o sequenciamento do fragmento. Quatro reacoes de sequenciamento foram obtidas com sucesso. Os primers foram excluidos, e a sequencia de 625pb foi submetida a base de dados do GenBank sob o numero de acesso #EU571737 e denominada "isolado de Porto Alegre".

[FIGURA 2 OMITTED]

A analise molecular demonstrou que o isolado de Porto Alegre e 100% homologo com cinco isolados, dentre eles, tres especies diferentes do cao domestico: uma raposa proveniente da Espanha (AY150067) e dois canideos selvagens provenientes do Brasil, sendo um graxaim (Pseudalopex gymnocercus) (AY471615) residente na regiao dos pampas e um canideo do genero Dusicyon thous (AY461375) (CRIADO-FORNELIO et al., 2006), o que sugere que canideos selvagens podem servir como reservatorios da doenca e provavelmente compartilham os mesmos vetores. Outro isolado 100% homologo foi o isolado 1 (DQ198378) depositado por RUBINI et al. (2005), que relata o caso de um cao domestico tambem proveniente do Brasil. Alem disso o isolado de Porto Alegre apresentou homologia de 99% com um isolado de um gato domestico proveniente de Sao Paulo (DQ315565), sugerindo que o H.canis pode infectar outras especies. Comparando-se com H. americanum, o isolado de Porto Alegre obteve homologia menor que 92%. CRIADO-FORNELIO et al. (2006) detectaram H. canis em nove de 13 (69.2%) canideos selvagens provenientes do Rio Grande do Sul. No mesmo trabalho, quando analisados os isolados de caes domesticos e raposas, dois genotipos de H. canis foram observados e denominados "Spain1" (AY150067) e "Spain 2" (AY461378). Os autores tambem observaram uma tendencia dos isolados "Spain 1" serem mais comuns nas raposas e Spain 2, nos caes. No entanto, o isolado descrito neste estudo e mais semelhante ao Spain 1 (Figura 1). Esses achados confirmam que a especie, nesse caso, e o Hepatozoon canis, porem a analise filogenetica permanece inconclusiva e precisa de mais investigacoes.

A tecnica pela PCR combinada com sequenciamento confirmou que a hepatozoonose canina, nesse caso, foi causada pelo Hepatozoon canis. A identificacao da especie de Hepatozoon e de extrema importancia, principalmente apos o isolamento de uma especie de Hepatozoon semelhante ao H. americanum em um canideo selvagem, no Rio Grande do Sul (CRIADO-FORNELIO et al., 2006). Devido ao fato de a PCR descrita neste estudo nao diferenciar as especies e ser portanto dependente de posterior sequenciamento, sua utilizacao na rotina laboratorial e limitada.

CONCLUSOES

O presente estudo relata um caso de infeccao canina por H. canis diagnosticado por meio de esfregaco sanguineo e confirmado pela tecnica de PCR associada ao sequenciamento e alerta para a escassez de dados sobre a ocorrencia de hepatozoonose na regiao Sul do Brasil.

AGRADECIMENTOS

A Universidade Federal do Rio Grande do Sul e ao Departamento de Patobiologia Comparada da Universidade de Purdue (West Lafayette, Indiana, USA), pelo suporte laboratorial, e a Ana Marcia de Sa Guimaraes, pela construcao da arvore filogenetica.

Recebido para publicacao 17.08.08

Aprovado em 19.05.09

REFERENCIAS

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Camila Serina Lasta (I) Andrea Pires dos Santos (II) Fabiola Peixoto da Silva Mello (III) Luciana de Almeida Lacerda (II) Joanne Belle Messick (IV) Felix Hilario Diaz Gonzalez (V)

(I) Hospital de Clinicas Veterinarias, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Av. Bento Goncalves, 9090, 91540-000, Porto Alegre, RS, Brasil. E-mail: camila.lasta@ufrgs.br. Autor para correspondencia.

(II) Programa de Pos-graduacao em Ciencias Veterinarias, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil.

(III) Hospital Veterinario, Pontificia Universidade Catolica do Rio Grande do Sul (PUCRS), Uruguaiana, RS, Brasil.

(IV) Department of Veterinary Pathobiology, Purdue University, West Lafayette, Indiana, U.S.A.

(V) Faculdade de Veterinaria, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil.
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Author:Lasta, Camila Serina; dos Santos, Andrea Pires; Mello, Fabiola Peixoto da Silva; Lacerda, Luciana de
Publication:Ciencia Rural
Article Type:Report
Date:Oct 1, 2009
Words:2952
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