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Heparinoides naturais isolados de rodoficeas (Halymenia sp.) arribadas na costa cearense.

Natural heparinoids isolated from Halymenia sp. (Rhodophyceaes) delivery on the Ceara coast.

Introducao

As algas sao organismos fotossintetizantes de grande valor ecologico e que sao utilizadas pelo homem ha decadas (LEVRING et al., 1969; GREENWELL; LAURENS, 2008; NEORI et al., 1998). A sintese de compostos conhecidos como polissacarideos sulfatados (PS) tem despertado grande interesse nas industrias de alimento (GLICKSMAN, 1983), farmaceutica (ATHUKORALA et al., 2006; FARIAS et al., 2001; FONSECA et al., 2008; PUSHPAMALI et al., 2008) e outros setores economicos (ARAUJO et al., 2008; RODRIGUES et al., 2009a), proporcionando, assim, a obtencao de novos polimeros naturais para biotecnologia.

A incidencia das doencas cardiovasculares nos ultimos anos tem sido relacionada, principalmente, ao proprio estilo de vida do homem (sedentarismo, estresse e habitos alimentares), sendo, nos Estados Unidos, duas vezes maior o numero de mortes comparadas ao cancer (NADER et al., 2001). Considerada o segundo agente terapeutico natural mais utilizado no mundo, a heparina (HEP) e um PS com potente atividade anticoagulante e antitrombotica rotineiramente empregada em cirurgias cardiacas no mundo. Porem sua utilizacao tambem e potencialmente acompanhada por diversos fatores de risco, tais como hemorragia, plaquetopenia, viral etc, mesmo com o uso de HEPs de baixo peso (THOMAS, 1997). Recentemente, Melo et al. (2008) reportaram a baixa qualidade de preparacoes de HEPs disponiveis no mercado brasileiro, em decorrencia da carencia da HEP no mercado internacional e seus potenciais riscos de contaminacao.

Diversos organismos sao fontes naturais de heparinoides, incluindo os invertebrados (MOURAO; PEREIRA, 1999), as algas marinhas (ATHUKORALA et al., 2006; FONSECA et al., 2008) e os peixes (MANSOUR et al., 2009), e varios aspectos sobre estrutura e metabolismo de polissacarideos de algas marinhas podem ser encontrados em revisoes especificas (PERCIVAL; McDOWELL, 1967). Farias et al. (2000) e Pereira et al. (2005) relataram galactanas sulfatadas obtidas por digestao enzimatica das rodoficeas Botryocladia occidentalis e Gelidium crinale com potentes atividades anticoagulantes. A rodoficea Champia feldmannii tambem possui PS com atividade anticoagulante (ASSREUY et al., 2008), enquanto aquele isolado da alga marinha vermelha Lomentaria catenata superou a HEP (PUSHPAMALI et al., 2008).

Algumas atividades biologicas tem sido relatadas para especies do genero Halymenia (RODRIGUES et al., 2009a; 2009b). Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar algumas caracteristicas dos PS isolados de uma especie do genero (Halymenia sp). O potencial anticoagulante desses compostos tambem foi avaliado, contribuindo com a bioprospeccao de novos anticoagulantes naturais.

Material e metodos

Alga marinha e extracao dos PS totais (PST)

Exemplares arribados de Halymenia sp. C. Agardh (Rhodophyta) foram coletados na praia de Flecheiras-Trairi-Ceara, em julho de 2005, e conduzidos em sacos plasticos para o Laboratorio de Bioquimica Marinha do Departamento de Engenharia de Pesca/Universidade Federal do Ceara. Em laboratorio, as algas foram lavadas com agua destilada, desidratadas ao sol, cortadas em pequenos pedacos e armazenadas em frascos para posterior extracao dos PS. Posteriormente, os PST foram extraidos com 17 mL de uma solucao de papaina bruta (30 mg m[L.sup.-1]) em 250 mL de tampao acetato de sodio 0,1 M (pH 5,0), contendo EDTA 5 mM e cisteina 5 mM (AcNa) a partir de 5 g de tecido. Em seguida, o material foi filtrado e, apos centrifugacao (7.965 X g; 20 min. 10[grados]C), os PS presentes na mistura foram concentrados por precipitacao com 16 mL de cloreto cetilpiridinio (CCP) a 10%, lavado (200 mL; CCP 0,05%) e posteriormente dissolvido em 174 mL de NaCl 2M: etanol absoluto (100: 15; v [v.sup.-1]). Logo apos uma precipitacao com etanol absoluto (24h; 4[grados]C), o material foi lavado com etanol 80% (200 mL; 2 X), etanol absoluto (200 mL; 1 X) e seco em estufa durante 24h a 60[grados]C (FARIAS et al., 2000). Os residuos das extracoes foram redigeridos com papaina a fim de se tornar otimo o rendimento de acordo com Rodrigues et al. (2009b).

Purificacao por cromatografia de troca ionica (DEAE-celulose)

Inicialmente, os PST (10 mg) foram dissolvidos em tampao AcNa 0,1 M e submetidos a cromatografia de troca ionica em coluna de DEAE-celulose equilibrada e percolada com o tampao de extracao (AcNa 0,1 M) ate a completa remocao dos polissacarideos nao-retidos, seguido do fracionamento dos PS por eluicao com o mesmo tampao, contendo NaCl em diferentes concentracoes (0,25; 0,50; 0,75; 1,00; 1,25; 1,50; 1,75 e 2,00 M), utilizando-se um coletor de fracoes (FRAC-920) com fluxo ajustado para 60 mL h-1. As fracoes (5 mL) obtidas foram monitoradas por meio da propriedade metacromatica, usando-se o azul de 1,9-dimetilmetileno (ADM) (FARNDALE et al., 1986) a 525 nm. As fracoes de PS obtidas foram dialisadas exaustivamente contra agua destilada, concentradas por liofilizacao e armazenadas ate a realizacao dos ensaios.

Deteccao de carboidratos totais e eletroforese em gel de agarose

A presenca de carboidratos totais (CT) das fracoes de PS obtidas foi determinada pelo metodo fenol-acido sulfurico segundo Dubois et al. (1956). Os PST e as fracoes de PS (15 |ag) tambem foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 0,5% em tampao 1,3--acetato diaminopropano 0,05 M (pH 9,0). As fracoes foram aplicadas no gel e a corrida foi realizada em voltagem constante (110 V) durante 60 min. Apos a corrida, os PS presentes no gel foram fixados com uma solucao de N-cetilN,N,N-brometo de trimetilamonio a 0,1% por 24h. Em seguida, o gel foi corado com azul de toluidina a 0,1% e descorado com uma solucao de etanol absoluto, agua destilada e acido acetico concentrado (4,95: 4,95: 0,1; [v.sup.-1] [v.sup.-1] [v.sup.-1]) (DIETRICH; DIETRICH, 1976).

Ensaios anticoagulantes

Para os testes, sangue de coelho citratado foi obtido de animais mantidos pela Universidade Federal do Ceara e a avaliacao do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) foi mensurada, segundo Anderson et al. (1976). Inicialmente, o sangue foi centrifugado (73,75 X g; 15 min.) para a obtencao de um plasma pobre em plaquetas. O teste foi realizado, incubando-se a 37[grados]C por 3 min. 50 [miro]L de cefatina ativada (Celite, Biolab), 50 [micro]L de plasma de coelho e 10 [micro]L da solucao de PS. Apos a incubacao, foram adicionados 50 [micro]L de cloreto de calcio 25 mM (Celite, Biolab) a mistura para se ativar a cascata de coagulacao. O tempo de coagulacao foi determinado automaticamente pelo coagulometro (Drake, modelo Quick-timer) em duplicata e os valores expressos em unidades internacionais por mg de polissacarideo (UI [mg.sup.-1]), utilizando-se um padrao de HEP (100 UI [mg.sup.-1]).

Resultados e discussao

Rendimento

O emprego da metodologia que utiliza a digestao enzimatica de proteinas por enzimas proteoliticas (papaina) resultou em tres extracoes consecutivas de PST (Figura 1). Os rendimentos sofreram decrescimos marcantes no decorrer das extracoes de Halymenia sp. mas totalizaram 53,96% de rendimento final. No entanto, a maior quantidade de PST foi obtida durante a primeira extracao (46,0%). A segunda e a terceira extracoes resultaram em apenas 7,36 e 0,6%, respectivamente, a partir da alga desidratada e triturada.

Varios metodos sao empregados na obtencao de PST de algas marinhas (ASSREUY et al., 2008; ATHUKORALA et al., 2006; FARIAS et al., 2000; PERCIVAL; McDOWELL, 1967; PEREIRA et al., 2005; PUSHPAMALI et al., 2008) e a utilizacao de extracoes consecutivas tem sido uma tecnica eficiente na otimizacao do rendimento desses compostos. Extracoes sucessivas de PST na presenca da papaina que utiliza a cloroficea Caulerpa sertularioides por Bezerra-Neto et al. (2008) resultou em rendimentos totais de 7,10 e 8,10%, utilizando, respectivamente, CCP e etanol absoluto como solventes na precipitacao de PST. Na extracao de PST de outra especie do genero (Halymenia pseudofloresia), Rodrigues et al. (2009b) obtiveram rendimentos inferiores (40,50; 4,90 e 1,74%, respectivamente) quando comparados a este trabalho (Figura 1). Portanto, a rodoficea Halymenia sp. e uma excelente fonte de PS.

[FIGURA 1 OMITIR]

Neste trabalho, o decrescimo no rendimento no decorrer das extracoes tambem foi observado em outras especies (BEZERRA-NETO et al., 2008; RODRIGUES et al., 2009b), o que sugere a eficiencia do metodo na extracao de diferentes grupos de PST alocados entre diferentes camadas do tecido algal (PERCIVAL; McDOWELL, 1967) para favorecer a obtencao de novos biopolimeros naturais, tendo em vista que algumas especies de rodoficeas possuem PS (conhecidos como ficocoloides) de alto valor comercial em razao de suas propriedades espessantes, geleificantes e emulsificantes na industria de alimentos (GLICKSMAN, 1983).

Vale salientar que a utilizacao da mesma metodologia empregada neste trabalho tambem se demonstrou eficiente quando comparada a outra especie do genero (RODRIGUES et al., 2009b). Contudo, a biossintese e composicao quimica desses compostos podem sofrer variacao mediante as condicoes climaticas ambientais. Os fatores de temperatura, luminosidade e a concentracao de nutrientes na agua variam com a localidade e a estacao do ano (PERCIVAL; McDOWELL, 1967).

Purificacao por cromatografia de troca ionica DEAE-celulose

Os perfis cromatograficos obtidos em DEAEcelulose (gradiente salino) foram diferentes entre as extracoes. Na 1a extracao foram separadas quatro fracoes eluidas com NaCl 0,50 (F I); 0,75 (F II); 1,00 (F III) e 1,25 M (F IV), das quais a F II apresentou a maior metacromasia em 525 nm (Figura 2A). Este comportamento diferiu em relacao a 2a e a 3a extracoes (Figuras 2B e C), quando foram observadas diferencas no numero e na intensidade metacromatica das fracoes. As fracoes F I, F II e F III (3a extracao) apresentaram as maiores metacromasias dentre todas as extracoes da especie. Alem disso, as fracoes apresentaram uma presenca variavel de CT pelo metodo fenol-acido sulfurico (DUBOIS et al., 1956) quando tambem comparadas as obtidas de H. pseudofloresia (RODRIGUES et al., 2009b).

Diferencas marcantes entre perfis cromatograficos de PS tambem foram relatadas utilizando outra especie do genero recentemente investigada por Rodrigues et al. (2009b), quando a intensidade metacromatica das fracoes tambem diferiu entre as extracoes, enquanto perfis comparativamente bem semelhantes de PS foram obtidos da cloroficea C. sertularioides por BezerraNeto et al. (2008), a partir de diferentes extracoes de PST. Portanto, tais diferencas nos perfis dos fracionamentos de PS por DEAE-celulose de algas marinhas tambem seriam caracteristicas de cada especie. Estes resultados indicam que a resina de DEAE-celulose foi eficiente na separacao de fracoes de PS extraidos da rodoficea Halymenia sp.

Eletroforese em gel de agarose

A eletroforese em gel de agarose revelou diferencas entre o grau de purificacao das fracoes, bem como no padrao de cargas entre os PST e as fracoes de PS obtidas de uma unica extracao (Figura 3). As fracoes FI;FIIeF III (1a extracao) apresentaram padrao de cargas semelhantes entre si, porem com baixa purificacao (Figura 3A). Por sua vez, a F IV (dado nao-apresentado) nao foi observada no gel, sugerindo-se menor presenca de grupos sulfato. Por outro lado, quando as fracoes obtidas na 3a extracao foram submetidas a eletroforese (Figura 3B), observou-se maior resolucao bem como mobilidades semelhantes a HEP.

[FIGURA 2 OMITIR]

Rodrigues et al. (2009b) tambem obtiveram resultados semelhantes durante a purificacao de PS da rodoficea do mesmo genero (H. pseudofloresia). Os autores observaram que o grau de definicao aumentou ao longo do processo, uma vez que essas macromoleculas apresentavam uma estrutura quimica bastante complexa e heterogenea (FARIAS et al., 2000; PEREIRA et al., 2005; PUSHPAMALI et al., 2008). Assim como foi observado anteriormente, a coluna de troca ionica DEAE-celulose foi eficiente na purificacao das fracoes de PS de Halymenia sp. (Figuras 2 e 3). Por outro lado, o perfil eletroforetico observado na 3a extracao (Figura 3B) foi diferente daquele obtido na 3a extracao de H. pseudofloresia (RODRIGUES et al., 2009b), quando, nesta ultima, a presenca nos PST de duas bandas distintas entre si pela densidade de cargas no gel resultou em um padrao eletroforetico distinto tanto entre os PST e as respectivas fracoes, bem como entre os PST e as demais extracoes da especie. Tais caracteristicas se traduzem na complexidade e heterogeneidade desses compostos quando obtidos de diferentes especies e, acredita-se que o maior grau de purificacao desses PS obtidos se traduza numa vantagem na caracterizacao desses compostos (RODRIGUES et al., 2009b), tendo em vista a grande dificuldade na elucidacao de suas estruturas quimicas (FARIAS et al., 2000; PERCIVAL; McDOWELL, 1967; PEREIRA et al., 2005) e suas relacoes com as atividades biologicas (FONSECA et al., 2008; MOURAO; PEREIRA, 1999).

[FIGURA 3 OMITIR]

Atividade anticoagulante

O teste do TTPA e um dos mais usados na mensuracao de PS com atividade anticoagulante, indicando com precisao o potencial anticoagulante do composto isolado (MOURAO; PEREIRA, 1999). Assim, a especie apresentou fracoes com atividade anticoagulante. A fracao F II, eluida com 0,75 M de NaCl, foi a mais ativa na 1a extracao, seguida das fracoes F IV; F III e F I (1,25; 1,00 e 0,50 M de NaCl), cujas atividades foram 110,40; 98,80; 79,60 e 54,10 UI [mg.sup.-1], respectivamente (Figura 4A). Contudo, a atividade sofreu um acrescimo na 3a extracao (Figura 4B), prolongando em 2,77 vezes (143,10 UI [mg.sup.-1]) o TTPA do plasma de coelho (26,70 s). A fracao F I (0,50 M de NaCl), a uma elevada concentracao de PS (1,0 mg m[L.sup.-1]), tambem nao foi praticamente capaz de alterar o TTPA normal. Desta forma, a atividade observada em fracoes isoladas de Halymenia sp. superou o padrao de HEP utilizado (100 UI mg-1). Geralmente, um prolongamento no TTPA sugere inibicao da via intrinseca e/ou comum da cascata de coagulacao (PUSHPAMALI et al., 2008; RODRIGUES et al., 2009b; RODRIGUES et al., 2010).

Este trabalho tambem sugere que e possivel se obter PS com diferentes atividades anticoagulantes (TTPA), utilizando-se extracoes consecutivas do mesmo material. Farias et al. (2000) sugerem que a adicao de esteres sulfato a uma unica unidade de a-galactana do polissacarideo isolado da rodoficea B. occidentalis tem efeito amplificador na atividade anticoagulante, o qual exerce mecanismo potencializador na inibicao da atividade da trombina mediante a antitrombina e o cofator II da HEP (reguladores plasmaticos da coagulacao sanguinea). A galactana de B. occidentalis tambem apresentou potente atividade antitrombotica, quando o composto exerceu, a uma dose de 0,20 mg kg-1, efeito maximo pelo modelo intravenoso em ratos (FARIAS et al., 2001). Os autores ainda observaram que o polissacarideo nao alterou a coagulacao para exibir um efeito antitrombotico.

[FIGURA 4 OMITIR]

Recentemente, Rodrigues et al. (2009b) reportaram acentuada atividade anticoagulante de fracoes de PS isoladas da rodoficea H. pseudofloresia, utilizando plasma de coelho citratado. Os autores tambem observaram que o TTPA modificou-se entre as diferentes extracoes de PST realizadas para a especie, cujas atividades das fracoes obtidas na primeira extracao (464,20; 211,60; 103,50 e 101,70 UI mg-1) foram superiores quando comparadas aquelas da terceira (137,10; 96,50 e 89,20 UI mg-1) extracao, respectivamente, sendo, portanto, superiores ao padrao de HEP utilizado (100 UI mg-1) e a especie utilizada neste trabalho (Figura 4). Quando esses polissacarideos, obtidos da extracao de PST de maior rendimento, foram utilizados em bioensaios na agua de cultivo do camarao Litopenaeus vannamei, foi observado que o composto tambem proporcionou melhora na taxa de sobrevivencia, qualidade no ganho de peso e consumo alimentar dos animais durante o periodo de aplicacao do PS, sugerindo uma acao imunoestimulante (RODRIGUES et al. 2009a) e demonstrando sua utilizacao em outros processos biotecnologicos. Segundo Bricknell e Dalmo (2005), o uso de imunoestimulantes na aquicultura e recomendado quando o risco de doencas e mais elevado, para melhorar o estado de saude dos organismos aquaticos, quando os animais sao expostos a situacao de estresse.

Neste trabalho, o efeito dos PS de Halymenia sp. na coagulacao foi 2,77 vezes mais potente que o padrao de HEP utilizado (Figura 4B). Curiosamente, a maior atividade foi observada na 3a extracao na qual o rendimento de PST foi minoritario (Figura 1), bem como dependente do acrescimo da propriedade metacromatica no decorrer das diferentes extracoes (Figuras 2 e 4). Porem, tal fato foi diferente daquele reportado para os PS isolados de H. pseudofloresia (RODRIGUES et al., 2009b), quando nao foi observada relacao entre metacromasia e atividade. Os TTPs tambem foram amplificados pelo aumento da concentracao de PS (dose-dependente) (Figura 4), sugerindo-se a realizacao de outros modelos biologicos. Segundo Mourao e Pereira (1999) o estudo desses compostos nao bastam apenas comparar uma requerida dose para uma acao antitrombotica, mas tambem a persistencia do efeito, niveis de circulacao no plasma, correlacao entre a acao anticoagulante e antitrombotica, alem da disponibilidade e absorcao quando a droga e administrada em diferentes rotas. Modelos de experimentacao animal representam ferramentas importantes para se avaliar os efeitos de diferentes polissacarideos no desenvolvimento de novas drogas e para tambem melhor conhecer a fisiopatologia das doencas tromboembolicas.

Fonseca et al. (2008) reportaram um estudo comparativo entre duas galactanas sulfatadas isoladas das rodoficeas B. occidentalis e Gelidium crinale, envolvendo relacoes entre suas diferencas nas proporcoes e/ou distribuicao dos radicais sulfato na estrutura quimica com seus mecanismos distintos de interacao com proteases, inibidores e ativadores do sistema de coagulacao para elucidar suas relacoes nas atividades anti- e pro-coagulantes, alem da acao antie pro-trombotica desses compostos. Essas galactanas ja haviam sido descritas por Farias et al. (2000) e Pereira et al. (2005) como agentes anticoagulantes (150 e 65 UI mg-1 para B. occidentalis e G. crinale, respectivamente).

Desta forma, as alteracoes na atividade entre as extracoes poderao ser melhor compreendidas pela elucidacao dos mecanismos de acao envolvidos na coagulacao e pela caracterizacao estrutural desses polimeros. O estudo das caracteristicas quimicas e estruturais dessas macromoleculas torna-se de grande importancia para se elucidar o efeito do composto na coagulacao (FARIAS et al., 2000; PONSECA et al., 2008; MOURAO; PEREIRA, 1999; PEREIRA et al., 2005). Portanto, as diferencas no grau de resolucao desses polissacarideos (Figura 3) podem ser resultado de mudancas dos padroes quimicos nas estruturas dessas moleculas (RODRIGUES et al., 2009a). A investigacao desta hipotese podera ajudar na melhor compreensao do mecanismo relacionado entre as funcoes biologicas e as estruturas desses compostos (BEZERRA-NETO et al., 2008; FONSECA et al., 2008; MOURAO; PEREIRA, 1999; RODRIGUES et al., 2009b).

Por outro lado, estudos relacionados ao cultivo desses organismos tambem sao fundamentais como forma sustentavel de utilizacao, em protecao aos bancos naturais de algas, ja que exemplares arribados da especie tambem participam do processo natural de fertilizacao costeira, promovendo o equilibrio ambiental.

Conclusao

Polissacarideos sulfatados extraidos sequencialmente mediante a digestao proteolitica (papaina) da alga marinha vermelha Halymenia sp. apresentaram atividade anticoagulante. No entanto, tal atividade modificou-se acentuadamente entre as extracoes, possivelmente em razao da mudanca da conformacao estrutural dessas macromoleculas. Acredita-se que, por meio do estudo dos mecanismos de acao envolvidos na coagulacao, sera possivel esclarecer tal fato.

DOI: 10.4025/actascibiolsci.v32i3.6282

Agradecimentos

A Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior, Capes.

Received on February 4, 2009.

Accepted on April 13, 2009.

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Jose Arievilo Gurgel Rodrigues, Valeska Martins Torres, Daniel Barroso de Alencar, Alexandre Holanda Sampaio e Wladimir Ronald Lobo Farias *

Departamento de Engenharia de Pesca, Universidade Federal do Ceara, Av. Humberto Monte, s/n, Bloco 927, 60356-000, Campus do Pici, Fortaleza, Ceara, Brasil. * Autor para correspondencia. E-mail: wladimir@ufc.br
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Title Annotation:texto en portugues
Author:Gurgel Rodrigues, Jose Arievilo; Torres, Valeska Martins; de Alencar, Daniel Barroso; Holanda Sampai
Publication:Acta Scientiarum Biological Sciences (UEM)
Date:Jul 1, 2010
Words:4643
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