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Hemoglobina: una molecula modelo para el investigador.

RESUMEN

Se presenta la revision general sobre la hemoglobina, una de las proteinas mas estudiadas y mejor caracterizadas. La gran variedad de aspectos cientificos que incluye y la importancia que juega en la biologia hace que, aunque los primeros estudios cientificos se hayan realizado desde el siglo XIX, aun hoy aparezcan sorprendentes descubrimientos acerca de esta molecula, tales como las nuevas globinas, neuroglobina y citoglobina y las llamativas interacciones con el oxido nitrico. Asimismo, el estudio de las hemoglobinopatias constituye un gran reto para la medicina moderna en la medida en que ponga al servicio de sus pacientes los resultados de la investigacion cientifica basica.

Palabras clave: Hemoglobina; Transporte de gases; Evolucion; Oxido nitrico.

Hemoglobin: a model molecule for research

SUMMARY

This paper has the objective to review hemoglobin, one of the most studied and characterized proteins. Hemoglobin is a very important protein in biology. Although the first papers were written in 19th century, today a lot of amazing discoveries are shown, like new globins neuroglobin and cytoglobin and, nitric oxide interactions. In addition, hemoglobinopathies are a medicine's challenge for applying basic research to the patient's attendance.

Key words: Hemoglobin; Blood gas transportation; Evolution; Nitric oxide.

Uno de los ejemplos mas llamativos de la relevancia del proceso evolutivo y la eficiencia de los sistemas biologicos se encuentra en los eritrocitos. Una de sus funciones vitales es su participacion en el intercambio gaseoso de oxigeno y dioxido de carbono entre los pulmones y los tejidos. La hemoglobina (Hb), es el componente fundamental de este proceso (1).

Las hemoglobinas son proteinas globulares, presentes en los hematies en altas concentraciones, que fijan oxigeno en los pulmones y lo transportan por la sangre hacia los tejidos y celulas que rodean el lecho capilar del sistema vascular. Al volver a los pulmones, desde la red de capilares, la hemoglobina actua como transportador de C[O.sub.2] y de protons (2).

La hemoglobina ha jugado un papel historico en la quimica, la biologia y la medicina. En 1849 se convirtio en la primera proteina en ser cristalizada y asociada con una funcion fisiologica especifica. La diferencia morfologica entre los cristales de hemoglobina de diferentes organismos proporciono por primera vez evidencia contundente acerca de la especificidad en la expresion proteica entre las especies. Ademas, se encuentra entre las primeras proteinas cuyo peso molecular fue determinado correctamente. En 1958 se convirtio en la primera proteina eucariota en ser sintetizada in vitro, trabajo que permitio comprobar que el mecanismo de sintesis proteica en eucariotas es similar al de Escherichia coli. Su estructura se establecio en [1960.sup.3]. El ARN mensajero de la globina fue el primer mensajero eucariota en ser aislado4 y en tener una secuencia nucleotida determinada (5).

El descubrimiento de que la anemia de celulas falciformes es causada por el reemplazo de uno solo de los 287 residuos de aminoacidos, presento por primera vez indicios de que una mutacion puntual en un gen estructural puede causar la sustitucion de un aminoacido en la proteina codificada por este gen y causar enfermedad (6). De otro lado, el estudio de la hemoglobina abrio campo al desarrollo de nuevos y sofisticados metodos fisicos y el establecimiento de importantes teorias sobre cooperatividad y alosterismo (7). De igual forma, la transicion de la sintesis de hemoglobina desde la vida fetal a la adulta es un gran ejemplo de diferenciacion cellular (8).

El estudio de las hemoglobinas anormales ha permitido claramente conocer la estrecha relacion entre los errores geneticos, los defectos proteicos y las manifestaciones clinicas que produce. Finalmente, la distribucion de ciertas hemoglobinas anormales como la HbS en regiones especificas endemicas de malaria, ilustra claramente los mecanismos naturales de la evolucion y adaptacion antropologica (polimorfismo balanceado).

GENETICA Y SINTESIS DE HEMOGLOBINA

La biosintesis de la Hb guarda estrecha relacion con la eritropoyesis. La expresion genetica y el contenido de Hb acompanan la diferenciacion de las unidades formadoras de colonias eritroides (UFC-E) en precursores eritroides. Cada una de las cadenas polipeptidicas de la Hb cuenta con genes propios: [alfa][beta][delta][gamma][epsilon]. Los genes [alfa] y [beta] son independientes y se ubican en cromosomas distintos. El grupo [alfa] se localiza en el brazo corto del cromosoma 16 y contiene ademas los codificadores de la cadena z. El grupo [beta] se localiza en el brazo corto del cromosoma 11 e incluye a los genes de las cadenas G[gamma], A[gamma], [delta] y [epsilon]. Todos los genes funcionales de la globina comparten una estructura general que consiste en 3 exones (secuencias codificadoras) y 2 intrones o sectores interpuestos (secuencias que no se traducen). La region promotora incluye alrededor de 100 pares de bases que preceden al punto de comienzo de la transcripcion (punto de clivaje). Tres secuencias de esta region se fijan a la ARN polimerasa que cataliza la sintesis de ARN mensajero. Existen dos secuencias claves en la iniciacion de la transcripcion: TATA y CAT; las mutaciones que las afectan limitan la transcripcion de ARNm. La porcion distal del tercer exon (AATAAA) finaliza la transcripcion. Solamente entre 5% a 10% del material genetico de los eritroblastos se transcribe; los genes de la globina pertenecen a esta fraccion (1).

La sintesis de ARN se lleva a cabo bajo la influencia de grupos enzimaticos denominados ARN polimerasas. La transcripcion primaria del ARNm incluye copias de toda la secuencia del ADN genomico (intrones y exones). Antes de su transporte al citoplasma se procesa por clivaje del extremo 5', hay separacion de las secuencias transcriptas de los intrones y poliadenilacion del extremo 3'. Este ultimo paso es esencial en el transporte y estabilizacion citoplasmatica del ARNm. La separacion implica la formacion de asas en el pre-ARNm, de manera que los extremos distales de los exones (puntos dadores) se acerquen a los proximales de los subsiguientes exones (puntos receptores). Luego, los intrones sufren clivaje enzimatico y los puntos dadores y receptores se sellan. Los puntos de consenso son secuencias de nucleotidos adyacentes que perfeccionan la sintesis del ARNm. Las mutaciones que involucran tanto los puntos de union, asi como los de consenso, alteran la separacion y crean ARNm anormales.

La causa mas comun de las hemoglobinopatias es la mutacion puntual, es decir, la sustitucion de un nucleotido de ADN por otro, lo que modifica el codigo genetico y puede inducir un cambio en un aminoacido de la globina resultante. Por ejemplo, la anemia de celulas falciformes (HbS), donde el acido glutamico se reemplaza por una valina en el aminoacido 6, que ocupa el tercer lugar del helicoide A de la cadena [beta]: [beta]6 (A3) Glu [flecha diestra] Val1.

La traduccion es un proceso ribosomico en donde se sintetiza una cadena polipeptidica de acuerdo con un patron proporcionado por la secuencia de codones del ARNm. Incluye cuatro etapas: activacion, en la que se forma el ARN de transferencia (ARNt); iniciacion, cuando el ARNt que contiene metionina, se alinea con el codon iniciador AUG en el ARNm del ribosoma; elongacion, donde cada anticodon del ARNt se adosa a cada codon del ARNm. Los aminoacidos del ARNt se adosan mediante un puente peptidico a otro aminoacido ya unido al ribosoma. Finalmente, la terminacion se produce cuando se llega a un codon de finalizacion UAA, la cadena polipeptidica se completa y se separa del ribosoma. Los polipeptidos libres forman de inmediato dimeros [alfa][beta] y tetrameros [[alfa].sub.2] [[beta].sub.2].

La maduracion de proeritroblastos a eritrocitos esta controlada positivamente por la hormona polipeptidica eritropoyetina, que promueve tanto la proliferacion como la sobrevida de los precursores eritroides. Tambien, sobre la superficie de dichos precursores, se encuentran unos receptores que promueven la apoptosis y que son estimulados por enzimas denominadas caspasas. La activacion de estos receptores (o la deprivacion de eritropoyetina) conduce al clivaje, por parte de las caspasas, de una proteina regulatoria nuclear llamada GATA-1, indispensable para el proceso eritropoyetico, lo que conduce a apoptosis y detencion de la maduracion. Los receptores de <<muerte celular>> se han denominado sistema Fas/FasL (10).

La constante investigacion acerca de los genes sobres los cuales actua el factor de transcripcion genetico GATA-1 condujo al descubrimiento de un gen expresado en altos niveles en el eritroblasto, que codifica una proteina chaperona denominada AHSP (proteina estabilizante de cadena alfa) la cual se une especificamente a las cadenas [alfa], y cuyo papel esta relacionado con la estabilizacion de dichas cadenas, evitando que se precipiten formando inclusiones citoplasmaticas (cuerpos de Heinz) que afectan a la membrana celular y conducen a la lisis eritrocitaria (11).

El grupo hem se sintetiza en virtualmente todos los tejidos, pero su sintesis es mas pronunciada en la medula osea y el higado, debido a la necesidad de incorporarlo en la Hb y los citocromos, respectivamente. Es una molecula plana que consta de un hierro ferroso y un anillo tetrapirrolico, la protoporfirina IX. Caracteristicamente demuestra una banda a 440 nm o de Soret y otras cuatro mas en el espectro visible (Grafica 1). El hem es un factor fundamental en la regulacion de la tasa de sintesis de la globina (12). Su principal efecto se ejerce en la iniciacion de la traduccion, donde bloquea la accion de un inhibidor de la produccion de globina (13). Tambien participa en la transcripcion y el procesamiento del ARNm. Su papel en la sintesis proteica en los mamiferos se extiende mas alla del eritrocito; en el tejido hepatico y cerebral se demuestran sustancias que dependen del hem para comenzar la produccion de proteinas (14).

[GRAFICO OMITIR]

Normalmente los eritrocitos envejecidos se degradan hacia el dia 120 de vida en la medula osea, el higado y el bazo. En algunas circunstancias sin embargo, los eritocitos sufren lisis intravascular, liberando Hb, que puede ser toxica para los tejidos a menos que se remueva rapidamente. La haptoglobina (Hp) es una proteina plasmatica que une Hb libre, a traves de la formacion de un complejo Hp-Hb. Este complejo es reconocido a traves de una proteina situada en la superficie de los macrofagos y monocitos denominada CD163, permitiendo su digestion y la seguida liberacion de hierro y bilirrubina. La expresion de Hp y CD163 esta regulada por proteinas de fase aguda como la interleucina 6 (IL-6) sugiriendo que las enfermedades inflamatorias cronicas se relacionan con alteraciones del metabolismo del hierro (15).

ESTRUCTURA DE LA Hb

Las cuatro cadenas polipeptidicas de la Hb contienen cada una un grupo prostetico hem. Un grupo prostetico es la porcion no polipeptidica de una proteina. El hem es una molecula de porfirina que contiene un atomo de hierro en su centro. El tipo de porfirina de la Hb es la protoporfirina IX; contiene dos grupos acidos propionicos, dos vinilos y cuatro metilos como cadenas laterales unidas a los anillos pirrolicos de la estructura de la porfirina. El atomo de hierro se encuentra en estado de oxidacion ferroso (+2) y puede formar cinco o seis enlaces de coordinacion dependiendo de la union del [O.sub.2] (u otro ligando) a la Hb (oxiHb, desoxiHb). Cuatro de estos enlaces se producen con los nitrogenos pirrolicos de la porfirina en un plano horizontal. El quinto enlace de coordinacion se realiza con el nitrogeno del imidazol de una histidina denominada histidina proximal. Finalmente, el sexto enlace del atomo ferroso es con el [O.dub.2], que ademas esta unido a un segundo imidazol de una histidina denominada histidina distal. Tanto el quinto como el sexto enlace se encuentran en un plano perpendicular al plano del anillo de porfirina (Figura 1).

[FIGURA 1 OMITIR]

Las cadenas polipeptidicas a contienen 141 aminoacidos, las no [alfa] 146 ([beta], [gamma], [delta]) y difieren en la secuencia de aminoacidos. Se conoce desde hace decadas la estructura primaria de las cuatro cadenas de Hb normales(16). La estructura secundaria es muy similar: cada una exhibe 8 segmentos helicoidales designados con las letras A a la H. Entre ellos se encuentran 7 segmentos no helicoidales: NA, AB, CD, EF, FG, GH Y HC. Esta distincion es fundamental pues los segmentos helicoides son rigidos y lineales, mientras que los no helicoidales son flexibles. Como el hierro del hem forma un puente covalente con la histidina proximal (F8) y el [O.dub.2] se une de forma covalente al hem y a la histidina distal (E7), el hem queda suspendido en una hendidura no polar entre los helicoides E y F (Figura 2).

[FIGURA 2 OMITIR]

La difraccion de rayos X de alta resolucion permitio conocer la naturaleza de los contactos intercatenarios de la Hb. Los que se establecen entre cadenas semejantes, es decir, [alfa]1[alfa]2 y [beta]1[beta]2 son limitados y de escasa importancia. Los principales contactos son [alfa]1[beta]1 y [alfa]1[beta]2 que determinan dos estructuras cuaternarias: una para la oxiHb y otra para la desoxiHb (17).

La parte porfirinica del hem se situa dentro de una bolsa hidrofobica que se forma en cada una de las cadenas polipeptidicas. Las estructuras obtenidas por difraccion de rayos X muestran que en la bolsa del hem existen unas 80 interacciones entre 18 aminoacidos y el hem. La mayoria de estas interacciones no covalentes se presentan entre cadenas apolares de aminoacidos y las regiones no polares de la porfirina.

TRANSPORTE DE [O.sub.2] Y C[O.sub.2]

La sangre necesita de un transportador de [O.sub.2] porque este gas no es suficientemente soluble en el plasma sanguineo para satisfacer las necesidades corporales. A 37[grados]C, un litro de sangre solo disuelve 2.3 ml de [O.sub.2]. Sin embargo, un litro de sangre contiene 150 g de Hb, y como cada gramo de Hb disuelve 1.34 ml de [O.sub.2], en total se transportan 200 ml de [O.sub.2] por litro de sangre. Esto es, 87 veces mas de lo que el plasma solo podria transportar. Sin un transportador de [O.sub.2] como la Hb, la sangre tendria que circular 87 veces mas rapido, lo que precisaria una bomba de alta presion, un flujo turbulento y un enorme desacople ventilacion-perfusion.

La relacion entre la tension de [O.sub.2] y la saturacion de la Hb se describe mediante la curva de saturacion de la oxiHb. La afinidad de la Hb por el [O.sub.2] se expresa en terminos de la tension de O en que se produce una saturacion de 50% de la Hb (P50). Este valor corresponde a 27 mm Hg aproximadamente. De forma parecida a las enzimas, una P50 alta corresponde a una afinidad por el [O.sub.2] baja.

La curva de disociacion de la oxiHb de los polipeptidos con una sola unidad hem, como la mioglobina es hiperbolica. Asi, su afinidad por el [O.sub.2] es mayor que la de la Hb, liberando [O.sub.2] solamente a muy bajas tensiones tisulares. Por el contrario, la curva de disociacion de la hemoglobina es sigmoidea. De esta forma, la Hb esta saturada 98% en los pulmones y solo 33% en los tejidos, de manera que cede casi 70% de todo el [O.sub.2] que puede transportar. La porcion mas empinada de la curva se encuentra en las zonas de baja tension de [O.sub.2] de los tejidos, lo que significa que disminuciones relativamente pequenas en la tension de [O.sub.2] dan lugar a grandes incrementos en la cesion de [O.sub.2]. Sin embargo, pequenas disminuciones en la tension de [O.sub.2] en los pulmones (altitud moderada) no comprometen seriamente la capacidad de la Hb para fijar [O.sub.2]. Adicionalmente, la curva revela que a bajas tensiones de [O.sub.2], la fijacion de [O.sub.2] es relativamente debil (menor afinidad), mientras que a altas tensiones la fijacion es fuerte (mayor afinidad). Lo anterior refleja el mecanismo de cooperatividad de la Hb, por el cual la ligadura del [O.sub.2] a una subunidad eleva la afinidad de las otras subunidades (18).

La afinidad de la Hb por el [O.sub.2] esta influida por una serie de variables que incluyen la concentracion de protones, el C[O.sub.2], la temperatura y el 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG)19. La concentracion del ion hidrogeno influye sobre la afinidad de la Hb por el [O.sub.2]. El pH bajo desplaza la curva hacia la derecha, facilitando la cesion de [O.sub.2], mientras que el pH elevado la desplaza hacia la izquierda. Esta modificacion se conoce como efecto Bohr y se representa por la ecuacion:

HHb + [O.sub.2][??] Hb[O.sub.2] + H+;

y demuestra que la oxigenacion de la Hb aumenta la acidez, o dicho de otra manera, la desoxigenacion de la Hb aumenta la basicidad.

La temperatura tiene tambien un efecto importante sobre la afinidad de la Hb por el [O.sub.2]. A temperaturas por debajo de la normal, la fijacion es mas fuerte, desplazando la curva a la izquierda; a temperaturas elevadas la fijacion se hace debil y la curva se desplaza a la derecha.

La hemoglobina muestra ademas un efecto heterotropico de gran significacion biologica. Esto implica su interaccion con el 2,3-DPG, el compuesto fosforilado predominante en el eritrocito (20). El 2,3-DPG funciona como un efector alosterico para la Hb. En la conformacion desoxi (estructura cuaternaria T, <<tensa>>) existe una cavidad suficientemente grande para admitir al 2,3-DPG entre las cadenas ?. Ademas, esta cavidad esta cargada positivamente, fijando asi una molecula de 2,3-DPG de carga negativa. Cuando la Hb se oxigena, asume una configuracion cuaternaria R, <<relajada>>. Los fenomenos moleculares de este cambio no se han establecido totalmente, pero al parecer implica una configuracion intermedia entre R y T. La conversion final a R se inicia con la fijacion de una molecula de [O.sub.2] a la interaccion [alfa]1[beta]2 y se continua con la eliminacion del 2,3-DPG y la disrupcion de los puentes salinos e interacciones hidrofobas en el contacto [alfa]1[beta]2 formados en T21. Las variaciones de la concentracion del 2,3-DPG desempenan un papel fundamental en la adaptacion a la hipoxia, de manera que en la hipoxemia aumenta el 2,3-DPG eritrocitario, la afinidad por el oxigeno declina y el aporte a los tejidos se facilita (22).

El transporte eritrocitario de C[O.sub.2], a diferencia del transporte de [O.sub.2], no se realiza por union directa al hem, sino que se relaciona estrechamente con el mantenimiento del pH sanguineo. El C[O.sub.2] difunde libremente en los eritrocitos, donde la anhidrasa carbonica cataliza la reaccion

C[O.sub.2] + [H.sub.2]O [H.sub.2]CO3

La posterior ionizacion del [H.sub.2]CO3 en H+ y HCO3- es una reaccion rapida y espontanea que genera cantidades equivalentes de H+ y de HCO3-. [O.sub.2]El H+ generado se incorpora a la desoxiHb, proceso facilitado por el efecto Bohr. El bicarbonato por su parte, difunde a traves de la membrana eritrocitaria y en parte se intercambia con iones Cl- del plasma, mecanismo denominado desplazamiento del cloruro. Asi se transporta la mayoria del C[O.sub.2]. El restante, se transporta como C[O.sub.2] disuelto (5%) y como carbaminohemoglobina (15%), producto de la reaccion del C[O.sub.2] con los grupos amino de la Hb, donde se generan entre 1 y 2 equivalentes de H+. La desoxiHb forma compuestos carbamino mas rapido que la oxiHb; la oxigenacion produce liberacion del C[O.sub.2] fijado. La curva de disociacion del C[O.sub.2] es mas lineal que la del [O.sub.2], sobre todo en el rango fisiologico 40-60 mm Hg. La desoxiHb tiene mayor afinidad por el C[O.sub.2] a causa del efecto Bohr. El desplazamiento de la curva (efecto Haldane) favorece la fijacion de C[O.sub.2] en los tejidos y su liberacion en los pulmones.

La Hb ademas de transportar [O.sub.2] y C[O.sub.2], juega tambien un papel fundamental en la regulacion del pH sanguineo. Esto se realiza por medio de dos mecanismos. El primero se debe a los grupos ionizables de la Hb (imidazoles de las 38 histidinas por tetramero), que junto con los fosfatos organicos de los eritrocitos y las proteinas plasmaticas suman 60% del amortiguamiento sanguineo. El resto del acido que se produce a partir del transporte de C[O.sub.2] (40%) es absorbido por la Hb a traves del transporte isohidrico de C[O.sub.2], que corresponde al segundo mecanismo y se basa en la capacidad de la Hb para captar H+ sin cambio en el pH.

HEMOGLOBINA NORMAL Y SUS VARIANTES

Para operar como vehiculo de intercambio gaseoso, la hemoglobina (Hb) debe satisfacer ciertos requerimientos basicos como son: ser capaz de transportar cantidades considerables de oxigeno; ser muy soluble; captar y descartar oxigeno a presiones apropiadas y, ser un buen amortiguador. Mas del 95% de la hemoglobina del adulto y de los ninos mayoreas de 7 meses es A (HbA). Su estructura se designa como [alfa]2[beta]2, para indicar que posee dos cadenas [alfa] y dos [delta]. Los adultos normales tambien tienen un 2-3% de HbA2, la cual esta compuesta por dos cadenas [alfa] como las de la Hb A, y dos cadenas [delta]. Se representa como [alfa]2[beta]2. Las cadenas [delta] son diferentes de las cadenas [beta] y estan bajo control genetico independiente. Normalmente tambien existen diversas especies de HbA modificada; se designan como A1a1, A1a2, A1b y A1c, y se deben a modificaciones postraduccionales de la Hb con diversos azucares como glucosa-6-fosfato. La mas importante cuantitativamente es la Hb A1c. Proviene de la fijacion covalente de un resto de la glucosa al extremo Nterminal de la cadena [beta]. La reaccion no es catalizada enzimaticamente, dependiendo entonces su velocidad de la concentracion de glucosa. Por tanto, la Hb A1c constituye una medida util del control de los pacientes diabeticos durante los dias o semanas previos a la toma de la muestra.

La Hb fetal (HbF), es el componente principal de la Hb del recien nacido. Posee dos cadenas [gamma] en lugar de dos cadenas [beta] y se representa [alfa]2[gamma]2. La HbF esta adaptada al ambiente materno-fetal. Ha de fijar el oxigeno mucho mas fuerte para competir por el [O.sub.2] con la HbA materna (su curva de saturacion esta desplazada a la izquierda). Esto se consigue gracias a que dos de los grupos que recubren la cavidad de fijacion de 2,3-difosfoglicerato (DPG) tienen cadenas laterales neutras, a diferencia de la HbA en la que estan cargadas positivamente. Lo anterior hace que el DPG, cargado negativamente, se una menos a la HbF y en lugar de ello, se fije mas fuerte el [O.sub.2]. Ademas, entre 15% y 20% de la HbF esta acetilada en sus N-terminales y se denomina HbF1; esta variante no fija DPG1 (Cuadro 1).

Las hemoglobinas Gower I, Gower II y Portland son embrionarias y solo aparecen durante el primer trimestre de gestacion (24). La Hb Gower II es la mas importante y alcanza entre 50% y 60% de toda la Hb embrionaria. Al parecer las cadenas polipeptidicas epsilon ([epsilon]) y zeta (z) se sintetizan en el saco vitelino. Las cadenas [beta], [epsilon], [gamma],[delta] estan codificadas por un gen del cromosoma 11; las z y [alfa] por un gen del extremo 5' del cromosoma 16.

EVOLUCION NATURAL

Las hemoglobinas estan presentes en todos los reinos de la naturaleza con particulares especializaciones de acuerdo con las necesidades de cada organismo. Se pueden sintetizar grandes cantidades de hemoglobina en celulas especializadas, como los eritrocitos, cuando es necesario transportar eficientemente [O.sub.2] a sitios especiales de intensa actividad respiratoria. Tambien se generan cantidades pequenas de proteinas como la mioglobina y la hemoglobina no simbiotica de las plantas cuando es necesario un rapido sistema intracelular de liberacion de [O.sub.2], como en la mitocondria o el cloroplasto (24). Cuando el sistema de transporte de electrones no esta separado del compartimiento intracelular, como en las bacterias, las hemoglobinas pueden ser usadas, bajo condiciones hipoxicas, para liberar oxigeno como aceptor terminal de electrones. Por tanto, existe una conexion evolutiva entre las hemoglobinas que transportan [O.sub.2], los citocromos que pasan electrones a traves de la cadena respiratoria y la fotosintesis, y las demas hemoproteinas que catalizan reacciones redox. Quiza 1.800 millones de anos atras los anillos de porfirina unidos a un metal evolucionaron junto con la fotosintesis y la consiguiente aparicion del [O.sub.2] en la atmosfera, a partir de un gen ancestral comun (Figura 3).

[FIGURA 3 OMITIR]

Pronto en la evolucion se incorporo la utilidad de los anillos de porfirina unidos a un metal para la transferencia de electrones. Tal es el caso de los citocromos que transportan electrones en la cadena respiratoria, u otras hemoproteinas que catalizan una clase variada de reacciones de oxidoreduccion. Aun en la fotosintesis, los anillos de porfirina transportan los electrones generados a partir de la luz solar y el agua para luego generar ATP. Otras hemoproteinas se han adaptado para unir reversiblemente el oxigeno generado en la fotosintesis y transportarlo a cada celula de todos los grupos de organismos: procariotas, hongos, plantas y animals (24,25).

La hemoglobina animal puede ser facilmente aislada en forma tetramerica, conteniendo dos cadenas polipeptidicas [alfa]-globina y dos [beta]-globina. Cada monomero de globina posee un grupo prostetico hem. La secuencia de aminoacidos de las cadenas [alfa] y [beta] globina son identicas en 50%, indicando que los dos genes que las codifican son descendientes de un ancestro comun, 450 millones de anos atras. Estudios posteriors (26-28) encontraron hemoglobinas en diferentes invertebrados: artropodos, anelidos y nematodos. Estas hemoglobinas estan relacionadas claramente con las hemoglobinas de los vertebrados en cuanto a su estructura primaria, lo que sugiere un gen ancestral comun para vertebrados e invertebrados, de 670 millones de anos (29).

Las plantas utilizan la hemoglobina para unir y transferir oxigeno a las mitocondrias durante la respiracion. Fue descubierta en los nodulos de las raices de las legumbres(30). Estos nodulos representan una actividad simbiotica con bacterias Rhizobium que permiten la fijacion (reduccion) del nitrogeno atmosferico para la eventual sintesis de aminoacidos para la planta. Este proceso requiere grandes cantidades de energia; los nodulos contienen una abundante hemoglobina denominada leghemoglobina, que facilita la difusion de oxigeno a la cadena respiratoria bacteriana. Ademas, constituye un mecanismo de secuestro de oxigeno, que mantiene al sistema reductor de nitrogeno libre de oxigeno, el cual es lesivo para dicha maquinaria. Aunque la secuencia de aminoacidos de las leghemoglobinas difiere en 80% de las hemoglobinas de los vertebrados, sus estructuras tridimensionales son identicas.

El descubrimiento de hemoglobinas en una gran variedad de plantas soporta el modelo de la leghemoglobina como un producto especializado de un gen comun propio de las plantas, que codifica para hemoglobina. La presencia de hemoglobinas, distintas a la leghemoglobina, en plantas no leguminosas (Parasponia andersonni) esta relacionada tambien con la fijacion simbiotica de nitrogeno. Sin embargo, estudios posteriores demostraron la existencia de hemoglobina extranodular con funciones no simbioticas, posiblemente relacionadas con el transporte de [O.sub.2] en la planta Trema tomentosa (31). Se describen entonces dos tipos de hemoglobinas en las plantas: simbioticas y no simbioticas, codificadas por un gen ancestral y al parecer comun con el gen animal (32) 1500 millones de anos atras.

Varios estudios confirman que el gen de la hemoglobina es verdaderamente ancestral y precede a la divergencia de procariotas y eucariotas. Dicho gen se encuentra en protozoarios como la Tetrahymenea y el Paramecium, asi como en las algas Chlamydomonas. Ha sufrido a lo largo de la evolucion modificaciones diferenciales en sus intrones pero ha conservado la funcion de codificar una proteina que transporta y libera [O.sub.2]. La levadura Saccharomyces presenta una flavohemoglobina al parecer relacionada con funciones de regulacion y senalizacion cellular(33). El nematodo Ascaris suum, posee una hemoglobina que cataliza la desoxigenacion dependiente de oxido nitrico, manteniendo plenamente la oxidacion mitocondrial anaerobica a nivel intestinal(34). De la misma forma, se han encontrado hemoglobinas en muchas bacterias entre las que se incluyen Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Vitreoscilla, Nostroc commune, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis, entre otras, donde cumplen funciones como la catalisis de reacciones redox, el transporte y liberacion de [O.sub.2] y el metabolismo del oxido nitrico.

NUEVAS GLOBINAS

Recientemente se ha descubierto, en las secuencias de ADN complementario, un tercer tipo de globina en ratones y en humanos denominada neuroglobina (NGB) (35). El gen codifica en ambas especies, una proteina de 151 aminoacidos (masa molecular de 17,000). Dicha proteina es en 94% similar entre el raton y el hombre, mientras que la similitud de esta con la Hb y la mioglobina humana es de tan solo 25% y 21% respectivamente. Lo anterior sugiere que es una proteina altamente conservada a traves de la evolucion (670 millones de anos aproximadamente) y que, aunque hace parte de la superfamilia de las globinas, tiene una funcion diferente. Se demostro espectroscopicamente, que la NGB es la primera hemoglobina hexacoordinada caracterizada en vertebrados (36). La hexacoordinacion es un mecanismo que regula la union del ligando con las proteinas hemicas, a traves de la competicion entre un ligando externo y uno interno por una cadena de aminoacidos (histidina distal). Con base en lo anterior se sugieren diversas funciones de la NGB: como transportador de [O.sub.2] y facilitador de su difusion a la mitocondria; como enzima, facilitando la generacion glicolitica de ATP; como sensor de [O.sub.2]; y como detoxificador de oxido nitrico (37-40).

El analisis del patron de expresion en diferentes tejidos resalta una mayor presencia de NGB en el cerebro, sobre todo en el lobulo frontal, el nucleo subtalamico y el talamo (Cuadro 2). La concentracion de esta proteina en el cerebro del raton es menor a 0.01% del contenido proteico total. La NGB se expresa como un monomero que une reversiblemente [O.sub.2]. Su espectro de absorcion tiene tres picos en 424, 528 y 558 nm en la forma desoxi-NGB, y un solo pico en 413 nm como oxi-NGB. Aunque los picos en el ultravioleta son similares a los de otras globinas, el espectro visible es inusual, e indica la presencia de un grupo hem de bajo spin, como el observado en las fibras nerviosas del molusco Spisula solidissima. La NGB recombinante tiene una afinidad por el [O.sub.2] de 1.9 a 2.3 torr, muy superior a la de la Hb de mamiferos (27 torr), pero inferior a la de la mioglobina (1 torr). El gen de la NGB esta ubicado en 14q24. posee tres intrones en las posiciones B12-2 (helice B, aminoacido 12, codon 2), E11-0 y G7-0. Los intrones B12-2 y G7-0 se conservan en las hemoglobinas y mioglobinas de los vertebrados y de otras familias taxonomicas. El intron central, E11-0, puede representar un caso de adquisicion independiente de un intron.

La presencia de un tercer tipo de globina, constituye un importante modelo para el estudio de la evolucion de las especies. Adicionalmente, constituye una proteina especializada en incrementar la presion de [O.sub.2] en tejidos especificos, diferentes al musculo. Sin embargo, se han observado globinas en el sistema nervioso de subfamilias de invertebrados, como anelidos, moluscos y nematodos. Las propiedades de union de [O.sub.2] de la NGB son semejantes a las de la mioglobina de los vertebrados, lo que sugiere una funcion similar, pero a nivel cerebral. A pesar de su baja concentracion, la NGB puede suplir de [O.sub.2] al cerebro, atravesando la barrera hematoencefalica.

Al igual que la NGB, la citoglobina (Cygb) fue encontrada en las bases de datos de ADN complementario del raton y el humano (41). Los analisis filogeneticos sugieren que la Cygb y la mioglobina forman un clan comun dentro del arbol de las globinas de los vertebrados. Estos genes se separaron hace aproximadamente 450 millones de anos. En este escenario evolutivo, la mioglobina parece ser una especializacion muscular de una globina intracelular que tiene una amplia distribucion tisular y una funcion general. El gen de la Cygb se encuentra en 17q25. La conservacion de las secuencias entre la Cygb de raton y la humana es de 96%. Los residuos claves en la estructura y funcion respiratoria de las globinas, PheCD1, HisE7 e HisF8, estan conservados en la Cygb. Ademas, esta proteina pertenece a las hemoglobinas hexacoordinadas recientemente descritas.

El papel fisiologico de las hemoglobinas pentacoordinadas de los vertebrados esta bien definido: el transporte de [O.sub.2] por la Hb y la difusion facilitada y el almacenamiento de [O.sub.2] por la mioglobina. Sin embargo, esta situacion es menos clara para las hemoglobinas hexacoordinadas. Al parecer, tanto la NGB como la Cygb, comparten las mismas propiedades estructurales y fisiologicas (42).

OXIDACION Y REDUCCION

La oxihemoglobina en solucion se autoxida y transforma en metahemoglobina (metHb-Fe+3). Sin embargo, para lograr la fijacion reversible del [O.sub.2], el hierro del hem debe mantenerse en estado reducido (Ferroso, Fe+2) a pesar de la exposicion a diversos oxidantes endogenos o exogenos. Entre estos se encuentran ciertos medicamentos oxidantes y algunas toxinas. Para evitar la inactivacion funcional de la Hb, el eritrocito cuenta con una eficiente maquinaria reductora.

La oxidacion de la Hb es escalonada. Los compuestos intermedios se denominan hibridos de valencia y son el resultado de la liberacion de [O.sub.2] molecular por parte de la oxiHb que termina generando aniones superoxido o peroxido que oxidan entonces el hierro Fe+2 a Fe+3. Normalmente se genera 0.5% a 3% de metHb al dia (43).

A medida que la desnaturalizacion progresa, la metHb se convierte en hemicromos. Estos aparecen cuando la sexta posicion de coordinacion del hierro se une de manera covalente con un ligando en la molecula de Hb (histidina distal-E7), lo que distorsiona la estructura terciaria. Los hemicromos pueden ser reversibles o irreversibles dependiendo del grado de distorsion de la molecula de Hb y la capacidad potencial de la enzima metahemoglobina reductasa de reducirlos. Cuando los fenomenos oxidativos facilitan la disrupcion de los contactos [alfa]1[beta]2, se produce la disociacion de las cadenas polipeptidicas en dimeros y monomeros que precipitan y constituyen las inclusiones cocoides intraeritrocitarias denominadas cuerpos de Heinz, que se unen a la membrana y acortan la vida del globulo rojo (1).

La reduccion de la metHb se produce basicamente por accion de la enzima citocromo b metahemoglobina reductasa (67% de participacion), que opera en presencia de dos portadores de electrones, el citocromo b y el NADH+H. La reduccion tambien se produce por otros agentes como el acido ascorbico (16%), el glutation (12%) y la enzima NADPH-flavina reductasa (5%). Las pruebas in vitro demuestran que la metahemoglobina reductasa es el factor limitante de la reduccion de metHb. El gen se localiza en el cromosoma 22 (44) y su deficiencia se asocia clinicamente con metahemoglobinemia (45).

A medida que el [O.sub.2] sufre reducciones univalentes, se generan especies reactivas que constituyen los oxidantes responsables de la desnaturalizacion, no solo de la Hb, sino de los demas componentes eritrocitarios, tales como los lipidos de la membrana, lo cual conduce a lisis cellular (46). Entre estos derivados estan los aniones superoxido, peroxido y los radicales hidroxilo. Para evitar en alguna medida este dano oxidativo, el organismo cuenta con ciertos mecanismos que impiden la acumulacion de estas toxinas; algunos se ubican dentro de los eritrocitos. Dentro de estos se encuentran: la superoxido dismutasa, que cataliza la dismutacion del superoxido a oxigeno molecular y peroxido; la catalasa, que separa al peroxido de hidrogeno en agua y oxigeno molecular. Ademas interactua con la membrana en forma dependiente del Ca+2 y el pH y funciona como un reservorio de NADPH (47), y finalmente, la glutation peroxidasa, principal selenoproteina del organismo (hecho que explica posiblemente las propiedades antioxidantes de este micronutriente) (48), que cataliza la conversion de peroxido a agua, oxidando el glutation. La alteracion genetica de la glutation peroxidasa provoca anemia hemolitica inducida por medicamentos. El glutation es el cofactor fundamental de la glutation peroxidasa. Constituye ademas el principal agente reductor de los eritrocitos y su sintesis requiere de dos reacciones:

1. Acido glutamico + cisteina [??] [gamma]-glutamil-cisteina

2. [gamma]-glutamil-cisteina + glicina [??] GSH

La primera reaccion esta catalizada por la glutamilcisteina sintetasa y la segunda por la glutation sintetasa49. El proceso que evita la oxidacion de la Hb requiere la oxidacion del glutation reducido (GSH) a glutation oxidado (GSSG). Para ello es necesario un sistema que mantenga un suministro continuo de GSH. Este sistema esta representado por la glutation reductasa, que cataliza la reduccion de GSSG a GSH, con la participacion del NADPH, producido en la via de las pentosas fosfato. Cualquier alteracion en alguna parte de esta via de sintesis del GSH conduce eventualmente a hemolisis.

HEMOGLOBINA Y OXIDO NITRICO (NO)

El oxido nitrico es un mensajero biologico que participa en la neurotransmision, en la regulacion vascular y en la respuesta inmune. Es producido por muchos tipos de celulas como las neuronas, el endotelio, las celulas musculares lisas vasculares y los macrofagos. Reacciona con la desoxiHb y la oxiHb para formar nitrosilHb (HbNO) y metHb mas nitrato, respectivamente. Las constantes de estas reacciones estan en el orden de 3-5 x [10.sup.7] [M.sup.-1] x [S.sup.-1], que significa una vida media de 1 [my]seg para el NO. Con esta vida tan corta, la concentracion de NO no seria suficiente para activar a la guanilato ciclasa y no produciria sus conocidos efectos de vasodilatacion. Ademas, la Hb libre se ha presentado como un <<barrendero>> muy eficiente de NO, lo que disminuye aun mas la biodisponibilidad de este mensajero. Sin embargo, normalmente la Hb esta encapsulada en los eritrocitos, permitiendo preservar la funcion de la molecula de NO por varios mecanismos fisiologicos aun no entendidos del todo.

Varias teorias intentan explicar este fenomeno. Una de ellas, establece que el NO entra en el eritrocito uniendose de manera cooperativa al hem de la Hb, formando HbNO, limitando entonces la formacion de metHb(50). Luego, la HbNO transfiere el NO a los grupos tiol (-SH) de [beta]93Cys para formar S-NitrosoHb (SNO-Hb). La S-nitrosilacion de la Hb ocurre sobre todo en la estructura R (alta tension de [O.sub.2] -pulmones-), mientras que la liberacion del NO se produce en la transicion a la estructura T (bajas tensiones de [O.sub.2] - capilares-). Despues, el NO se exporta, como un equivalente de NO bioactivo (X-SNO), a la membrana del eritrocito a traves de una proteina de intercambio anionico, la banda 3. Asi, el intercambio de grupos NO entre SNO-Hb y la membrana eritrocitaria esta gobernado por la tension de [O.sub.2] (P[O.sub.2]): los eritrocitos dilatan los vasos sanguineos a bajas P[O.sub.2], siendo requerida la produccion de nitroso-tioles (SNO) a nivel de la membrana eritrocitaria (51,52.)

Se establece ademas que la bioactividad del NO se preserva gracias a limitaciones en las interacciones entre el NO y el eritrocito. Estas barreras incluyen: 1) la propia membrana eritrocitaria (53); 2) una capa libre de eritrocitos en los vasos sanguineos inducida por el flujo laminar de sangre (54) y 3) el citoesqueleto eritrocitario (55). De esta forma se logra que el consumo de NO por parte del eritrocito sea aproximadamente 800 veces menor que el consumo por parte de la Hb libre.

Finalmente, cabe anotar que aunque la hemoglobina es la proteina mejor caracterizada en todos sus aspectos, y que se ha consolidado como un modelo de estudio en bioquimica y fisiologia, todavia falta mucho por descubrir acerca de su funcion y de sus interacciones con otras moleculas. Cuando se alcance este conocimiento se podran desarrollar o mejorar nuevas estrategias terapeuticas, por ejemplo, los sustitutos de la sangre en el campo de la medicina transfusional, la sobre expresion de la chaperona de la hemoglobina en pacientes con [beta]-talasemia y el uso terapeutico del NO y de las proteinas que se expresan en condiciones de hipoxia-isquemia.

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* Estudiante Maestria en Fisiologia, Division de Fisiologia, Division de Fisiologia, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia, Bogota, Colombia. e-mail: oapenuelab@unal.edu.co Recibido para publicacion agosto 3, 2004 Aprobado para publicacion junio 27, 2005

[GRAFICO OMITIR]
Cuadro 1
Hemoglobinas humanas

Nominacion    Composicion                         Proporcion

                                               adultos   neonatos
                                                 (%)       (%)

HbA           [[alfa].sub.2][[beta].sub.2]      97         20
[HbA.sub.2]   [[alfa].sub.2][[delta].sub.2]     2.5        0.5
HbF           [[alfa].sub.2][[gamma].sub.2]     <1         80

Cuadro 2
Expresion tisular de NGB

Tejido cerebral        Expresion (%)

Nucleo subtalamico         100
Lobulo frontal              73
Talamo                      73
Polo occipital              70
Cerebro fetal               34

Otros tejidos          Expresion (%)

Hipofisis                   62
Apendice                    25
Glandula adrenal            21
Pulmon                      19
Colon                       10
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Author:Andres Penuela, Oscar
Publication:Colombia Medica
Date:Jul 1, 2005
Words:8639
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