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Genotyping and host-specific relationship of infectious pancreatic necrosis virus in Chile.

Genotipificacion y relacion hospedador-especifica del virus de la necrosis pancreatica infecciosa en Chile

El virus de la necrosis pancreatica infecciosa (IPNV) es el agente causante de la necrosis pancreatica infecciosa (IPN), enfermedad que afecta principalmente a salmonidos cultivados en condiciones de produccion intensiva. Se le atribuyen mortalidades en la fase de alevin de hasta el 100% y de 10 a 20% en post-smolts luego de su traspaso a jaulas en el mar (Evensen & Santi, 2008).

La enfermedad presenta alta prevalencia y se encuentra diseminada en la mayoria de los paises donde se cultivan salmones (Munro & Midtlyng, 2011). En Chile, el primer reporte y caracterizacion del virus se realizo en 1984 (McAllister & Reyes, 1984; Espinoza et al., 1985); sin embargo, pasaron varios anos hasta que se constato la presencia de la enfermedad en 1998 (Taud & Palacios, 2003). Desde entonces, la enfermedad se extendio rapidamente por las diferentes areas de cultivo del pais, afectando principalmente a alevines de salmon del Atlantico (Salmo salar), aunque tambien ha sido reportada en trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) y salmon coho (Oncorhynchus kisutch) (SERNAPESCA, 2015). Ac-tualmente, IPN es considerada endemica y prevalente en Chile, y segun los ultimos informes sanitarios publicados por el Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura (SERNAPESCA), el virus IPN es uno de los patogenos detectado con mayor frecuencia por laboratorios de diagnostico y una de las principales causas de mortalidad por enfermedades prevalentes que afectan a salmones (SERNAPESCA, 2013, 2014b, 2015).

El IPNV pertenece al genero Aquabirnavirus, cuyos integrantes se caracterizan por tener un genoma ARN de doble cadena, que consta de dos segmentos, A (3.097 pb) y B (2.787 pb) (Dobos, 1995). El segmento A posee dos marcos de lectura abierta (ORF) superpuestos: el mas grande codifica para una poliproteina de 106 kDa en el orden N[H.sub.2]-pVP2-NS-VP3-COOH y el mas pequeno codifica para un polipeptido rico en arginina, conocido como VP5 (Duncan et al., 1987; Dobos, 1995). Por otro lado, el segmento B codifica para el polipeptido VP1 de 94 kDa que corresponde a la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp). Esta proteina se encuentra presente en dos formas: como un polipeptido libre o unido covalentemente al extremo 5' de los dos segmentos del ARN genomico (VPg) (Dobos, 1995).

Actualmente los Aquabirnavirus se clasifican en base a la secuencia de la region codificante de la proteina VP2 en 8 genogrupos. La primera clasificacion filogenetica fue propuesta por Blake et al. (2001), donde se describio la presencia de 6 genogrupos, compuestos por diferentes cepas de origen europeo, americano y asiatico. Posteriormente, Nishizawa et al. (2005) revelaron la existencia de un septimo genogrupo integrado unicamente por cepas japonesas, y recientemente en Australia se aislo un nuevo Aquabirnavirus desde trucha arcoiris, que fue clasificado en un octavo genogrupo (McCowan et al., 2015; Mohr et al., 2015). En Chile, los virus IPN que han sido caracterizados geneticamente pertenecen a los Genogrupos 1 y 5, i.e., norteamericanos y europeos, respectivamente (Eissler et al., 2011; Mutoloki & Evensen, 2011; Calleja et al., 2012; Tapia et al., 2015; Jorquera et al., 2016), dentro de los cuales forman sus propios subtipos o subgrupos (Tapia et al., 2015). Sin embargo, existe muy poca informacion acerca de la predominancia de cada uno de estos genogrupos y su interaccion con las distintas especies hospederas de salmonidos cultivadas en el pais.

La reaccion en cadena de la polimerasa anidada (PCR anidado) ha probado ser una tecnica de deteccion rapida y sensible para el IPNV (Rimstad et al., 1990; Lopez-Lastra et al., 1994; Barlic-Majanga et al., 2002; Cutrin et al., 2005), ya que permite amplificar y concentrar el material genetico del virus y detectarlo aun en casos en que los titulos virales son muy bajos (Alonso et al., 1999). Debido a esto, la tecnica puede ser utilizada para la amplificacion y posterior secuenciacion de un segmento del genoma del IPNV directamente desde muestras de tejidos de peces, sin la necesidad de realizar el aislamiento en cultivo celular de los virus, acortando considerablemente el tiempo para su genotipificacion.

El objetivo de este trabajo es realizar la genotipificacion de virus IPN, directamente a partir de muestras de organos de salmonidos, para determinar la predominancia de cada uno de los genogrupos identificados y establecer si existe una relacion hospedadorespecifica entre estos genogrupos y las especies de salmonidos cultivados en Chile.

Para esto, se tomaron muestras de organos (rinon y bazo) de peces salmonidos de las tres especies cultivadas en el pais y se fijaron en etanol al 95%. Las muestras fueron colectadas entre noviembre 2009 y agosto 2015, en 19 localidades diferentes, tanto de centros de agua dulce como de mar, y corresponden a mortalidad fresca (codigo CUP) o de centros en los cuales previamente se registro mortalidad por IPN. Muestras con el mismo codigo fueron colectadas en el mismo centro o piscicultura (Tabla 1).

En el laboratorio, los organos fijados fueron homogeneizados con un mortero en PBS tampon 1X, pH 7,2 y centrifugados a 2.000 g por 15 min a 4[degrees]C en una centrifuga MIKRO 22R (Hettich zentrifugen). Posteriormente, se extrajo el sobrenadante para luego ser almacenado a -20[degrees]C hasta el momento de su analisis.

La extraccion del ARN viral se realizo directamente desde el homogeneizado de tejido. Se tomo un total de 720 [micro]L del homogeneizado de cada muestra y se extrajo el material genetico utilizando el kit E.Z.N.A.[TM] Total RNA Kit I (OMEGA bio-tek) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentracion y pureza del ARN total extraido fue determinada mediante la medicion de absorbancia a 260 y 280 nm usando el espectrofotometro MaestroNano[R] (Maestrogen). Las muestras cuya concentracion fue >10 ng ARN total [micro][L.sup.-1] fueron diluidas en proporcion de 1:10, mientras que las que presentaron una concentracion >100 ng de ARN total [micro][L.sup.-1] fueron diluidas a razon de 1:100.

Una vez obtenido el material genetico se amplifico una region de 1.180 pb del gen de la proteina VP2 mediante la tecnica de RT-PCR utilizando el equipo PCR Multigene (Labnet). Para esto, se mezclaron 3 [micro]L de ARN viral con los partidores A1F (5'-TGaGa TCCATTATGCTTCCAGA-3') y A2R (5'-GACAG GATCATCTTGGCATAGT-3') (Blake et al, 1995) a una concentracion final de 0,5 pM con 10 [micro]L del 2X Master Mix Brilliant III Ultra-Fast SYBR[R] Green qRT-PCR (Stratagene), 0,8 pL de RT/RNAse block y 4,2 [micro]L de agua libre de ARNasas en un volumen total de reaccion de 20 [micro]L. La reaccion se desarrollo en base al siguiente perfil de temperaturas: 42[degrees]C por 30 min para la retrotranscripcion, 95[degrees]C por 3 min para la inactivacion de la retrotranscriptasa y activacion de la polimerasa, 35 ciclos de 95[degrees]C por 30 s para desnaturalizacion, 58[degrees]C por 30 s para hibridacion y 72[degrees]C por 100 s para la elongacion, y la extension final a 72[degrees]C por 10 min.

El producto amplificado fue utilizado como templado para realizar una segunda amplificacion y asi completar el proceso de PCR anidado. Este segundo PCR consistio en amplificar un fragmento de una longitud esperada de 523 pb. Para esto, se mezclaron 1,5 pL del templado con los partidores WB1 (5'-CCGC AACTTACTT GAGAT CCATTAT GC-3') (Williams et al, 1999) y AIR (5'-GTCTCGTCCTCWAGBCG GACGTATG-3') (Tapia et al., 2015) a una concentracion final de 0,5 pM, 15 [micro]L de 2X DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific) y 10,5 pL de agua libre de ARNasas en un volumen total de reaccion de 30 [micro]L. La reaccion se desarrollo en base al siguiente perfil de temperaturas: 95[degrees]C por 5 min para la activacion de la ADN polimerasa Taq, 35 ciclos de 95[degrees]C por 30 s para desnaturalizacion, 60[degrees]C por 30 s para hibridacion y 72[degrees]C por 45 s para la elongacion, y la extension final a 72[degrees]C por 10 min.

El fragmento amplificado resultante del PCR anidado se separo mediante electroforesis en gel de agarosa a una concentracion de 1,2%. Una vez diferenciadas las bandas, estas se cortaron y se transfirieron a tubos de microcentrifuga, para luego ser purificadas usando el kit E.Z.N.A.[TM] Gel Extraction Kit (OMEGA bio-tek) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN obtenido de cada muestra fue eluido con 55 pL de agua grado biologia molecular. Los productos purificados se secuenciaron por duplicado en Macrogen Inc., Corea, usando un analizador de ADN modelo ABI3730XL (Applied Biosystems).

Las secuencias obtenidas se compararon y clasificaron en base a cepas de referencia de birnavirus acuaticos chilenos y extranjeros disponibles en Genbank y reportadas en publicaciones cientificas (i.e., Blake et al., 2001; Eissler et al., 2011; Mutoloki & Evensen, 2011; Calleja et al., 2012; Ruane et al., 2015; Jorquera et al., 2016). Ademas se incluyen algunas muestras utilizadas tambien en el trabajo realizado por Tapia et al. (2015) (ver Tabla 1). El analisis y edicion de las secuencias se realizo con el programa MEGA 6.06 (Tamura et al., 2013), por medio de un alineamiento multiple de secuencias utilizando el algoritmo ClustalW(Thompson et al., 1994). Posteriormente, se construyo un arbol en base a la composicion de los aminoacidos derivados de las secuencias con el metodo de Neighbor-Joining (Saitou & Nei, 1987) usando el modelo de sustitucion distancia p. La validez estadistica de los resultados obtenidos con el arbol, se evaluo mediante el metodo estadistico Bootstrap con 1.000 ciclos de iteraciones.

La tecnica de PCR anidado utilizada permitio confirmar de manera rapida y eficiente la presencia de IPNV en las muestras analizadas, tomando el proceso completo no mas de un dia. Adicionalmente, con el producto obtenido de la segunda ronda de PCR se secuencio un fragmento de la proteina VP2 de 523 pb aproximadamente. Con este fragmento se construyo un arbol filogenetico condensado (Fig. 1), donde se muestran solo los Genogrupos 1 y 5. Es importante recalcar que en este estudio, se trabajo directamente a partir de muestras de tejido infectado de peces y no con aislados virales; por lo que la tecnica permite obtener material genetico para realizar la secuenciacion y posterior genotipificacion de los virus sin tener que realizar el laborioso proceso de cultivo celular e infeccion, que puede tardar mas de dos semanas. Esto fue confirmado en el trabajo de Tapia et al. (2015) donde algunas de las muestras analizadas aqui, fueron tambien aisladas en celulas CHSE-214 y posteriormente amplificadas de forma convencional para su secuenciacion, obteniendo secuencias casi identicas a las obtenidas mediante el PCR anidado. De esta forma, la tecnica del PCR anidado permitio incluso amplificar muestras con material genetico de virus que no pudieron ser aislados en cultivo celular (i.e., CUP, P110, ATS3, PITR2, IPNV03, AYCH, AYCHV, IHJS, MADA, DANN y ADMV). Otros autores han logrado resultados similares a los descritos en este trabajo, Cutrin et al. (2005) por ejemplo, comparo los metodos de aislamiento en cultivo celular, RT-PCR y PCR anidado, para la deteccion de IPNV en muestras de sangre de turbot (Scophthalmus maximus) asintomaticos. Los resultados mostraron, que ambas tecnicas basadas en PCR fueron mas sensibles que el aislamiento en cultivo celular; y ademas la tecnica de PCR anidado logro detectar IPNV en un mayor numero de peces muestreados en comparacion con el RT-PCR.

El analisis filogenetico a nivel de aminoacidos (Fig. 1) muestra que los virus de este estudio se clasifican dentro de los dos genogrupos previamente reportados en el pais, el Genogrupo 1 y 5 (Eissler et al., 2011; Mutoloki & Evensen, 2011; Calleja et al., 2012; Tapia et al., 2015; Jorquera et al., 2016). En la Figura 1 se observan dos subgrupos dentro del Genogrupo 5, el 5A que incluyo los virus reportados para Chile, en este y otros trabajos anteriores y el 5B que agrupo cepas de origen australiano. En el Genogrupo 1 se distinguen a su vez tres subgrupos, uno correspondiente a los genotipos 1-3 del analisis filogenetico mostrado por Blake et al. (2001), otro solamente compuesto por el genotipo 4 y un ultimo compuesto unicamente por los virus chilenos de este estudio y los reportados en trabajos previos. Este subgrupo tambien fue reportado por Tapia et al. (2015), por lo que sugerimos que este cluster sea considerado como un genotipo chileno dentro del Genogrupo 1. La unica excepcion a este subgrupo es la cepa VUV/84, que corresponde a la cepa original aislada en 1984 en Chile y mantenida en cultivo celular desde esa fecha. Esto podria estar asociado a que dentro de una poblacion viral se espera que se genere un sinfin de variantes geneticas en su continua busqueda de eficacia biologica, por lo que la poblacion viral resultante se origina en respuesta adaptativa a esta dinamica (Domingo et al., 2000). Sin embargo, el genoma de la cepa VUV/84, no ha sido sometido a la misma presion selectiva ni ha competido con la actual poblacion de virus chilenos en los procesos de mutacion, por lo que no formaria parte de este cluster. Al analizar en conjunto los datos publicados de todos los virus IPN secuenciados en Chile durante los ultimos anos (Eissler et al., 2011; Mutoloki & Evensen, 2011; Calleja et al., 2012; Tapia et al., 2015; Jorquera et al., 2016), se observa que estan distribuidos en todas las regiones del pais donde hay produccion masiva de salmonidos (i.e., Los Rios, Los Lagos, Aysen y Magallanes), y que existe una predominancia de las cepas clasificadas en el Genogrupo 5 (78,8%) sobre el Genogrupo 1 (21,2%) (Tabla 2). Ademas, el virus infecta a todas las especies de salmonidos cultivadas en el pais, con una mayor incidencia en S. salar, como tambien lo demuestran los informes sanitarios de SERNAPESCA, donde esta especie es la que muestra mayor porcentaje de mortalidad causada por IPN y el mayor numero de diagnosticos de la enfermedad (SERNAPESCA, 2014a).

En la Tabla 2 se observa que, para este trabajo, todos los IPNV chilenos del Genogrupo 1, fueron detectados en trucha arcoiris (O. mykiss) o salmon coho (O. kisutch), mientras que los virus del Genogrupo 5 se encontraron en salmon del Atlantico (S. salar), indicando una posible relacion hospedador-especifica de los genogrupos identificados. Esta relacion, tambien se observo al realizar el analisis de todos los virus secuenciados y reportados en el pais, donde el 100% de los virus clasificados dentro del Genogrupo 1 resulto ser del genero Onchorhynchus y el 97,6% del Genogrupo 5 fue detectado en S. salar (Tabla 2). Sin embargo, esta asociacion no es exclusiva, como se reporta en el trabajo realizado por Callejas et al. (2012), donde virus clasificados como Sp (Genogrupo 5) por la tecnica de RT-PCR en tiempo real fueron detectados en muestras de truchas arcoiris. Asimismo, se han secuenciado aislados provenientes de alevin de trucha arcoiris (Tapia et al., 2015) y salmon coho (Jorquera et al., 2016), que resultaron clasificados dentro del Genogrupo 5. Para probar estadisticamente la asociacion entre los genogrupos, a nivel de genero y especie, se realizo el test de exactitud de Fisher utilizando el sitio web GraphPad QuickCalcs (http://www. graphpad.com/quickcalcs/contingency1/), resultando la relacion en ambos casos como altamente significativa entre las variables (P < 0,001). Este tipo de relacion hospedador-especifica tambien ha sido reportada para otros virus de salmonidos, como el virus de la Necrosis Hematopoyetica Infecciosa (IHNV) en Norteamerica, donde la mayoria de los aislados de los genogrupos denominados U y M, provienen predo-minantemente de salmon rojo (Oncorhynchus nerka) y trucha arcoiris, respectivamente (Garver et al., 2003). Estudios basados en desafios experimentales con ambas especies y genogrupos han mostrado que esta relacion esta asociada a una virulencia especifica para cada hospedador (i.e., mortalidad causada por la infeccion), la cual depende principalmente de la capacidad del virus de entrar en el pez hospedador y de replicarse rapidamente (Penaranda et al., 2009, 2011; Purcell et al., 2009). De igual forma, la relacion hospedado-respecifica encontrada en muestras de campo en este estudio podria ser confirmada mediante el desarrollo de un estudio de infeccion in vivo de ambos genogrupos del virus IPN en salmon del Atlantico y especies del genero Oncorhynchus, para determinar si tambien esta asociada al nivel de virulencia que estos genogrupos puedan presentar en cada especie. La confirmacion de esta relacion hospedador-especifica mediante desafios experimentales puede proveer informacion importante para el manejo y control del IPNV en Chile.

DOI: 10.3856/vol44-issue4-fulltext-23

Received: 29 February 2016; Accepted: 8 July 2016

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen especialmente a los inspectores de SERNAPESCA por su ayuda en la realizacion de los muestreos. Este estudio fue financiado por los siguientes proyectos: Proyecto SERNAPESCA R.E.N[degrees] 1090 "Estudio de evaluacion y estandarizacion de metodos de diagnosticos para la determinacion del Virus de la Necrosis Pancreatica Infecciosa IPNv"; Proyecto DIUV-CID No. 01/03; Proyecto SUBPESCA R.EX No. 1548, codigo 2013-32-17 "Identificacion de cepas y nuevas variantes del Virus IPN y evaluacion del impacto de estas en atencion a su distribucion geografica y caracteristicas de cuadros clinicos", Proyecto "Evaluacion hidrografica y epidemiologica del Fiordo Cupquelan, Region Aysen (Primera Etapa)", Salmones Cupquelan S.A. y Proyecto FIP No. 2014-60: "Determinacion de factores epidemiologicos de riesgo en la presentacion clinica de la enfermedad Necrosis Pancreatica Infecciosa".

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Pamela Torres (1), Yoanna Eissler (1), David Tapia (2), Juan Carlos Espinoza (1) & Juan Kuznar (1)

(1) Centro de Investigacion y Gestion de Recursos Naturales Instituto de Quimica y Bioquimica Facultad de Ciencias Universidad de Valparaiso, Valparaiso, Chile

(2) Doctorado en Acuicultura, Programa Cooperativo Universidad de Chile Universidad Catolica del Norte, Pontificia Universidad Catolica de Valparaiso, Chile

Corresponding author: Yoanna Eissler (yoanna.eissler@uv.cl)

Corresponding editor: Sandra Bravo

Caption: Figura 1. Arbol filogenetico condensado construido en base a las secuencias de aminoacidos deducidas de VP2 mediante el metodo de Neighbor-Joining con un bootstrap de 1000 iteraciones. El grado de cercania entre las secuencias se calculo mediante el metodo de distancia p. Los triangulos negros representan a los virus secuenciados en este trabajo.
Tabla 1. Informacion de las muestras de virus IPN utilizadas en
este estudio. * Virus reportados en el trabajo de Tapia et al. (2015).

Codigo      Fecha      Especie     Estado de      Origen
muestra    muestreo   infectada    desarrollo   ambiental

P1-P10      nov-09     S. salar      Alevin     Agua dulce

CUP44       ago-10     S. salar     Engorda        Mar
CUP24       ago-10
CUP60       oct-10
CUP58       oct-10
CUP68       oct-10
CUP52       oct-10
IHJS1       may-12    O. mykiss      Alevin     Agua dulce
IHJS3       may-12
RV02        nov-12     S. salar      Alevin     Agua dulce

RV06        nov-12
MADA1       nov-12     S. salar      Alevin     Agua dulce
CNJJ1       nov-12     S. salar      Alevin     Agua dulce
CNJJ2       nov-12
CNJJ3       nov-12
ATS3        dic-12     S. salar     Engorda        Mar

DANN3       dic-12     S. salar     Engorda        Mar

KOMA4       dic-12     S. salar      Alevin     Agua dulce

KOMA5       dic-12
KOMA6       dic-12
ADMV1       mar-13    O. mykiss      Smolt         Rio

ADMV2       mar-13
EBPS1       ago-13     S. salar     Engorda        Mar
EBPS2       ago-13
EBPS3       ago-13
MPMA1       ago-13     S. salar     Engorda        Mar
MPMA2       ago-13
CGCP1       nov-13     S. salar     Engorda        Mar
CGCP3       nov-13
CGCP4       nov-13
CGCP5       nov-13
IPNV01.3    ene-14     S. salar      Smolt         Lago
IPNV03.8    feb-14    O. mykiss      Alevin        Rio
IPNV03.9    feb-14
ABCD1       feb-14    O. kisutch    Juvenil        Lago
ABCD3       feb-14
LKJH4       feb-14    O. kisutch    Juvenil        Lago
LKJH6       feb-14
PITR2       mar-14    O. mykiss      Alevin        Rio

AYCH1       abr-14     S. salar     Engorda        Mar
AYCH3       abr-14
AYCH4       abr-14
AYCHV1      abr-14
CHMD1       ago-15     S. salar     Engorda        Mar
CHMD2       ago-15
SFAA1       ago-15     S. salar      Smolt         Mar

SFAA2       ago-15

Codigo            Origen          Numero de
muestra         geografico          acceso

P1-P10           Cochamo           JN163859
                                   JN163860
                                   JN163861
                                   JN163862
                                   JN163863
                                   JN163864
                                   JN163865
                                   JN163866
                                   JN163867
                                   JN163868
CUP44        Fiordo Cupquelan      JN180649
CUP24                              JN180651
CUP60                              JN180653
CUP58                              JN180650
CUP68                              JN180654
CUP52                              JN180652
IHJS1       Cochamo, Rio Patas    KF735904 *
IHJS3                             KF735905 *
RV02           Pta. Arenas/       KF735914 *
               km17,5 Norte
RV06                              KF735916 *
MADA1        Chayahue-Pargua      KF735912 *
CNJJ1        Chayahue-Pargua      KF735897 *
CNJJ2                             KF735898 *
CNJJ3                             KF735899 *
ATS3       Estero de Reloncavi,    KU605637
             Punta Chaparano
DANN3          Isla Tranqui       KF735900 *
               -Pta. Pompon
KOMA4          Rio Pescado,       KF735909 *
               Puerto Varas
KOMA5                             KF735910 *
KOMA6                             KF735911 *
ADMV1          Rio Maullin,       KF735886 *
                Chuyaquen
ADMV2                             KF735887 *
EBPS1           Hualaihue          KU605647
EBPS2                              KU605648
EBPS3                              KU605649
MPMA1       Contao, Hualaihue,     KU605641
MPMA2       Seno de Reloncavi      KU605642
CGCP1          Canal Aysen         KU605643
CGCP3                              KU605644
CGCP4                              KU605645
CGCP5                              KU605646
IPNV01.3       Lago Puyehue        KU605656
IPNV03.8     Sector Vivanco,       KU605657
IPNV03.9        Rio Bueno          KU605658
ABCD1          Lago Rupanco        KU605638
ABCD3                              KU605639
LKJH4          Lago Rupanco        KU605654
LKJH6                              KU605655
PITR2        Rio Pilmaiquen,       KU605640
              Sector La Poza

AYCH1            Isla Luz          KU605650
AYCH3                              KU605651
AYCH4                              KU605652
AYCHV1                             KU605653
CHMD1         Isla Traiguen        KU605661
CHMD2                              KU605662
SFAA1         Rada Potreros        KU605659
                de Cholgo
SFAA2                              KU605660

Tabla 2. Informacion IPNV chilenos secuenciados. ( ) Numero de
IPNV secuenciados, NR no reportado. * Sin considerar virus incluidos
en Tapia et al. (2015). ** Sin considerar virus incluidos en Tapia
et al. (2015) y Jorquera et al. (2016).

Referencia       Region

                                       Origen

Mutoloki &       Los Lagos           Agua dulce
  Evensen
  (2011)
Eissler et       Araucania, Los      Agua dulce
  al. (2011)       Rios, Los Lagos
Calleja et       NR                  Agua dulce
  al. (2012)
Tapia et         Araucania, Los      Agua dulce
  al. (2015)       Lagos, Aysen,       y mar
                   Magallanes
Jorquera et      Los Rios, Los       Agua dulce
  al. (2016) *     Lagos, Aysen,       y mar
                   Magallanes

Este             Los Rios, Los       Agua dulce
  estudio **       Lagos, Aysen,       y mar
                   Magallanes

Total            Coquimbo,           Agua dulce
                   Araucania, Los      y mar
                   Lagos, Aysen,
                   Magallanes

Referencia       IPNV Genogrupo 5        IPNV Genogrupo 1

                 No.      Especies       No.   Especies
                         hospederas            hospederas

Mutoloki &       10       S. salar       --    --
  Evensen
  (2011)
Eissler et        2       S. salar        3    O. mykiss (2)
  al. (2011)                                   O. kisutch (1)
Calleja et        6       S. salar        1    O. kisutch
  al. (2012)
Tapia et         24     S. salar (23)     5    O. mykiss
  al. (2015)            O. mykiss (1)

Jorquera et      11     S. salar (10)     8    O. mykiss (1)
  al. (2016) *         O. kisutch (1)          O. kisutch (7)

Este             29       S. salar        5    O. mykiss (3)
  estudio **                                   O. kisutch (2)

Total            82     S. salar (80)     2    O. mykiss (11)
                        O. mykiss (1)     2    O. kisutch (11)
                       O. kisutch (1)

Referencia       Numero de acceso

Mutoloki &       HQ457169-HQ457178
  Evensen
  (2011)
Eissler et       HQ738515- HQ738519
  al. (2011)
Calleja et       JN642215-JN642221
  al. (2012)
Tapia et         KF954910-KF954930/
  al. (2015)     KF735886-KF735900/
                 KF735903-KF735916
Jorquera et      KU609568-KU609576/
  al. (2016) *   KU609580-KU609581/
                 KU609583-KU609587/
                 KU609589-KU609591/
                 KU609594-KU609602/
                 KU609606-KU609607/
                 KU609609-KU609613/
                 KU609615-KU609617
Este             JN163859-JN163868/
  estudio **     JN180649-JN180654/
                 KU605637/ KU60563
                 -KU605640/
                 KU605642/
                 KU605644-KU605645/
                 KU605649-KU605654/
                 KU605657-KU605662
Total
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Title Annotation:Short Communication
Author:Torres, Pamela; Eissler, Yoanna; Tapia, David; Espinoza, Juan Carlos; Kuznar, Juan
Publication:Latin American Journal of Aquatic Research
Date:Sep 1, 2016
Words:4864
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