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Genotyping and biochemical profile of Xanthomonas albilineans isolates in Venezuela/Genotipificacion y perfil bioquimico de aislados de Xanthomonas albilineans en Venezuela/Genotipificacao e perfil bioquimico de isolados de Xanthomonas albilineans na Venezuela.

La cana de azucar (Saccharum spp.) es un cultivo de gran importancia economica en varias regiones tropicales y subtropicales alrededor del mundo, debido a su alta acumulacion de sacarosa, la eficiencia en produccion de biomasa y sus ventajas para la produccion de biocombustibles como el etanol. Las enfermedades de la cana de azucar constituyen uno de los principales factores negativos para la produccion azucarera mundial y, entre ellas, la escaldadura foliar, causada por Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson, es una de las enfermedades de mayor importancia en el cultivo, por sus efectos sobre los rendimientos agricolas, la calidad de los jugos y las elevadas perdidas que ocasiona en su fase aguda, estimadas entre el 90-100% (Ricaud y Ryan, 1989; Hoy y Grisham, 1994, Jimenez y Contreras, 2008, Zardon et al., 2012). En Venezuela, esta enfermedad fue detectada en 1968, en un material proveniente de la Estacion Experimental de Barbados (Ordosgoitti et al., 1976).

El Genero Xanthomonas comprende 24 especies patogenas de plantas, incluyendo Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson (Tampakaki et al., 2009). X. albilineans es un bacilo Gram negativo, aerobico, con un flagelo polar que le confiere motilidad y propulsion para encontrar un ambiente optimo y esquivar moleculas toxicas (Pieretti et al., 2012).

Bajo condiciones naturales, esta bacteria solo ataca la cana de azucar; sin embargo, se le ha encontrado afectando a malezas gramineas propias de este cultivo. Se ha demostrado ademas su transmision de una planta a otra por contacto de los exudados de las raices y a traves del agua del suelo, aunque al parecer la bacteria es incapaz de sobrevivir en el suelo por largos periodos de tiempo (Martin et al., 2000).

La escaldadura foliar se manifiesta en dos fases diferenciadas, la cronica y la aguda, pero muy frecuentemente se presentan fases particulares de latencia y eclipse por largos periodos de tiempo. La forma cronica se caracteriza por la presencia de lineas paralelas a las nervaduras en las hojas; lineas que son inicialmente estrechas pero se extienden gradualmente a lo largo del limbo. Cuando la enfermedad se agudiza, las lineas se ensanchan y el follaje entero puede clorotizarse, tomando una coloracion blancuzca. Muchas plantas infectadas no presentan sintomas, o solamente algunas lineas blancas foliares, durante un largo periodo, lo cual se conoce como fase de latencia, la que prevalece en la mayoria de las variedades comerciales que presentan tolerancia, por lo que conviven con el patogeno por anos sin manifestar sintomas externos. Al mismo tiempo puede desarrollarse otra fase, llamada fase de eclipse, donde aparecen y desaparecen lineas blancas foliares que dejan de ser visibles despues de la senescencia y la muerte de las hojas mas viejas, mientras que las hojas nuevas ya no presentan ningun sintoma. Asi, una planta puede ser senalada enferma o sana segun el momento de la inspeccion fitosanitaria (Ricaud y Ryan, 1989; Rott, 1995). La existencia de las fases de latencia y de eclipse dificulta notablemente el diagnostico de la enfermedad, por lo que el desarrollo de metodos de identificacion de la bacteria causante es de gran importancia.

El diagnostico de una enfermedad incluye tanto el reconocimiento de la misma como la identificacion de su agente causal. En el pasado, la identificacion de bacterias se basaba principalmente en la determinacion de las propiedades de patogenicidad (por ejemplo: rango de huespedes) y las caracteristicas bioquimicas del patogeno. Las practicas actuales implican procedimientos polifasicos, incluyendo tecnicas moleculares, entre las que destaca el uso de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) por su facilidad, exactitud e independencia de las condiciones ambientales (Tampakaki et al., 2009).

El genero Xanthomonas se ha distinguido por su diversidad fitopatogenica y su contrastante uniformidad fenotipica (Dye, 1962; Van den Mooter y Swings, 1990; Yang et al., 1993). Los estudios relacionados con su taxonomia se han basado en metodos tradicionales como los bioquimicos y fisiologicos, pruebas de patogenicidad y mas recientemente los metodos moleculares (Graham et al., 1990; Van den Mooter y Swings, 1990; Palleroni y Bradbury, 1993; Yang et al., 1993; Jansen et al., 1996; Alvez et al., 2011; Arriola et al., 2015). Vauterin et al. (1995) elaboraron una matriz de homologia determinada por hibridacion del ADN, logrando la diferenciacion de 20 grupos, considerados como especies genomicas del genero Xanthomonas, entre las cuales se mantuvo X. albilineans como una especie bien diferenciada del resto. Algunos autores han reportado caracteristicas bioquimicas y fisiologicas del patogeno, tales como la morfologia de las celulas, la utilizacion de carbohidratos, la hidrolisis de macromoleculas y las proteinas totales de la pared celular, que pueden diferir de los patrones descritos (Yang et al., 1993; Davis et al., 1997; Lopes et al., 2001; Silva et al., 2005). Simoes et al. (2007) desarrollaron un protocolo de diferenciacion de especies de Xanthomonas por PCR-RFLP corroborando que X. albilineans permanece como una especie distintiva del resto, gracias a la comparacion de genes involucrados en la patogenicidad.

Para poder entender la epidemiologia de la escaldadura foliar de la cana de azucar y comenzar a conocer la procedencia de las cepas de la bacteria X. albilineans introducidas en Venezuela, en este trabajo se realiza un analisis de variabilidad genetica bacteriana mediante genotipificacion con la tecnica REP-PCR, que amplifica secuencias repetitivas en el genoma bacteriano. Estos estudios generalmente estan basados en las caracteristicas del genoma de las enterobacterias, el cual contiene diversos tipos de secuencias cortas repetidas y esparcidas. Dos de estas secuencias se aplicaron en este trabajo, llamadas ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus) y secuencias REP (repetitive extragenic palindromic), las que han sido usadas ampliamente en tipificacion, analisis genetico e identificacion de brotes infecciosos bacterianos (Rademarker et al., 1997, Vilchez y Alonso, 2009). Estos analisis estan basados en la amplificacion de las secuencias de ADN a traves de la PCR, usando iniciadores especificos para cada tipo de secuencia. El polimorfismo detectado resulta de la variabilidad en la repeticion de dichas secuencias y de la distancia entre copias contiguas causadas por inserciones o delecciones del ADN. Usando estas secuencias ha sido posible discriminar serotipos estrechamente relacionados de la misma especie y grupos de cepas relacionadas clonalmente, ya que poseen un gran poder discriminatorio (Versalovic et al., 1991).

Con el proposito de disponer de herramientas para diagnosticar la escaldadura foliar de la cana de azucar a tiempo y evitar perdidas de gran magnitud, en este trabajo se realizo la identificacion y caracterizacion de diversos aislados venezolanos de X. albilineans a traves de pruebas morfologicas, bioquimicas y moleculares.

Metodologia

Material vegetal

Se realizaron aislamientos para obtener cultivos puros de Xanthomonas albilineans a partir de plantas de las variedades venezolanas de cana de azucar V756, V781 y V99245 con sintomas de escaldadura foliar, procedentes de las localidades de Chivacoa y Yaritagua, Yaracuy, Venezuela.

Medios de cultivo para el aislamiento, purificacion y preservacion de la bacteria

Se utilizo el medio D5 selectivo para el genero Xanthomonas, compuesto por (g x [l.sup.-1]) celobiosa (10), [K.sub.2]HP[O.sub.4] (3), Na[H.sub.2]P[O.sub.4] (1), MgS[O.sub.4] x 7[H.sub.2]O (0,3) y N[H.sub.4]Cl (1) (Kado y Heskett, 1970); y el medio YSP, el cual es recomendado para la preservacion de X. albilineans y esta compuesto por (g x [l.sup.-1]) extracto de levadura (5), sacarosa (20), peptona (10) (Schaad et al., 2001). Para solidificar estos medios se anadio agar 15g x [l.sup.-1].

Aislamiento de X. albilineans

A partir de tejido foliar con sintomas de escaldadura foliar, se realizaron cortes y se desinfectaron con NaOCl al 2% durante 2min, se enjuagaron con agua destilada esteril y se maceraron con 3ml de agua destilada esteril. Se inoculo 0,1ml del macerado en caldo D5 durante 3 dias, luego se sembro este caldo en agar D5 por agotamiento (tomado y modificado de Jimenez et al., 2004).

Para todas las pruebas se empleo como control positivo una cepa de Xanthomonas albilineans donada por Cenicana, Cali, Colombia y las cepas X. campestris (CVCM 2063), Erwinia nigrifluens (CVCM 2000) y Escherichia coli (CVCM 2038), donadas por el Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos (CVCM), Instituto de Biologia Experimental, Universidad Central de Venezuela.

Pruebas morfologicas

Una vez obtenidos los cultivos puros y las colonias aisladas se procedio a la observacion de sus caracteristicas en los medios de cultivo solidos. Se observaron la elevacion, borde, tamano y color de las colonias, y produccion de exopolisacaridos, entre otras caracteristicas que permiten a simple vista separar estos microorganismos (Diaz y Ferran, 2003).

Se realizaron frotis de los distintos aislados obtenidos de las plantas enfermas, los cuales se sometieron a tincion de Gram y tincion con Rojo Congo.

Pruebas bioquimicas

Los aislados que resultaron ser bacilos Gram negativos se sometieron a las pruebas de actividad de catalasa y de oxidasa, fermentacion de glucosa y de lactosa, hidrolisis de almidon y de esculina, licuefaccion de gelatina, y produccion de mucosidad (Schaad et al., 2001).

Pruebas moleculares

Los aislados se cultivaron en 5ml de caldo YSP con 10% de glicerol, durante 24h a 27[degrees]C, para luego extraer el ADN total, centrifugando las celulas a 13000g durante 5min. El sedimento se resuspendio en 200 [micro]l de solucion Tris 0,1M y se le anadieron 200[micro]l de solucion de lisis (NaOH 0,2N y 1% SDS) a la que se adicionaron 100[micro]l de proteinasa K (1mg x [ml.sup.-1]). Esta mezcla se incubo durante 1h a 55[degrees]C. Transcurrido este tiempo se anadieron 700[micro]l de fenol/ cloroformo/alcohol isoamilico (25:24:1), se homogenizo y centrifugo durante 10min a 13000g. Luego de esta centrifugacion se observaron tres fases y se tomo la fase acuosa. Posteriormente a la fase acuosa se le anadio 700[micro]l de EtOH frio al 95% y se centrifugo a 13000g durante 5min. Luego se lavo con EtOH al 70% y se centrifugo a 13000g durante 5min. Finalmente se descarto el sobrenadante y el precipitado de ADN se seco y se resuspendio en 50[micro]l de agua destilada esteril (modificado de Gomes et al., 2000). La evaluacion de la concentracion y pureza del ADN se realizo en un espectrofotometro Genesys 10 Bio, usando la relacion 260/280 D.O. (Sambrook y Russell, 2001). Para corroborar la calidad del ADN extraido se realizo una electroforesis en gel de agarosa 0,8%, mientras que para la visualizacion de los productos de PCR se realizaron electroforesis en geles de agarosa 1,2%. Todos los geles se sometieron a tincion con bromuro de etidio y observacion en GelDoc (BioRad).

Todas las PCR se realizaron en un volumen final de 25[micro]l que contenian 1X amortiguador de reaccion, 2mM Mg[Cl.sub.2], 0,2mM dNTP's, 2[micro]M iniciadores, 10ng ADN de la muestra bacteriana y con respecto a la Taq Polimerasa, se emplearon 0,625 U para las PCR con iniciadores especificos y 1 U para las ERIC-PCR y REP-PCR.

Para corroborar la naturaleza procariota de los aislados y evaluar la calidad y cantidad adecuada de ADN para las pruebas de diagnostico y genotipificacion, se realizo la amplificacion de la region del ARN ribosomal 16S con los iniciadores universales U1: 5'-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3' y U2: 5'ATC GG(C/T) TAC CTT GTT ACG ACT TC-3' (Lu et al., 2000), esperandose productos de 996 pb y de 100 pb.

Para la identificacion molecular de X. albilineans se realizo la amplificacion con iniciadores especificos PGBL1: 5'-CTT TGG GTC TGT AGC TCA GG-3' y PGBL2: 5'-GCC TCA AGG TCA TAT TCA GC-3' (Pan et al., 1999), donde se esperaba un fragmento de 288 pb.

Para la genotipificacion, se realizo una amplificacion con iniciadores que hibridan con regiones repetidas dispersas en el genoma bacteriano, ERIC1: 5'-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3' y ERIC2: 5'-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3', ademas de REP1: 5'-GCG CCG ICA TGC GGC ATT-3'. Se siguieron las condiciones de amplificacion reportadas por Lopes et al., (2001). El analisis de las amplificaciones ERIC y REP permitio la elaboracion de una matriz de similitud basada en el numero y ubicacion de las bandas y la generacion de un dendrograma de distancias geneticas mediante el software Bionumerics 5.0 (Applied Maths, Kortrijk, Belgica).

Resultados

A partir del macerado de las hojas de las variedades venezolanas de cana de azucar se realizaron cultivos y se obtuvieron 30 aislados que presentaron pigmentacion amarilla, bordes enteros y superficie convexa. De estos 30 aislados, cinco se obtuvieron de la variedad V99245, 9 aislados de V756 y 16 aislados de V781; los cuales se sometieron a las diversas pruebas morfologicas, bioquimicas y moleculares contempladas en este estudio, para la identificacion de X. albilineans.

La primera prueba que se llevo cabo fue la tincion de Gram, encontrandose ocho bacilos Gram negativos y el resto (22) eran bacilos Gram positivos, cocos Gram positivos, levaduras u hongos filamentosos. Al someter los ocho bacilos Gram negativos a tincion con Rojo Congo se corroboro su morfologia de baston. Las colonias correspondientes a estos bacilos Gram negativos se purificaron, se sometieron a las pruebas bioquimicas y se les asigno un numero de serie (LMV02 a LMV09). El aislado LMV02 provino de la variedad V99245 de la localidad de Yaritagua ubicada en el municipio Pena y el aislado LMV08 provino de la variedad V756 colectada en la localidad de Chivacoa ubicada en el municipio Bruzual. Estas dos localidades del estado Yaracuy estan separadas (~30km) por los municipios Jose Antonio Paez y Urachiche. Los aislados LMV03, LMV04 y LMV05 fueron obtenidos de plantas de la variedad V781 de Chivacoa, asi mismo los aislados LMV07 y LMV09 fueron obtenidos de plantas de la variedad V756 de Chivacoa, mientras que el aislado LMV06 se obtuvo de la variedad V99245 de Yaritagua.

Tanto el aislado LMV02 como el aislado LMV08 presentan actividad de la enzima catalasa para protegerse frente al peroxido de hidrogeno, no tienen como aceptor final de electrones la enzima citocromo C oxidasa y son no fermentadores, ya que luego del crecimiento en medio Kligler no se observo acidificacion del mismo; es decir, no fermentan glucosa ni lactosa e hidrolizan la esculina, caracteristicas clave en el perfil bioquimico de X. albilineans. Estos dos aislados son microorganismos que forman colonias con pigmentacion amarillo claro, bordes enteros, superficie convexa y mucosidad en YDC, mientras que el resto de los aislados mostraron distintas tonalidades del pigmento amarillo y no presentaron mucosidad en YDC.

En cuanto a la fermentacion de azucares en medio Kligler, el aislado LMV07 acidifico por completo el tubo, mientras los aislados LMV03, LMV05 y LMV06 solo acidificaron el bisel, lo que implica que solo fermentan lactosa; los aislados LMV04 y LMV09 son no fermentadores. Por su parte, los aislados LMV04 y LMV06 presentan actividad oxidasa. El aislado LMV09 presento un perfil bioquimico similar a la cepa control; sin embargo, el tiempo de crecimiento en agar D5, la mucosidad de las colonias en agar YDC y la tonalidad del pigmento amarillo difieren de la cepa control. El aislado LMV04 tambien hidroliza la esculina; sin embargo, no presenta coincidencia con la cepa control en las otras pruebas. Ninguno de los ocho aislados en estudio hidrolizan la gelatina ni el almidon, caracteristicas tambien tipicas del genero Xanthomonas. Otro resultado con gran poder discriminatorio fue que los aislados LMV02 y LMV08 presentaron un crecimiento entre 48 y 72h en agar D5, mientras el resto de los aislados crecieron entre 24 y 48h.

Con el metodo de extraccion de ADN empleado, se obtuvo un extracto de alta pureza que permitio la amplificacion de la banda de 996 pb (Figura 1a), esperada con los iniciadores universales. Al usar los iniciadores especificos PGBL (Pan et al., 1999), se encontro la amplificacion de la banda de 288 pb (Figura 1b), esperada para X. albilineans en los aislados LMV02 y LMV08, ademas de otras bandas de distintos pesos moleculares tanto en estos dos aislados como en los demas aislados y en las cepas que sirvieron como controles.

Al realizar la PCR con los iniciadores ERIC y REP, los patrones muestran entre 20 y 25 bandas con tamanos que van desde 100 pb hasta ~12000 pb. Los aislados LMV03, LMV04, LMV05, LMV06, LMV07 y LMV09 presentaron un patron de bandas similar, mientras los aislados LMV02 y LMV08, y los controles, cada uno presento un patron de bandas distinto (Figuras 2 y 3).

El analisis con el software Bionumerics 5.0, luego de un proceso de normalizacion de los datos y comparacion con un marcador de tamano molecular, genero dendrogramas que muestran las distancias geneticas entre estos microorganismos y los posibles grupos genicos. Se llevo a cabo un analisis basado en lo reportado por Lopes et al. (2001) donde encontramos que los aislados analizados (LMV02 a LMV09) se pueden organizar segun los resultados ERIC-PCR en cinco grupos geneticos, a saber, A: LMV03. LMV04, LMV05, LMV06, LMV07 y LMV09; B: LMV02 y LMV08; C: X. albilineans CC y E. coli CVCM 2038; D: X. campestris CVCM 206; y E: E. nigrifluens CVCM 2000. Con los resultados de REP-PCR tambien se organizan en cinco grupos geneticos, A: LMV03. LMV04, LMV05, LMV06, LMV07 y LMV09; B: E. nigrifluens CVCM 2000 y E. coli CVCM 2038; C: LMV02; D: LMV08; y Grupo E: X. albilineans CCy X. campestris CVCM 2063.

Con ambas tecnicas se observo que los aislados LMV03. LMV04, LMV05, LMV06, LMV07 y LMV09, son clonalmente identicos, ya que en ambos analisis (ERIC y REP) el porcentaje de similitud, segun la matriz generada por el software esta entre 80 y 100% (grupo A en ambos casos).

Con respecto a X. campestris, la similitud con X. albilineans esta entre 20 y 40% con ERIC (grupos C y D), mientras que con REP esta entre 40 y 60% (grupo E). Esto es de esperarse, ya que pertenecen al mismo genero bacteriano. De la misma forma se relaciona X. campestris con los aislados LMV02 y LMV08, mediante ERIC, compartiendo de 20 a 40% de similitud con LMV02 y de 40 a 60% de similitud con LMV08 (grupos B y D). Sin embargo, con REP la relacion entre X. campestris con LMV02 y con LMV08 esta entre 10 y 30% en ambos casos (grupo E con grupos C y D).

Finalmente, la relacion entre los aislados LMV02 y LMV08 identificados en este estudio como X. albilineans, es de 60% con ERIC-PCR y 40% con REP-PCR. Por otra parte, comparten 50 y 30% de similitud respectivamente mediante el analisis con el marcador ERIC (grupos B y C) y 15% mediante el analisis con el marcador REP (grupos C y D con E), con respecto a la cepa control X. albilineans de Cenicana, Colombia.

Discusion

Los aislados LMV02 y LMV08 crecidos en los medios D5 y YSP mostraron diferencias en la velocidad de crecimiento y las caracteristicas morfologicas, tales como variacion en la intensidad del pigmento amarillo y mucosidad de las colonias. Este resultado corrobora lo reportado por Birch (2001) y por Silva et al. (2005) con respecto a la gran variabilidad genetica incluso a nivel de especie, como una caracteristica importante del genero Xanthomonas.

Una vez realizada la tincion Gram, las pruebas basicas que permiten diferenciar X. albilineans del resto de las bacterias pertenecientes al genero son actividad catalasa, actividad oxidasa, utilizacion de lactosa y glucosa e hidrolisis de esculina. Los resultados obtenidos con estas pruebas permitieron separar los aislados LMV02 y LMV08 del resto de los aislados e identificarlos tentativamente como X. albilineans, basandonos en la similitud del perfil bioquimico con el de la cepa control donada por Cenicana.

De manera similar, el analisis morfologico y bioquimico realizado a los aislados LMV03, LMV04, LMV05, LMV06, LMV07 y LMV09 permitio separarlos, ya que difieren en la mayoria de las pruebas con respecto a la cepa control de X. albilineans, y por lo tanto no se puede considerar que pertenezcan a esta especie, aunque pueden ser miembros del genero Xanthomonas.

Aunque los metodos bioquimicos siguen siendo herramientas esenciales al momento de identificar un microorganismo, el rapido avance de la tecnologia y la alta sensibilidad de las pruebas basadas en el ADN estan desplazando a la mayoria de las pruebas bioquimicas (Alvarez, 2004). En este sentido se realizo la identificacion de los aislados mediante PCR con iniciadores especificos y se comprobo su variabilidad genetica mediante ERIC y REP-PCR.

La tecnica molecular mas empleada para la caracterizacion, identificacion y diagnostico de patogenos de animales y plantas es la PCR. Para llevar a cabo esta tecnica con exito es menester obtener un material genetico libre de contaminantes proteicos y mantenerlo estable para evitar su degradacion. Es por ello que en este estudio se extrajo el ADN de los aislados bacterianos por el metodo de Gomes et al. (2000), el cual fue reportado por Alvez et al. (2011) como el metodo mas eficiente, con el cual se obtiene un material genetico de calidad y con una pureza que permite llevar a cabo los analisis por PCR.

Una de las aproximaciones mas empleada para identificacion y diagnostico de procariotas es la amplificacion por PCR del gen del ARN ribosomal 16S. Dicho gen esta muy conservado, ya que codifica para la subunidad menor de los ribosomas, lo que permite comprobar la calidad del ADN extraido y verificar que se trata de material genetico de procariotas (Figura 1a). Con este resultado es posible asegurar ademas que los extractos de ADN no contienen inhibidores de la reaccion de PCR y se puede proceder a la identificacion con iniciadores especificos y a la genotipificacion con ERIC y REP.

Los iniciadores PGBL utilizados por Pan et al. (1999) para la identificacion especifica de X. albilineans generan un fragmento especifico de 288 pb. Estos iniciadores fueron disenados a partir del clonaje y secuenciacion del fragmento de 360 pb, especifico para X. albilineans, generado por los iniciadores ALA4 y L1 (Pan et al.., 1997). La Figura 1b muestra la banda de 288 pb para la cepa control de X. albilineans, asi como para los aislados LMV02 y LMV08, observandose ademas la amplificacion de bandas de diversos tamanos tanto para los otros aislados de plantas enfermas como para los controles.

Alvez et al. (2011) emplearon los iniciadores ALA4 y L1 (Pan et al., 1997) y obtuvieron el fragmento especifico de 360 pb; sin embargo, se observaron diversos productos amplificados de forma inespecifica, resultado similar a lo reportado por Arriola et al. (2015). Con respecto al iniciador ALA4, su secuencia se encuentra dentro de la region espaciadora entre los tRNAs, por lo que generaria productos de PCR unicos para esta bacteria, mientras que el iniciador L1 presenta una secuencia que es la mas conservada del gen 23S, seguida por la secuencia del espaciador. Tal secuencia se obtuvo por la compilacion de cinco secuencias del gen 23S de bacterias fitopatogenas y de cuatro secuencias de cloroplastos de plantas. Pan et al.. (1997) plantearon el uso combinado de los iniciadores ALA4 y L1, estrategia que permitio observar un patron caracteristico para la identificacion de X. albilineans, al amplificar una banda de 360 pb especifica para esta bacteria, en conjunto con fragmentos de diferentes tamanos. Observando los inconvenientes generados por los iniciadores ALA4 y L1 debido al polimorfismo encontrado entre las mismas cepas de X. albilineans, estos mismos autores (Pan et al., 1999) disenan a partir del clonaje y secuenciacion del fragmento de 360 pb especifico para X. albilineans, los iniciadores PGBL1 y PGBL2. A pesar de las amplificaciones inespecificas generadas por los iniciadores ALA4 y L1, debido a su caracter universal, el producto de 360 pb indica que se trata de X. albilineans (Arriola et al., 2015). Asi mismo en la presente investigacion, las pocas amplificaciones inespecificas encontradas en algunos de los aislados nos permiten asegurar que los aislados LMV02 y LMV08 pertenecen a la especie X. albilineans, ya que estos amplificaron el fragmento especifico de 288 pb con los iniciadores PGBL1 y PGBL2, igual a la cepa control, y no presentaron amplificaciones inespecificas.

Para estudiar la variabilidad genetica de los aislados LMV02 y LMV08, asi como del resto de los aislados y cepas control, se realizaron los analisis ERIC y REP-PCR. Estos analisis estan basados en la amplificacion por PCR de secuencias repetidas y han facilitado la tipificacion de diversos microorganismos, al reducir los costos y el tiempo de los analisis. La familia de las secuencias cortas repetidas intergenicas ha sido encontrada en bacterias entericas como Escherichia coli y Salmonella typhimurium. Estas secuencias se encuentran dispersas en el genoma, y hoy dia se sabe que estan en diversas especies bacterianas. Tres familias, no relacionadas a nivel de secuencia de ADN, han sido estudiadas en mas detalle; la secuencia llamada 'palindromica extragenica repetitiva' de 35 a 40 pb (REP), la secuencia de 124 a 127 pb, llamada 'consenso repetitivo intergenico enterobacterial' (ERIC) y la llamada 'elemento BOX', de 154 pb. Estas secuencias tienen el potencial para formar las estructuras conocidas como stem-loop ('tallo-vuelta') y pueden jugar un papel importante en la organizacion del genoma bacteriano. Existe la hipotesis (Rincones, 2009) que si el patogeno tiene una unica distribucion o arreglo de secuencias repetitivas a lo largo del genoma, entonces se pueden generar huellas digitales del genoma que lo ponen en correlacion con un linaje especifico.

En el presente trabajo, mediante la utilizacion de los marcadores ERIC y REP se generaron patrones de bandas definidas y reproducibles, y la mayoria de los aislados analizados fueron polimorficos, ya que no compartian el mismo perfil genetico. Esto permitio evaluar la relacion entre los aislados obtenidos y otros aislados obtenidos en los trabajos de Lopes et al. (2001) y de Silva et al. (2005). Asi, los aislados LMV02 y LMV08 presentan similitud con los aislados Ad/49037 y Xa/CTC de Brasil, evaluados en el trabajo de Lopes et al. (2001), ya que coinciden algunas bandas. Sin embargo, estos aislados no presentan el mismo patron de bandas en los analisis ERIC y REP. Mediante ERIC estan relacionados entre si en ~50%, mientras que con la cepa control de X. albilineans aislada en Colombia, el LMV02 aislado de la variedad de cana de azucar V99245 de Yaritagua, Yaracuy, tiene una relacion de 50% y el LMV08 aislado de la variedad de cana de azucar V756 de Chivacoa, Yaracuy, tiene una relacion de 30% (Figura 2). Por otro lado, mediante el analisis REP, los aislados LMV02 y LMV08 guardan una relacion entre si de 30%, mientras que con X. albilineans (control) se relacionan en un 15% (Figura 3). Esto es similar a lo observado por Lopes et al. (2001) con los aislados de Brasil, que a pesar de encontrarse en la misma zona geografica tienen una similitud de ~50%, lo cual demuestra la gran variabilidad genetica que presenta X. albilineans y apoya lo reportado por diversos autores (Permaul et al., 1996; Davis et al., 1997; Matos et al., 2003; Huerta et al., 2009). El genero Xanthomonas se caracteriza por tener gran variabilidad genetica, y una de las especies que muestra el mayor grado de variacion es X. albilineans. Esta es una de las razones que explican por que esta bacteria es la que causa mayor enfermedad en cultivos de cana.

Cabe destacar que el aislado LMV02 proviene de la localidad de Yaritagua, ubicada en el municipio Pena, mientras que LMV08 proviene de la localidad de Chivacoa, en el municipio Bruzual, dos localidades del estado Yaracuy separadas por ~30km; por ello, los resultados de las pruebas bioquimicas y moleculares en conjunto con los datos de procedencia, permiten decir que se trata de aislados distintos de la misma especie, los que pudieron llegar al estado Yaracuy por distintas vias, ya sea en el material vegetal o a traves de las herramientas de cultivo.

En el caso de los aislados LMV03, LMV04, LMV05, LMV06, LMV07 y LMV09, que de acuerdo con nuestros resultados no pertenecen a la especie X. albilineans, es posible indicar segun los resultados de la genotipificacion que estan clonalmente relacionados, pudiendo tratarse del mismo microorganismo, el cual se ha diseminado en las plantaciones de cana de azucar, tanto en la localidad de Chivacoa como en la localidad de Yaritagua.

En general, de estos analisis se aprecia un mayor poder discriminatorio del marcador ERIC sobre el marcador REP, ya que la agrupacion generada coincide con los resultados obtenidos con los analisis microbiologicos y con la identificacion mediante PCR con iniciadores especificos. Cuando varios aislados son clasificados como geneticamente similares mediante un metodo de genotipificacion, se puede asumir que estos derivaron recientemente de un ancestro comun, a traves de una cadena de eventos relacionados. Young et al. (2008) realizaron un analisis de hibridacion ADN-ADN con 53 especies de Xanthomonas, que confirmo la alta variabilidad genetica de este genero bacteriano. En estudios similares, Galvis y Carrillo (2015), realizaron una caracterizacion molecular con los marcadores MB1 y BOX-PCR, encontrando variaciones en la estructura del genoma entre aislados de Burkholderia glumae, evidenciando que existen diversos genotipos en las dos zonas de Colombia analizadas, Cucuta y El Zulia. Sin embargo, estos marcadores permitieron la agrupacion de los aislados de acuerdo a su distribucion geografica, observandose que los aislados provenientes de El Zulia se organizaron en grupos, mostrando relacion entre ellos. Bravo et al. (2010), quienes encontraron una alta variabilidad genetica en los aislamientos recolectados en Colombia, observaron que los grupos obtenidos lograron correlacionarse con la procedencia geografica de los mismos. Karki et al. (2012) detectaron variaciones geneticas en aislados de B. glumae empleando los marcadores BOX-PCR y ERIC-PCR, observando una relacion de acuerdo a su procedencia geografica y presencia de pigmentacion.

La REP-PCR es una tecnica util para estudios de variabilidad genetica en aislados de B. thuringiensis provenientes de diversas fuentes, ya que ofrecen multiples ventajas, como lo son la universalidad de los cebadores, la reproducibilidad relativa de resultados, y la sencillez en el procedimiento y equipos requeridos (Katara et al., 2012). En el estudio de Galvis y Moreno (2014) la REPPCR mostro claramente distintos patrones de amplificacion para todas las cepas, con pocas bandas comunes entre algunos aislados y controles; el analisis filogenetico mostro un indice de similaridad bajo (18%), debido posiblemente a la alta variabilidad genetica dentro de este grupo, detectada por este marcador. Lo anterior tambien ha sido reportado por diversos autores, al observar un alto grado de polimorfismos entre diferentes aislados de B. thuringiensis, inclusive en aislados provenientes de un mismo sitio (Katara et al., 2012). En un estudio realizado por Reyes e Ibarra (2005), donde caracterizaron diferentes variedades de B. thuringiensis mediante REP-PCR, obtuvieron una similitud del 12% entre las variedades israelensis y aizawai de B. thuringiensis.

Los estudios epidemiologicos en el caso de bacterias patogenas se enfocan en identificar el posible origen comun de la infeccion, estudiando posibles fuentes y vehiculos de transmision, ademas de monitorear los reservorios de dichos microorganismos. Es necesario contar con metodos altamente confiables, que permitan tipificar y discernir entre aislados y poder senalar a la fuente y a la via responsable de la infeccion en estudio, al analizar la relacion clonal entre ellos (Chalbaud et al., 2012). Esta es la primera vez que en Venezuela se realiza una genotipificacion de aislados de X. albilineans y se identificaron dos cepas de la bacteria en dos localidades distintas del estado Yaracuy, causantes de la escaldadura foliar de la cana de azucar, lo cual es un aporte de importancia para dilucidar la procedencia de las cepas venezolanas y comprender mejor la epidemiologia de la enfermedad. Estas cepas pueden ser usadas en estudios de patogenicidad para discernir entre variedades venezolanas resistentes y susceptibles a la escaldadura foliar de la cana de azucar, asi como estudios de la interaccion X. albilineans-cana de azucar para conocer la expresion genica diferencial de plantas de cana de azucar ante la presencia de la bacteria e identificar genes relacionados con la resistencia a la enfermedad y asi avanzar en el mejoramiento de este importante cultivo. Al reforzar la importancia de implementar estrategias de control fitosanitario en el pais, el presente estudio contribuira al desarrollo de las practicas efectivas para el control de esta enfermedad.

Recibido: 29/10/2014. Modificado: 25/05/2016. Aceptado: 30/05/2016.

AGRADECIMIENTOS

Las autoras agradecen el financiamiento de los proyectos de Grupo CDCH PG03-7327-2008 (Guillermina Alonso) y PEII N[degrees] 2012001357 (Maira Oropeza).

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Beatriz Alvez. Doctora en Ciencias mencion Botanica, Universidad Central de Venezuela (UCV). Profesora-Investigadora, UCV, Venezuela. e-mail: beatriz.alvez@ciens.ucv.ve

Guillermina Alonso. Doctora en Ciencias, mencion Biologia Celular, UCV, Venezuela. ProfesoraInvestigadora, UCV, Venezuela. e-mail: guillermina.alonso@ciens.ucv.ve.

Maira Oropeza. Doctora en Ciencias, mencion Botanica, UCV, Venezuela. ProfesoraInvestigadora, UCV, Venezuela. Direccion: Instituto de Biologia Experimental, Facultad de Ciencias, UCV. Calle Suapure, Colinas de Bello Monte. Caracas, Venezuela. Apartado 47114, Los Chaguaramos, Caracas 1041A, Venezuela. e-mail: maira.oropeza@ciens.ucv.ve.
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Author:Alvez, Beatriz; Alonso, Guillermina; Oropeza, Maira
Publication:Interciencia
Date:Nov 1, 2016
Words:6780
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