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Genetic variability and comparative leaf anatomy of plants of Dioscorea alata maintained under in vitro culture/ Variabilidad genetica y anatomia foliar comparada de plantas de Dioscorea alata mantenidas en cultivo in vitro/ Variabilidade genetica e anatomia foliar comparada de plantas de Dioscorea alata mantidas em cultivo in vitro.

SUMMARY

Genetic variability and foliar anatomy of yam (Dioscorea alata) plants regenerated by in vitro organogenesis and micropropagation, were studied in relationship with a greenhouse mother plant. To estimate the genetic variability through RAPD analysis eight arbitrary primers were used, and the presente and absenee of bands were registered as polymorphisms. The results show a O. 12% of polymorphism for both in vitro organogenesis and micropropagation regenerated plants, implying that both systems are efficient for mass propagation of yam. Leaf tissue cross sections from in vitro and in vivo plants was studied to analyze the epidermis and mesophyll leaf cells. The parameters analyzed showed significant differences between in vitro and in vivo plants, but no differenees were observed when comparing foliar anatomy from in vitro organogenesis and micropropagation derived plantlets. Foliar anatomy of in vitro plantlets did not compromise the aeclimatization of these plants in greenhouse conditions.

VARIABILIDAD GENETICA Y ANATOMIA FOLIAR COMPARADA DE PLANTAS DE Dioscorea alata MANTENIDAS EN CULTIVO IN VITRO

RESUMEN

Se estudio la variabilidad genetica y la anatomia foliar de plantas de name (Dioscorea alata) regeneradas in vitro por sistemas de organogenesis y micropropagacion, en relacion con la planta madre mantenida en condiciones de vivero. Para la determinacion de la variabilidad genetica de las plantas regeneradas, se usaron ocho iniciadores en un analisis RAPD y se registro la presencia o ausencia de bandas como polimorfismos. Los resultados arrojaron un 0,12% de polimorfismo para ambos sistemas de regeneracion, lo que implica que ambos sistemas son eficientes para multiplicar masivamente esta especie. El estudio de la epidermis y mesofilo de las hojas de las plantas procedentes del cultivo in vitro en comparacion con la planta madre, se realizo mediante cortes transversales a mano alzada. La anatomia foliar de las plantas cultivadas in vitro es significativamente diferente a la de la planta madre para las caracteristicas estudiadas; mientras que no se observaron diferencias entre las plantas obtenidas por organogenesis y por micropropagacion. Las diferencias anatomicas observadas no comprometen el exito en la adaptacion de estas vitroplantas a condiciones de vivero.

PALABRAS CLAVE / Anatomia foliar / Dioscorea alata / Cultivo in Vitro / Micropropagacion / Organogenesis / RAPD /

VARIABILIDADE GENETICA E ANATOMIA FOLIAR COMPARADA DE PLANTAS DE Dioscorea alata MANTIDAS EM CULTIVO IN VITRO

RESUMO

Estudou-se a variabilidade genetica e a anatomia foliar de plantas de inhame (Dioscorea alata) regeneradas in vitro por sistemas de organogenese e micro propagacao, em relacao com a planta madre mantida em eondicoes de viveiro. Para a determinacao da variabilidade genetica das plantas regeneradas, se usaram oito iniciadores em uma analise RAPD e se registrou a presenca ou ausencia de bandas como polimorfismos. Os resultados arrojaram um 0,12% de polimorfismo para ambos os sistemas de regeneracao, o que implica que ambos os sistemas sao eficientes para multiplicar massivamente esta especie. O estudo da epiderme e mesofilo das folhas das plantas procedentes do cultivo in vitro em comparacao com a planta madre se realizou mediante cortes transversais a mao livre. A anatomia foliar das plantas cultivadas in vitro e significativamente diferente a da planta madre para as caracteristicas estudadas; enquanto que nao se observaram diferencas entre as plantas obtidas por organogenese e por micro propagacao. As diferencas anatomicas observadas nao comprometem o sucesso na adaptacao destas plantas-in-vitro a condicoes de viveiro.

Introduccion

Dioscorea alata L. (name) es una de las especies mas importantes del genero Dioscorea, dado su valor economico, farmacologico y alimenticio, cultivandose en los tropicos y en las regiones subtropicales y templadas (Royero, 2004). Debido a la importancia de este genero, Royero et al. (2007), establecieron sistemas de regeneracion in vitro para D. alata via micropropagacion (plantas obtenidas a partir de la induccion del desarrollo de yemas axilares) y organogenesis (plantas obtenidas mediante la induccion de brotes neoformados a partir de segmentos de tallo).

Una de las principales consecuencias que puede tener el cultivo de tejidos vegetales, es la variacion genetica que presentan los tejidos al ser sometidos a procesos de des-diferenciacion y rediferenciacion durante el cultivo in vitro, variacion esta que Larkin y Scowcroft (1981) definieron como variacion somaclonal, por lo que un requerimiento importante para que el proceso de regeneracion in vitro sea exitoso es que las plantas regeneradas presenten uniformidad (estabilidad genetica) comparadas con las plantas propagadas convencionalmente (Zhao et al., 2005).

La variacion somaclonal esta relacionada directa o indirectamente con modificaciones del ADN, especificamente hipo e hipermetilacion (Scowcroft et al., 1987, Phillips et al., 1990). Kaeppler y Phillips (1993) observaron que los cambios en los patrones de metilacion del ADN ocurren con una frecuencia lo suficientemente alta como para ser un factor que contribuye a la amplia gama de variaciones geneticas en las plantas regeneradas. Por su parte, Peschke y Phillips (1992) reportaron que el tipo de explante, el tipo y edad de cultivo, y el genotipo tambien son factores que pueden originar la variacion somaclonal.

En relacion a la influencia del tipo de sistema de cultivo in vitro empleado, cuando las plantas son regeneradas por micropropagacion, la variacion genetica generada es minima o nula, seguida por la embriogenesis somatica y la organogenesis, que produce una mayor proporcion de vitroplantas con variaciones geneticas (Yang et al., 1999).

Debido a los efectos que puede tener la variacion somaclonal sobre la calidad de las plantas regeneradas, se han desarrollado numerosas tecnicas para detectarla, siendo las mas eficientes para este proposito aquellas que incluyen la utilizacion de marcadores moleculares.

El RAPD (amplificacion al azar de ADN polimorfico) es una tecnica de deteccion de polimorfismos geneticos, basada en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y desarrollada por Williams et al. (1990). Consiste en la utilizacion de iniciadores oligonucleotidos de diez pares de bases (pb) con secuencias arbitrarias, lo que trae como consecuencia una amplificacion al azar de las secuencias del ADN genomico. Esto produce patrones de bandas polimorficas que se pueden usar como huellas geneticas (Oropeza et al., 1995).

Esta tecnica ha sido usada para la deteccion de variabilidad genetica en plantas de Dioscorea alata (Oropeza et al., 2006), Sacharum sp. (Lal et al., 2008), Centaurea ultreiae (Mallon et al., 2010), Chlorophytum borivilianum (Samantaray y Maiti, 2010), y Jatropha eurcas (Sarkar et al., 2010; Sharma et al. 2011), obtenidas a partir de diferentes sistemas de regeneracion in vitro.

Otra de las consecuencias del cultivo in vitro son las variaciones fenotipicas producto de la adaptacion de la planta al medio ambiente de cultivo. Normalmente un alto porcentaje de plantas cultivadas in vitro se pierden o se danan durante el periodo de aclimatacion, limitando la aplicacion de las tecnicas de micropropagacion, debido en general a desordenes causados por el ambiente de cultivo in vitro, comparado con las condiciones ambientales de los cultivos ex vitro (Pospisilova et al., 1999; Zobayed et al., 2001). Durante el cultivo in vitro las plantas crecen bajo condiciones muy especiales: la humedad es mayor y la irradiacion es menor que en las condiciones de cultivo convencional. El uso de recipientes cerrados para prevenir la contaminacion microbiana disminuye la turbulencia del aire, con lo cual se limita la entrada de C[O.sub.2] y la salida de los productos gaseosos de la planta.

Estas condiciones afectan el desarrollo y caracteristicas de las plantas, entre las que se incluyen un pobre desarrollo de la cuticula y un incorrecto funcionamiento de los estomas, lo cual resulta en una excesiva perdida de agua, una pobre capacidad fotosintetica, y anormalidades anatomicas, morfologicas y fisiologicas (Pospisilova et al., 1999; Zobayed et al., 2001).

En este sentido, Rady y Ali (1999) realizaron la comparacion fisiologica y anatomica de plantulas y regenerantes de Beta vulgaris, encontrando diferencias en ambos aspectos entre las plantas provenientes de diferentes formas de cultivo. De la misma manera, Zobayed et al. (2001) hicieron estudios sobre la anatomia foliar de plantas de Nicotiana tabacum y Brassica oleracea cultivadas in vitro, encontrando que las condiciones de ventilacion afectan la anatomia de las plantas regeneradas.

Mohamed y Alsadon (2010) evaluaron la influencia de la ventilacion y la concentracion de sacarosa (10, 20 y 30g*[l.sup.-1]) en el crecimiento y la anatomia foliar de plantas de papa micropropagadas, reportando que las plantas crecidas en condiciones de ventilacion y 20g*[l.sup.-1] de sacarosa tenian mayor cantidad de clorofila a, mientras que las crecidas en 10g*[l.sup.-1] de sacarosa presentaron mayor cantidad de clorofila b. En cuanto a la densidad de estomas, esta fue significativamente menor en las plantas crecidas bajo condiciones de ventilacion. De la misma manera reportan que las laminas foliares de las plantas crecidas sin ventilacion eran mas delgadas que las crecidas bajo condiciones de ventilacion, ademas de que no mostraban la epidermis, el parenquima en empalizada y el parenquima esponjoso estaban bien definidos.

Con base en lo expuesto, en el presente trabajo se evaluo la variabilidad genetica y la anatomia foliar en plantas de D. alata procedentes del cultivo in vitro (micropropagacion y organogenesis) en comparacion con la planta madre (in vivo), utilizando la tecnica RAPD y anatomia foliar comparada, con el fin de validar estos dos sistemas de regeneracion in vitro.

[FIGURA 1 OMITIR]

Materiales y Metodos

Material vegetal

En este estudio se emplearon plantas de Dioseorea alata en condiciones de vivero (in vivo), asi como regeneradas por micropropagacion o via organogenesis (Figura 1). En el caso de la micropropagacion se usaron plantas de 12 semanas de edad regeneradas mediante el cultivo de microesquejes de lcm de largo con un nudo y 1-2 yemas axilares en medio MM3, el cual contenia sales Murashige y Skoog (1962) suplementado con 2mg*[l.sup.-1] de BA, segun lo reportado por Royero et al. (2007). En el caso de la regeneracion via organogenesis se usaron plantas de 12 semanas regeneradas mediante el cultivo de segmentos de tallo de lcm de largo con 1-2 yemas axilares en medio MO5 el cual contenia sales Murashige y Skoog (1962) suplementado con 0,5mg*[l.sup.-1] de ANA y 1mg*[l.sup.-1] de BA, segun lo reportado por Royero et al. (2007). Todos los cultivos fueron incubados bajo luz fluorescente continua (50[micron]mol*[m.sup.-2][s.sup.-1]), a 25[grados]C y se pasaban a medio fresco cada 6 semanas.

Para el analisis molecular se utilizaron 15 plantas de cada sistema de cultivo in vitro y la planta en condicion de vivero la cual habia sido la donante de los explantes para establecer los sistemas in vitro.

Para el estudio anatomico se utilizaron 25 preparaciones foliares de cinco plantas provenientes de cada sistema de cultivo in vitro, asi como de la planta madre.

Analisis RAPD

La extraccion del ADN se realizo segun el protocolo propuesto por Oropeza et al. (2006), el cual se basa en el metodo de Doyle y Doyle (1990) con las siguientes variaciones: a) un tratamiento con RNAsa 'A' (10mg*[ml.sup.-1]), b) un tratamiento con solucion limpiadora: (etanol 76% en 10mM acetato de amonio (N[H.sub.4]COOH), y c) precipitacion con 7,5M N[H.sub.4]COOH.

La evaluacion del ADN extraido se realizo mediante el uso de un espectrofotometro (Thermo modelo Genesys 10 Bio) y se complemento con la electroforesis en gel de agarosa 0,8% para evaluar su integridad, segun Sambrook et al. (1989). La amplificacion del ADN se rcalizo con ocho iniciadores arbitrarios (Tabla I) segun el protocolo planteado por Ramser et al. (1997), llevandose a cabo en un volumen final de 25[micron]l que contenia buffer de reaccion 10X (50mM KCl, 10mM Tris-HCL, pH 8,8); 2mM Mg[Cl.sub.2]; 0,2mM dNTPs; 10pM de iniciador; 100ng de ADN de Dioscorea alata; y 0,6U de Taq polimerasa por reaccion. Las condiciones de amplificacion se fijaron segun el protocolo planteado por Ramser et al. (1997):

Un primer ciclo de desnaturalizacion por lmin a 94[grados]C (una vez). Un segundo ciclo que consta de tres pasos, un primer paso de desnaturalizacion de 30s a 94[grados]C, un segundo paso de alineacion de 30s a 35[grados]C y un tercer paso de elongacion de 90s a 72[grados]C. Este ciclo se repitio tres veces. Por ultimo un ciclo que se repitio 35 veces, constando de un primer paso de desnaturalizacion de 15s a 94[grados]C, un segundo paso de alineacion de 30s a 35[grados]C y un tercer paso de elongacion de 90s a 72[grados]C.

Las bandas fueron separadas mediante electroforesis en gel de agarosa 1,8% y los geles fueron tenidos con bromuro de etidio. Los geles fueron digitalizados en un GEL-DOC (Biorad).

Anatomia foliar comparada

El estudio comparativo de la anatomia foliar se realizo entre la planta de Dioseorea alata en condiciones de vivero donadora de los explantes, y las regeneradas in vitro por micropropagacion y via organogenesis. Para lograr esto, el estudio se dividio en dos partes, el estudio de la epidermis (tanto adaxial como abaxial) y el estudio del mesofilo.

Epidermis. Se realizaron cortes paradermicos, tanto de la cara adaxial como de la cara abaxial, en los que se evaluaron los patrones de distribucion de los estomas, asi como sus tamanos y sus formas, y la forma de las celulas epidermicas de cada superficie de la hoja. Este estudio se realizo desprendiendo la epidermis de las hojas con ayuda de pinzas de relojero; los tejidos se montaron en portaobjetos, se cubrieron con cubreobjetos y se sellaron con esmalte para unas.

Mesofilo. Se realizaron cortes transversales a mano alzada de las hojas de las plantas, en los que se evaluo la epidermis, el parenquima en empalizada, el parenquima esponjoso y el grosor de la lamina foliar. Para realizar los cortes se utilizaron dos laminas portaobjetos, en el medio de las cuales se coloca la hoja fresca, y manteniendo el por-taobjetos de abajo y la hoja rijos, se desliza poco a poco el portaobjetos superior a medida que se realizan los cortes, utilizando como guia para estos cortes, el borde de la lamina del portaobjetos superior (Luis Hermoso, comunicacion personal).

Tanto las preparaciones de epidermis como las de mesorilo fueron observadas en un microscopio Nikon Labophot-2.

Analisis estadistico

Se realizo una comparacion de las medias aritmeticas de las caracteristicas medidas en cada uno de los grupos experimentales, y se analizaron estadisticamente cmpleando pruebas de analisis de varianza (ANOVA) y la prueba a posteriori de Duncan, ambas con un nivel de significancia de 0,05. Ademas, se realizo un estudio multivariado de componentes principales (ACP), que utilizo las ocho variables estudiadas para cada uno de los tres grupos experimentales. Los analisis se realizaron con el programa STATISTICA Version 7.0.

Resultados

RAPD de plantas regeneradas por micropropagacion

En la Tabla II se resumen los resultados del analisis RAPD para las plantas obtenidas por micropropagacion. Se obtuvo un total de 871 bandas altamente reproducibles con un intervalo de peso molecular de 300 a 3500pb, ademas de un numero de bandas producidas que varian entre tres (obtenidas con el iniciador OPC-15) y diez (obtenidas con los iniciadores OPC-18 y OPC-20). La gran mayoria de las bandas son monomorficas a excepcion de una banda polimorfica de 800pb resultante de la amplificacion con el iniciador OPC-22 que se evidencia en el patron de bandeo de la planta 13 (Figura 2a).

[FIGURA 2 OMITIR]

RAPD de plantas regeneradas via organogenesis

La amplificacion del ADN de 15 plantas regeneradas via organo-genesis produjo un total de 869 bandas altamente reproducibles, con un intervalo de peso molecular de 300 a 3500pb, ademas de un numero de bandas producidas que varian entre tres (obtenidas con el iniciador OPC-15) y diez (obtenidas con los iniciadores OPC-18 y OPC-20; Tabla III). Nuevamente, la gran mayoria de los iniciadores produjeron bandas monomorficas, pero se observa un polimorfismo en la planta 3 con el iniciador OPC-23, que se pone en evidencia con la ausencia de la banda correspondiente a los 1400pb (Figura 2b).

Anatomia foliar comparada

La Tabla IV muestra los resultados de las mediciones realizadas de las caracteristicas anatomicas de hojas de plantas de name in vivo e in vitro, observandose que la planta madre presenta valores mayores para todas las caracteristicas evaluadas.

Las celulas de ambas superficies epidermicas de las plantas regeneradas in vitro tienen paredes mas sinuosas y son mas pequenas que las que presentan la planta madre (Figura 3c y d). Ademas de estas diferencias, se encontraron estomas en la superficie adaxial de las plantas regeneradas in vitro, lo cual no se encontro en ninguna de las preparaciones paradermicas adaxiales realizadas a partir de hojas de la planta madre. (Figura 3a).

Analisis estadistico

El analisis de componentes principales (ACP) para todas las caracteristicas estudiadas se muestra en la Figura 4, en donde cada 'nube' esta generada por la interaccion de las caracteristicas medidas para cada material vegetal (planta en condiciones de vivero, plantas regeneradas via organogenesis y plantas regeneradas por micropropagacion). Se observa que la 'nube' generada por la planta madre se separa de las otras dos 'nubes' generadas por las plantas cultivadas in vitro, mientras que estas dos ultimas se superponen. Esta disposicion de las 'nubes' analizadas junto con el ANOVA y la prueba de Duncan, indica que existen diferencias estadisticamente significativas entre la planta madre y las plantas regeneradas in vitro, mientras que entre las plantas regeneradas in vitro solo tres de las caracteristicas medidas presentan diferencias significativas (Tabla IV).

Discusion

Mediante el empleo de la tecnica RAPD para la estimacion de la variabilidad genetica de las plantas regeneradas por micropropagacion se encontro que de un total de 871 bandas, solamente una fue polimorfica, representando un 0,12% del total (Figura 2). Este resultado sugiere que el sistema de regeneracion de plantas de flame via micropropagacion establecido por Royero et al. (2007) podria usarse efectivamente para la multiplicacion in vitro de esta especie.

[FIGURA 3 OMITIR]

Con el uso del RAPD para la estimacion de la variabilidad genetica de las plantas regeneradas por organogenesis, se encontro una sola banda polimorfica de un total de 869 bandas obtenidas con los ocho iniciadores usados en las 15 plantas estudiadas, representando el 0,12% del total. Este bajo porcentaje de polimorfismo tambien valida el proceso de organogenesis establecido por Royero et al. (2007).

Debido a la similitud en los porcentajes de variabilidad genetica (polimorfismos) obtenidos en este trabajo para ambos sistemas de regeneracion in vitro, y tomando en cuenta que en el trabajo de Royero et al. (2007) se reporta que el sistema de regeneracion via organogenesis produce una mayor cantidad de brotes por explante que la micropropagacion (25,15 y 5,75 respectivamente), entonces se puede recomendar el uso de la organogenesis para la regeneracion in vitro de Dioscorea alata. Si bien este sistema tarda seis semanas mas que la micropropagacion (Royero et al. 2007), es mucho mas significativa la cantidad de vastagos que se producen en la organogenesis.

La tecnica del RAPD es muy popular y ampliamente utilizada con diferentes fines, entre los que destaca el estudio de la estabilidad genetica de plantas regeneradas in vitro, por lo que existen numerosos reportes de su utilizacion para tal fin. Los presentes resultados concuerdan con los presentados por Soniya et al. (2001), quienes detectaron un 95% de similitud entre 11 plantas de Lycopersicon esculentum (tomate) regeneradas in vitro y la planta madre excepto una (LS5) que fue significativamente diferente a la donante. En ese trabajo se emplearon diez iniciadores aleatorios, de los cuales seis arrojaron las bandas polimorficas. Igualmente, Prakash et al. (2004) observaron que aunque la mayoria de las plantas de Curcuma amada eran similares a la planta madre, el uso de diez iniciadores arbitrarios arrojo nueve bandas polimorficas de un total de 103 bandas. Kawiak y Lojkowska (2004) usaron 20 iniciadores aleatorios en 15 plantas regeneradas tanto de Drosera anglica como de D. binata, encontrando 0,08% de polimorfismo para la primera y 100% de monomorfismo para la segunda.

Mas recientemente Lal et al. (2008) amplificaron 110 fragmentos y no fue detectada variabilidad genetica en plantas micropropagadas de cana de azucar. Sarkar et al. (2010) utilizaron RAPD y demostraron estabilidad genetica en plantas micropropagadas de Jatropha curcas; al igual que Sharma et al. (2011) usando 21 primers arbitrarios y Leela et al. (2011) en plantas micropropagadas de esta misma especie. Resultados similares fueron reportados por Samantaray y Maiti (2010) en plantas de Chlorophytum borivilianum usando 33 primers arbitrarios; Peredo et al. (2009) demostraron que no habia variacion genetica en plantas micropropagadas de Humulus lupulus; Mallon et al. (2010) no encontraron alteraciones genomicas en plantas de Centaurea ultreiae propagadas in vitro; y resultados similares fueron encontrados por Ehsan et al. (2009) en plantas de naranja obtenidas por organogenesis.

En general, la comparacion de nuestros resultados con los reportados en la bibliografia reciente permiten: 1) confirmar el uso de la tecnica RAPD para la estimacion de la variabilidad genetica de plantas obtenidas a partir de sistemas de regeneracion in vitro; 2) asegurar que en numerosas especies vegetales la micropropagacion y la organogenesis pueden ser usadas como tecnicas de propagacion masiva, ya que la variabilidad genetica que presentan las plantas regeneradas por estos metodos es practicamente nula o nula, y 3) reconsiderar lo reportado por Yang et al., 1999, que postulan que de los sistemas de regeneracion in vitro, es la organogenesis el que induce mayor variabilidad genetica en las plantas regeneradas.

La descripcion de la anatomia foliar presentada en este trabajo para las plantas de flame in vivo e in vitro coincide con la reportada por Ayensu (1972) para Dioscorea alata, con pequenas diferencias como el tamano promedio de los estomas, siendo ligeramente mas pequenos los reportados en esta investigacion. Ademas, se observaron diferencias significativas entre la planta donante y las plantas in vitro en lo concerniente a los tamanos medidos para algunas de las caracteristicas estudiadas.

Existen diferencias significativas en la mayoria de las mediciones de las caracteristicas anatomicas evaluadas entre la planta crecida en condiciones de vivero y las plantas regeneradas in vitro, pero entre las plantas cultivadas via micropropagacion y via organogenesis estas diferencias no son significativas. La organizacion de los tejidos es exactamente igual, pero se observaron diferencias en el tamano de cada caracteristica medida, siendo siempre menores las medidas obtenidas en las hojas de las plantas regeneradas in vitro, a excepcion del grosor del parenquima esponjoso en las plantas regeneradas por organogenesis y del ancho de los estomas de las plantas regeneradas via micropropagacion, las cuales no mostraron diferencias significativas con respecto a la planta madre. Sin embargo, para el grosor de la lamina foliar y el largo de tricomas glandulares, se identifican tres grupos estadisticamente significativos, mientras que para la caracteristica largo de los estomas, a pesar de que se identifican dos grupos, la diferencia no es significativa (Tabla IV).

Las plantas regeneradas in vitro presentaron estomas en ambas caras de la lamina foliar, y las celulas epidermicas adaxiales y abaxiales mostraron paredes sinuosas en comparacion con la planta madre. El analisis de componentes principales (Figura 4) corrobora estos resultados, observandose solapamiento de las 'nubes' generadas al analizar los datos obtenidos de las plantas cultivadas in vitro, separadas de la 'nube' generada con los datos de la planta crecida in vivo.

Las diferencias en las dimensiones medidas, podrian explicarse con base en lo reportado por Pospisilova et al. (1999) y Zobayed et al. (2001), quienes sostienen que las condiciones ambientales bajo las cuales se desarrollan las plantas cultivadas in vitro afectan el desarrollo y caracteristicas de estas plantas. Aunque la bibliografia sobre este tema en particular no es muy abundante, los resultados obtenidos en el presente trabajo concuerdan con los reportados por Calvete et al. (2002), quienes encontraron que las hojas de las plantas regeneradas in vitro y ex vitro de Fragariaxananassa Duch. (Fresa) son menores y mas delgadas que las hojas de la planta in vivo, pero en cuanto a la organizacion de los tejidos, evaluada con cortes transversales de las hojas, esta fue igual para todas las plantas estudiadas. Barboza et al. (2006) reportan sinuosidad en las celulas epidermicas de las plantas de Ananas eomosus regeneradas in vitro, lo que atribuyen a condiciones ambientales pues son formas caracteristicas de plantas de ambientes humedos y de sombra, debido a que estas curvaturas de las celulas epidermicas aumentan la eficiencia de las hojas para la captacion de luz y la densidad del flujo luminoso al interior de la lamina foliar.

Si las diferencias observadas en estas plantas mantenidas in vitro responden a las condiciones ambientales del cultivo y, por lo tanto, revierten al fenotipo de la planta madre crecida in vivo cuando pasan por un proceso de aclimatacion, entonces se pone en evidencia la plasticidad fenotipica de la especie vegetal en estudio. En este sentido, Calvete et al. (2002) encontraron, en las plantas bajo condiciones ex vitro, caracteristicas intermedias entre las plantas bajo condiciones in vitro y la planta in vivo, demostrandose lo antes expuesto.

Las diferencias en las caracteristicas anatomicas de las plantas obtenidas in vitro en este estudio no comprometen la adaptacion de estas plantas a condiciones de vivero, ya que Royero et al. (2007) reportan un 70,7% de aclimatacion de plantas de name obtenidas por micropropagacion y organogenesis en su trabajo, y fueron estas mismas plantas las utilizadas para el presente estudio.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Stephen Tillet por la identificacion del material vegetal estudiado, a Nelson Ramirez, y Roschman Gonzalez por la correccion de este manuscrito, y al Consejo de Desarrollo Cientifico y Humanistico (CDCH) de la Universidad Central de Venezuela (UCV) por el financiamiento de este trabajo (proyecto PI-03.33-5447/04).

Recibido: 08/03/2012 Modificado: 29/05/2012. Aceptado: 31/05/2012.

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Erick Marin. Licenciado en Biologia, Universidad Central de Venezuela (UCV). Estudiante del Postgrado en Botanica, UCV, Venezuela. e-mail: ealbertomarin@yahoo.es

Teresa Edith Vargas. Doctora en Ciencias en Botanica, UCV. Asistente de Investigacion, Instituto de Biologia Experimental, UCV, Venezuela.

Maira Oropeza. Doctora en Ciencias, UCV. Profesora-Investigadora, UCV, Venezuela. Direccion: Laboratorio de Mejoramiento Vegetal, Centro de Botanica Tropical, Instituto de Biologia Experimental, Facultad de Ciencias, UCV. Apartado 47114, Caracas 1041, Venezuela, email: maira.oropeza@ciens.ucv.ve.
TABLA I

SECUENCIA DE LOS INICIADORES
ARBITRARIOS DE LA SERIE OPC
DE LA CASA OPERON

Iniciadores arbitrarios

OPC-15   5'-GAACGGACTC-3'
OPC-17   5'-TGTCATCCCC-3'
OPC-18   5'-CACACTCCAG-3'
OPC-19   5'-GTTGCCAGCC-3'
OPC-20   5'-GTGCCTAACC-3'
OPC-21   5'-TCACGTCCAC-3'
0PC-22   5'-CTCTCCGCCA-3'
0PC-23   5'-GGATGAGACC-3'

TABLA II
RESUMEN DEL PATRON DE BANDEO OBTENIDO PARA PLANTAS
REGENERADAS POR MICROPROPAGACION *

Iniciadores    Numero     Tallas (pb) de las bandas amplificadas
              De bandas

  OPC-15          3       900, 1200, 1300
  OPC-17          6       600, 700, 900, 1200, 1900, 3500
  OPC-18         10       400, 500, 700, 800, 1000, 1200,
                          1500, 2000, 2200, 3000
  OPC-19          8       700, 850, 1000, 1200, 1300, 1950, 2000, 3000
  OPC-20         10       600, 650, 1000, 1100, 1200, 1400, 1600,
                          1900, 2200, 2500
  OPC-21          7       900, 1100, 1300, 1900, 2000, 2100, 3500
  OPC-22        9 **      300, 600, 650, ** 800, 1000, 1200,
                          1300, 2000, 2300, 2900
  OPC-23          5       900, 950, 1400, 2500, 3000

* Se reporta el numero de bandas obtenido con cada iniciador y el peso
molecular de cada banda.

** Presencia de una banda polimorfica de 800pb en una de las muestras.

TABLA III
RESUMEN DEL PATRON DE BANDEO OBTENIDO PARA PLANTAS
REGENERADAS POR ORGANOGENESIS *

Iniciadores   Numero      Tallas (pb) de las bandas amplificadas
              de bandas

  OPC-15          3       900, 1200, 1300
  OPC-17          6       600, 700, 900, 1200, 1900, 3500
  OPC-18         10       400, 500, 700, 800, 1000, 1200,
                          1500, 2000, 2200, 3000
  OPC-19          8       700, 850, 1000, 1200, 1300,
                          1950, 2000, 3000
  OPC-20         10       600, 650, 1000, 1100, 1200, 1400,
                          1600, 1900, 2200, 2500
  OPC-21          7       900, 1100, 1300, 1900, 2000, 2100, 3500
  OPC-22          9       300, 600, 650, 1000, 1200,
                          1300, 2000, 2300, 2900
  OPC-23        5 **      900, 950, 1400, 2500, 3000

* Se reporta el numero de bandas obtenido con cada iniciador y el peso
molecular de cada banda.

** Ausencia de la banda de 1400pb para una muestra reflejando
polimorfismo.

TABLA IV
VALORES PROMEDIOS [+ o -] DESVIACIONES ESTANDAR DE LAS CARACTERISTICAS
ANATOMICAS DE LA HOJA DE PLANTAS DE Dioscorea alata, VALORES F Y P DEL
ANOVA

Variable                                       Planta madre
                                                 (in vivo)

Epidermis superior ([micron]m)             74,34 [+ o -] 11,65 a
Parenquima en empalizada ([micron]m)       49,96 [+ o -] 9,68 a
Parenquima esponjoso ([micron]m)           76,19 [+ o -] 13,55 a
Epidermis inferior ([micron]m)             26,42 [+ o -] 8,22 a
Grosor de la lamina                       226,71 [+ o -] 24,99 a
  foliar ([micron]m)
Densidad estomatica                     2,78 x [10.sup.-4] [+ o -]
  ([micron][m.sup.2])                      9,28 x [10.sup.-5] a
Tamano de estomas ([micron]m)           21,81[+ o -] 2,23 (ancho) a
                                       27,24 [+ o -] 3,13 (largo) a
Tamano de los tricomas                  48,54 [+ o -] 520 (ancho) a
glandulares ([micron]m)                 53,25 [+ o -] 528 (largo) a

Variable                                    Plantas obtenidas por
                                              micropropagacion

Epidermis superior ([micron]m)              26,76 [+ o -] 4,00 b
Parenquima en empalizada ([micron]m)        29,67 [+ o -] 15,89 b
Parenquima esponjoso ([micron]m)            58,42 [+ o -] 8,12 b
Epidermis inferior ([micron]m)              18,85 [+ o -] 3,49 b
Grosor de la lamina                        133,94 [+ o -] 25,00 c
  foliar ([micron]m)
Densidad estomatica                      1,53 x [10.sup.-4] [+ o -]
  ([micron][m.sup.2])                       4,96 x [10.sup.-5] b
Tamano de estomas ([micron]m)          20,83 [+ o -] 4,49 (ancho) a,b
                                         23,85 [+ o -] 6,29 (largo)
Tamano de los tricomas                  37,12 [+ o -] 5,52 (ancho) b
glandulares ([micron]m)                 43,17 [+ o -] 5,38 (largo) b

Variable                                   Plantas obtenidas por
                                               organogenesis

Epidermis superior ([micron]m)             23,86 [+ o -] 4,94 b
Parenquima en empalizada ([micron]m)       32,97 [+ o -] 4,20 b
Parenquima esponjoso ([micron]m)           72,19 [+ o -] 12,14 a
Epidermis inferior ([micron]m)             17,82 [+ o -] 2,81 b
Grosor de la lamina                        146,84 [+ o -] 3,32 b
  foliar ([micron]m)
Densidad estomatica                     1,77 x [10.sup.-4] [+ o -]
  ([micron][m.sup.2])                      6,95 x [10.sup.-5] 6
Tamano de estomas ([micron]m)          19,46 [+ o -] 3,30 (ancho) b
                                        22,12 [+ o -] 4,61(largo) b
Tamano de los tricomas                 37,17 [+ o -] 3,63 (ancho) b
glandulares ([micron]m)                39,63 [+ o -] 3,55 (largo) c

Variable                                   ANOVA

                                          F      p

Epidermis superior ([micron]m)         325,831   0
Parenquima en empalizada ([micron]m)   23,494    0
Parenquima esponjoso ([micron]m)       14,792    0
Epidermis inferior ([micron]m)         18,154    0
Grosor de la lamina                    130,475   0
  foliar ([micron]m)
Densidad estomatica                    19,683    0
  ([micron][m.sup.2])
Tamano de estomas ([micron]m)           7,406    1
                                        2,997    56
Tamano de los tricomas                 45,550    0
glandulares ([micron]m)                54,246    0

* Los valores promedio de cada fila seguidos por la misma letra no son
significativamente diferentes de acuerdo al la prueba de Duncan
([alfa]=0,05).

Figura 4. Analisis de componentes principales.

                  Axis 1   Axis 2   Axis 3   Axis 4   Axis 5

Eigenvalues        5.785    2.667    1.317    0.971    0.827
Percentage        44.503   20.514   10.132    7.469    6.360
Cum. Percentage   44.503   65.017   75.150   82.618   88.978
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Title Annotation:REPORTS/COMUNICACIONES/COMUNICACOES
Author:Marin, Erick; Vargas, Teresa Edith; Oropeza, Maira
Publication:Interciencia
Date:Jun 1, 2012
Words:5985
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